Methodenartikel

Voorbereiding en analyse van In Vitro Three Dimensional mammacarcinoom Surrogates

DOI:

10.3791/54004

⸱

9 mei 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We demonstreren een methode om 3D-surrogaten voor borstkanker te genereren, die kunnen worden gekweekt met behulp van een perfusiebioreactorsysteem om zuurstof en voedingsstoffen af te geven. Na de groei worden surrogaten gefixeerd en verwerkt tot paraffine voor evaluatie van parameters van belang. De evaluatie van één van deze parameters, celdichtheid, wordt uitgelegd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) cultuur is een meer fysiologisch relevante manier naar cel gedrag te modelleren in vitro dan tweedimensionale cultuur. Carcinomen waaronder borst- carcinomen, zijn complexe 3D weefsels samengesteld kanker epitheelcellen en stromale componenten, waaronder fibroblasten en extracellulaire matrix (ECM). Maar de meeste in vitro modellen van borstcarcinoom uitsluitend bestaan ​​kanker epitheelcellen, weglaten van het stroma en derhalve de 3D ​​architectuur van een tumor in vivo. Geschikte 3D modelleren van carcinoom is belangrijk voor het juist begrip van de tumor biologie, gedrag, en de respons op de behandeling. Echter, wanneer de duur van de cultuur en het volume van 3D-modellen beperkt door de beschikbaarheid van zuurstof en voedingsstoffen in de cultuur. Hierin tonen we een werkwijze waarin borstcarcinoom epitheliale cellen en stromale fibroblasten worden geïncorporeerd in ECM een 3D borstkanker surrogaat dat stroma bevat en kan worden gekweekt als genererenvaste 3D-structuur of door een perfusie bioreactorsysteem om zuurstof en voedingsstoffen leveren. Na installatie en een eerste groeiperiode, kan surrogaten worden gebruikt voor geneesmiddelen in preklinische testen. Als alternatief kan de cellