Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54002

⸱

13 mei 2016

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Aanhoudende fibrose met afzetting van overmatige extracellulaire matrix-eiwitten leidt tot cirrose. Alcoholmisbruik is een van de belangrijkste oorzaken van ernstige leverziekten. We hebben een ethanol-geïnduceerde zebravis model van een fibrotische lever opgezet om de mechanismen en strategieën van het bevorderen van hepatocytenregeneratie bij alcohol-geïnduceerde schade te bestuderen.

Samenvatting

Aanhoudende leverfibrose met voortzetting van de opbouw van extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten resulteert in het verlies van cellulaire competentie van de lever, wat leidt tot cirrose met hepatocellulaire disfunctie. Onder verschillende leverbeschadigingen kan alcoholmisbruik leiden tot ernstige gezondheidsproblemen, waaronder leverfalen en hepatocellulair carcinoom. Desalniettemin is de identiteit van endogene cellulaire bronnen die hepatocyten regenereren als reactie op alcohol niet goed onderzocht. Bovendien hebben weinig studies effectief hepatocytenregeneratie gemodelleerd na alcohol-geïnduceerde schade. We rapporteerden onlangs over het opzetten van een ethanol (EtOH)-geïnduceerde fibrotische levermodel in zebravissen waarin hepatische progenitorcellen (HPC's) hepatocyten aangaven bij bijna volledige hepatocytenverlies in aanwezigheid van een fibrogeen stimulus. Verder hebben we door middel van chemische screening met behulp van dit model meerdere kleine moleculen geïdentificeerd die hepatocytenregeneratie verbeteren. Hier beschrijven we in detail de procedures om een EtOH-geïnduceerde fibrotische levermodel te ontwikkelen en om chemische screening uit te voeren met behulp van dit model in zebravissen. Dit protocol zal een cruciaal hulpmiddel zijn om de moleculaire en cellulaire mechanismen van hoe hepatocyten regenereren in de fibrotische lever te bepalen. Bovendien zullen deze methoden de potentiële ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën voor chronische leverziekte in vivo vergemakkelijken.

Inleiding

Ondanks de opmerkelijke regeneratiecapaciteit van hepatocyten 1, waarin de belangrijkste parenchymale cel type de lever, chronisch leverfalen belemmert dit vermogen, wat leidt tot hepatische progenitor cellen (HPC) -afhankelijke regeneratie 2.

Chronische leverschade is voornamelijk afkomstig van alcoholmisbruik, chronische hepatitis C virus (HCV) 3 en niet-alcoholische fatty leverziekte (NAFLD) 4. Het leidt tot aanhoudende leverfibrose, die wordt geassocieerd met de accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) proteïnen. Aanhoudende ECM accumulatie vervalsen intact hepatische architectuur door vorming van een fibreus littekenweefsel 5 vervolgens resulteert in cirrose met hoge morbiditeit en mortaliteit. Vele pogingen zijn gedaan om de fibrotische respons voornamelijk te beperken door te focussen op profibrogene cytokinen remmen en geactiveerde myofibroblasten 6. Dit laatste is voornamelijk afkomstig van leverstellaatcellen (HSC's), het beginsel lever non-parenchymale cellen die verantwoordelijk zijn voor littekenvorming lever 4. Niettemin regeneratieve therapieën die endogene cellulaire bronnen zoals HPC hepatocyten in aanwezigheid van aanhoudende fibrogenen beledigingen regenereren stimuleren wachten verder onderzoek.

Vele experimentele modellen van leverfibrose beschreven in zoogdieren. Herhaalde injectie van koolstoftetrachloride (CCl4) wordt veel gebruikt om leverfibrose induceren in muis en ratmodellen 7. In combinatie met een hoog vetgehalte (HF) dieet, alcohol leidde tot een aanzienlijke opwaartse regulatie van genexpressie en profibrogene leverfibrose 8. Terwijl steatose (lipide-accumulatie) het gevolg is van acute blootstelling aan alcohol, het maakt de lever gevoelig voor een ernstigere leveraandoening 9.

De zebravis, Danio rerio, heeft ontpopt als een waardevolle gewervelde modelsysteem voor het bestuderen van de regeneratie. hoewelandere lagere gewervelde dieren zoals watersalamanders en axolotls een opmerkelijk vermogen tot regeneratie, de zebravis biedt voordelen boven andere modelsystemen met betrekking tot de genetische manipulatie en visualisatie strategieën worden vastgesteld om potentiële regeneratieve manipuleren factoren 10. De zebravis vertegenwoordigt ook een aantrekkelijk gewervelde model voor het bestuderen van alcoholische leverziekte (ALD) door simpelweg het toevoegen van ethanol (EtOH) om hun water. Acute EtOH blootstelling aan larven en volwassen zebravis veroorzaakt leversteatose 11-13. Bij volwassen zebravissen ontvangen langdurige blootstelling EtOH, werd collageen afzetting waargenomen met opregulatie van fibrose-gerelateerde genen 14. Er bestaat echter behoefte aan het ontwikkelen van modellen leverregeneratie studeren in reactie op EtOH als fibrogenen stimulus.

Onlangs ontwikkelden we een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in de zebravis 15. We combineerden een hepatocyt-specifieke genetische ablatie systeem EtOH behandeling larvale en adult zebravis. Genereerden we twee transgene lijnen, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 en Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, waarbij E. coli nitroreductase (NTR) respectievelijk gefuseerd aan de cyaan en mCherry fluorescerend eiwit, onder toezicht van de hepatocyt-specifieke vetzuurbindend eiwit 10a, lever basis (fabp10a) promoter. In dit systeem zet NTR een toxisch progeneesmiddel metronidazol (MTZ) in een DNA-streng inter-verknopingsmiddel 16 induceren expliciete dood van hepatocyten. Met dit model hebben we aangetoond dat een populatie van levercellen, die reageren op Notch signalering, omgezet in hepatocyten in de bijna afwezigheid van hepatocyten en de overmaat ECM. We wijzen deze cellen als HPCs. Bovendien, door middel van chemische schermen, identificeerden we kleine molecule activatoren van Wnt-signalering en remmers van Notch signalering die levercel regeneratie in de fibrotische lever te vergroten. Therefoopnieuw, onze fibrotische lever model in de zebravis staat voor een uitstekende chemische screening systeem in vergelijking tot cel cultuur- of zoogdieren based screening systeem. Het is een in vivo systeem met aanzienlijke kosten- en tijdbesparende voordelen. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures voor de oprichting van een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model en voor het uitvoeren van chemische schermen gebruik van dit model in de zebravis. Verder werden tijdsverloop analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe levercel regeneratie plaatsvindt in de fibrotische lever. Dit protocol zal een waardevol instrument om de mechanismen en strategieën van het verbeteren van levercel regeneratie in de fibrotische lever te bestuderen bieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Zebravis zijn gerezen en getogen behulp van een standaard protocol dat voldoet aan de criteria van de National Institutes of Health en door het Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. Voorbereiding van de Solutions

  1. Bereid 20 L ei water (door elkaar gebruikt met een 'embryo medium') naar embryonale / larvale zebravis te handhaven. Los op 1,5 g CaSO 4 en 6 g direct oceaan zeezout in 250 ml gedestilleerd water. Giet in een mandfles gevuld met 20 liter gedestilleerd water en schud.
  2. Bereid 1 L 1-fenyl-2-thioureum (PTU) voorraadoplossing (20x). Los op 0,6 g PTU poeder in 1 liter gedestilleerd water. Voeg 1 ml van de oplossing per 20 ml embryo medium tot een eindconcentratie van 0,003% is als werkoplossing.
    LET OP: PTU kan systemische toxiciteit na inhalatie of blootstelling van de huid veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren.
  3. Bereid 1 liter ethyl-3-aminobenzoate methaansulfonaat (tricaïne) stock-oplossing (20x). Ontbinden 4 g tricaïne poeder in gedestilleerd water. Breng de pH op 7 door toevoeging van 1 M Tris buffer (pH 9) en breng het uiteindelijke volume op 1 liter met gedestilleerd water. Aliquot in 50 ml en bewaar bij -20 ° C. Ontdooien voor gebruik.
    LET OP: tricaïne kan een verlies van gevoel veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren.
  4. Bereid 100 ml larvale metronidazol (MTZ) werkende oplossing. Voeg vers 15 mM MTZ oplossing door het oplossen van 0,25 g MTZ poeder in 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) in 100 ml embryo medium. Ontbinden MTZ poeder volledig door krachtig schudden. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van MTZ voorkomen.
    LET OP: MTZ kan irritatie veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren.
  5. Bereid 100 ml larvale ethanol / metronidazol (EtOH / MTZ) werkende oplossing. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische de voorkominggradatie van MTZ. Voeg 1,5 ml 100% ethanol in 100 ml MTZ oplossing tot een eindconcentratie van 1,5% juist voor gebruik.
  6. Bereid 500 ml volwassen MTZ werkende oplossing. Maak verse 10 mM MTZ-oplossing door het oplossen van 0,83 g MTZ poeder in 0,1% DMSO in 500 ml water systeem. Ontbinden MTZ poeder volledig door krachtig schudden. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van MTZ voorkomen.
  7. Bereid 1 L PEM buffer. Los op 30,2 g PIPES, 0,74 g EGTA en 0,12 g MgSO4 in gedestilleerd water. Stel de pH tot 7 met NaOH. Breng uiteindelijke volume tot 1 L met gedestilleerd water.

2. Voorbereiding van de larvale zebravis

  1. Opzetten paring van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] 15,17 volwassen zebravissen met Tg (hand2: EGFP) PD24 13 volwassen zebravissen in paring tanks. Gebruik verdelers om getimede paring te voeren.
  2. Verwijder de divider de volgende ochtend en laat de vis om te paren zonder onderbreking. Harvest embryo 2 uur later gevolgd door het uitpersen van het systeem water en het overdragen van de embryo's in 100 mm Petri gerechten met embryo medium.
  3. Houd niet meer dan 100 embryo's per petrischaal. Onder een stereomicroscoop, verwijder onbevruchte eieren met een glazen pipet. Embryo groeien bij 28 ° C en voeg fenylthioureum (PTU) tot een eindconcentratie van 0,003% na 10 uur post-bevruchting (HPF) pigment ontwikkeling remmen.

3. Ethanol, Metronidazole Behandeling en leverregeneratie in larvale zebravis

  1. Bereid deze EtOH door toevoeging van ethanol in embryo medium tot een eindconcentratie van 1,5%. Do PTU niet toe te voegen.
  2. Behandel embryo's met 20 ml ethanol-oplossing per petrischaal 56-80 HPF. Bedek Petri gerechten met plastic folie om ethanol verdamping te voorkomen.
  3. Uitzoeken [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] larven met gelijke afmetingen lever, zoals bepaald door CFP expressie bij 80 HPF. Do tricaïne niet gebruiken bij het sorteren van de-EtOH behandelde larven omdat deze hoog sterftecijfer met daaropvolgende behandeling EtOH / MTZ zal veroorzaken. Houd gesorteerde larven bij een dichtheid van 30 embryo's per petrischaal.
  4. Bereid verse 15 mM MTZ in embryo medium in 0,1% DMSO. Voeg juiste hoeveelheid EtOH in MTZ oplossing tot een eindconcentratie van 1,5% te maken. Incubeer larven in 20 ml EtOH / MTZ oplossing per petrischaal gedurende 24 uur bij 28 ° C. Bedek Petri gerechten met plastic folie om EtOH concentratie en met aluminium folie ter bescherming tegen het licht te houden.
  5. Na afloop van de behandeling, verwijder EtOH / MTZ oplossing overdracht larven nieuwe Petrischalen met verse embryo medium. Was larven 3 maal met embryo medium en bewaar ze in 20 ml embryo medium zonder PTU.
  6. Te sorteren op de larven met een bijna volledige ablatie van levercellen, observeren fluorescentieonder een epifluorescentiemicroscoop van de GVB-filter bij een vergroting van 80x. Succesvolle ablatie resultaten in minimaal GVB fluorescentie in de lever en significant verminderd volume lever.
  7. Tot de dood van de EtOH / MTZ-behandelde larven te voorkomen, geen gebruik maken van tricaïne voor het sorteren. Bevestig de larven voor immunokleuring (zie paragraaf 5) of houdt gesorteerde larven in petrischaaltjes bij 28 ° C voor verdere analyse.

4. Chemische schermen in EtOH / MTZ-behandelde Larvale zebravis

  1. Breng de 96-well platen met 10 mM voorraden in DMSO chemische (zie Materialen List voor details over de commerciële chemische bibliotheken) van de -80 ° C vriezer. Dek af met aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van chemicaliën te voorkomen. Ontdooi de voorraad oplossingen bij RT met zachte wiegen.
  2. Bereid chemische oplossingen door verdunning van 10 mM voorraadoplossingen met embryo medium tot een eindconcentratie van 50 uM (in 96 putjesplaten: aanvankelijk screen; in 1,5 ml buizen: herkeuring). Controle larven werden behandeld met gelijke concentraties van DMSO in embryo medium.
  3. Transfer larven vrijwel volledige hepatocyte ablatie, die werden behandeld met 1,5% EtOH / 15 mM MTZ en gesorteerd zoals voornoemd, ofwel 96 putjes (beginscherm) of 24 putjes (nacontrole) platen voorgevuld met embryo medium bij een dichtheid van 5 larven per putje. Gebruik duplo voor elke chemische stof.
  4. Verwijderen embryo medium en voeg ofwel 250 ul (96 putjes) of 500 pl (24 putjes) chemische oplossingen voor elk putje. Afdekplaten met aluminiumfolie en behandelen larven gedurende 50 uur bij 28 ° C. Inspecteer-chemische weken larven dagelijks en verwijder alle dode larven van afzonderlijke putjes.
  5. Aan het einde van de chemische behandeling, acht het aantal en / of de intensiteit van GFP-expressie hepatocyten onder een epifluorescentiemicroscoop de GVB filter bij een vergroting van 80X. Foto van levende larven tonen versterkt of te verminderend nummer en / of de intensiteit van CFP-expressie hepatocyten met een digitale camera voor records.
  6. Preserve larven door formaldehyde fixatie voor confocale beeldvorming zoals beschreven in hoofdstuk 5.
  7. Om de chemische stoffen die levercel regeneratie in het beginscherm te vergemakkelijken opnieuw te testen, onderzoeken hun potentie bij hogere en lagere concentraties van de meest doeltreffende concentratie met de in 4,1-4,5 ( 'herkeuring') beschreven procedures te vinden.

5. larvale zebravis Fixation, Immunokleuring en Confocale Imaging

  1. Verdoven larven door toevoeging tricaïne een eindconcentratie van 0,02%. Transfer 10-15 larven naar een 1,5 ml buis en eenmaal wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder PBS en voeg 1 ml vers bereide 2% formaldehyde in PEM buffer O / N vast te stellen op 4 ° C.
    LET OP: Formaldehyde veroorzaakt irritatie en staat bekend als een menselijk carcinogeen zijn. Hanteer in een zuurkast.
  2. Gooi de vaststelling oplossing naar behoren en vervolgens wash 3 maal met PBS bij kamertemperatuur. Vaste larven in PBS bewaard bij 4 ° C tot enkele dagen. Overgegaan tot de volgende stap geeft onmiddellijk betere immunokleuring resultaten.
  3. verwijderen dooier en huid die de lever gebied met behulp van een # 55 pincet onder een stereomicroscoop zorgvuldig.
  4. Doorlaatbaar en blok larven Block buffer (4% runderserumalbumine en 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N bij 4 ° C.
  5. Incubeer met konijn anti-collageen I antilichaam bij een verdunning van 1: 100 in blok buffer O / N bij 4 ° C. 5 keer wassen gedurende 15 min elk met wasbuffer (0,3% Triton X-100 in PBS).
  6. Incubate met AlexaFluor 647 geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam bij een verdunning van 1: 200 in Block buffer O / N bij 4 ° C. 5 keer wassen gedurende 15 min elk met wasbuffer. Was daarna eenmaal met PBS.
  7. Voorzichtig overdracht larven glasplaatjes met behulp van een glazen pipet, en oriënteren vaste larven met de linker zijkant naar boven. Verwijder overtollige PBS met behulp van Kimwipes. Voeg een druppel van de montage mediaEn seal deksel glas met nagellak. Het uitvoeren van confocale imaging onmiddellijk wordt sterk aanbevolen.
  8. Gebruik een confocale systeem uitgerust met een 40x / 1,3 olie lens om beelden vast te leggen. Met laser sterkte bij 20-50%. Leg Z stapel afbeeldingen 1 um intervallen.

6. Voorbereiding van de Adult zebravis

  1. Opzetten paring van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] 15,17 volwassen zebravissen in paring tanks. Harvest embryo's de volgende ochtend door overbelasting systeem water en het overdragen van de embryo's in 100 mm Petri gerechten met embryo medium.
  2. Houd niet meer dan 100 embryo's per petrischaal. Onder een stereomicroscoop, verwijder onbevruchte eieren met een glazen pipet. Embryo groeien bij 28 ° C en een uiteindelijke concentratie van 0,003% PTU voeg na 10 HPF pigment ontwikkeling remmen.
  3. Op 4 DPF, gebruiken tricaïne om larven verdoven en uitzoeken [Tg (fabp10a: GVB-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] larven. Spoel tricaïne door het veranderen van de frisse meerdere malen embryo medium. Laat larven te herstellen bij 28 ° C tot ze bereiken normale hartslag van 120-180 slagen per minuut 18.
  4. Verhogen gesorteerde larven 6-12 maanden oud op basis van de standaardprocedure 19.

7. Ethanol, Metronidazole Behandeling en leverregeneratie in Adult zebravis

  1. Transfer 6-12 maanden oud [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] volwassen zebravissen paring tanks met behulp van een net. Houd vis bij een dichtheid van niet meer dan 10 vissen per tank.
  2. Bereid deze EtOH door toevoeging van EtOH in systeemwater tot een eindconcentratie van 1%. Behandel volwassen vissen met 500 ml EtOH oplossing in elke tank en te onderhouden in een 28 ° C incubator.
  3. Transfer volwassen vissen in de frisse EtOH oplossing dagelijks, verwerp dode vissen propErly als biologisch. Continu behandelen dieren voor 72 uur voor MTZ behandeling.
  4. Bereid verse 10 mM MTZ-oplossing in het systeem water in 0,1% DMSO. Pre-warm de MTZ oplossing in een 28 ° C incubator. Behandel vissen met 500 ml MTZ oplossing 1 L kruising tank voor 8 uur bij 28 ° C, beschermd tegen licht gebruik aluminiumfolie.
  5. Let op elk uur tijdens de behandeling en onmiddellijk te verwijderen dode vissen. Gooi dode vissen behoren als een biologisch gevaarlijk. Aan het eind van de behandeling MTZ, wassen MTZ door de overdracht van de dieren in de frisse systeem water tweemaal.
  6. Laat de dieren om te herstellen en te onderhouden in een incubator bij 28 ° C. Voeden en over te dragen vis vers systeem water dagelijks tot het tijdstip voor de analyses.

8. Adult zebravis lever Fixation, Immunokleuring en Confocale Imaging

  1. Verdoven volwassen vissen met 0,02% tricaïne en euthanaseren in ijs water gedurende 15 min. Dep de vis droog op een papieren handdoek en leg het op een dissectie mat.
  2. Expose gastro-intestinale organen door het verwijderen van de huid en spieren zoals eerder beschreven 20. Knip met een schaar de huid en de onderliggende spier vanaf de buik gesneden uit de anale vin de operculum, en posterieur langs de kant van de vis naar de anaalvin.
  3. Leg de vis in een 15 ml conische buis en eenmaal wassen met PBS. Verwijderen PBS en voeg 4 ml vers bereide 2% formaldehyde in PEM buffer O / N lossen bij 4 ° C.
  4. Gooi fixeeroplossing gewoon, en was 3 maal met PBS bij kamertemperatuur. Vaste monsters in PBS gedurende meerdere dagen worden bewaard bij 4 ° C. Overgegaan tot de volgende stap geeft onmiddellijk betere immunokleuring resultaten.
  5. Ontleden de gehele darm met lever van de lichaamsholte van de vis door het snijden van de slokdarm. Integreer de gastro-intestinale organen met 4% laagsmeltende agarose in een mal snijden.
  6. Gebruik een vibratome monsters gesneden dwarsprofielen op 50 um intervallen in ijskoud PBS, uitgaande van het voorste uiteinde. Transfer secgen tot 6-well plaat met PBS met behulp van een # 1 kwast.
  7. Doorlaatbaar en blokdelen in Block buffer O / N bij 4 ° C.
  8. Incubeer met konijn anti-collageen I antilichaam bij een verdunning van 1: 100 in blok buffer O / N bij 4 ° C. Was 5 keer, 15 minuten elk met wasbuffer.
  9. Incubate met AlexaFluor 647 geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam bij een verdunning van 1: 200 in Block buffer O / N bij 4 ° C. Was 5 keer, 15 minuten elk met wasbuffer en eenmaal met PBS.
  10. Voorzichtig dragen secties om glasplaatjes met behulp van een # 1 kwast. Verwijder overtollige PBS met behulp van Kimwipes, voeg een druppel van de montage media en seal deksel glas met nagellak. Het uitvoeren van confocale imaging onmiddellijk wordt sterk aanbevolen.
  11. Gebruik een confocale systeem uitgerust met een 40x / 1,3 olie lens om beelden vast te leggen. Met laser sterkte bij 20-50%. Leg Z stapel afbeeldingen 1 um intervallen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont de ontwikkeling van een EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in larvale zebravis. Om een ​​protocol voor het blootstellen van de zebravis larven EtOH optimaliseren we eerst beoordeeld EtOH toxiciteit. 2,5 dagen post-bevruchting (DPF) larven werden blootgesteld aan EtOH concentratie 1%, 1,5% of 2% gedurende 24 uur, gevolgd door een gelijktijdige 24 uur EtOH / MTZ behandeling. Blootstelling aan 2% EtOH veroorzaakt hoge sterfte, terwijl bijna alle larven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We observed HPC gemedieerde hepatocyte regeneratie in EtOH / MTZ behandelde levers herstellen, wat suggereert dat zelfs in aanwezigheid van aanzienlijke hoeveelheid ECM eiwitten waaronder fibrillair type I collageen, het HPC's behouden hun vermogen tot regenereren zoals hepatocyten. Het enige MTZ-behandeling niet significant toenemen afzetting van ECM eiwitten, terwijl de EtOH enige behandeling niet HPC activering 15 hoefden te induceren. Door toepassing van de gecombineerde behandeling EtOH / MTZ, konden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de GTEC (2731336 en 1411318), de NIH (K01DK081351), en de NSF (1.354.837) naar CHS Wij danken Alem Giorgis voor kritische lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)AcrosAC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4)EMDMX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EthanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Metronidazole (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)Sigma-AldrichA5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tabletAmrescoE404Los één tablet op met 100 ml gedistilleerd water
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Bovine serum albuminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Low-melting agarose AmrescoBP165
Stem Cell Signaling Compound LibrarySelleck ChemicalsL210010 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K LibraryTimtecActiProbe-1K10 mM stock in DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Oplossen met DMSO tot 10 mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Oplossen met DMSO tot 10 mM
Anti-Collagen I antibodyAbcamab23730Gebruik op 1:100 voor immunokleuring, reageert met vis
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)Molecular ProbesA31573Gebruik op 1:200 voor immunokleuring
Mounting media (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm Petri dishVWR25384-088
24-well plateVWR10062-896
ForcepsFine Science Tools11255-20Dumont #55
Glass slideVWR48312-00375x25 mm
Cover glassVWR48366-04518 mm
Plastic wrapFisher Scientific22305654
Aluminum foilFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomeLeicaVT1000 S
Stereo microscopeLeicaM80
Epifluoresence microscopeLeicaM205 FA
Confocol microscopeZeissLSM700

Referenties

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137(2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Regeneratie van hepatocyten bij zebravishepatische progenitorcellenchemisch screeningsprotocoldepositie van type 1 collageenepifluorescentiemicroscopieconfocale beeldanalysevetzuurbindend eiwitMTZ behandelingsprotocolzebravislevermodel
Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.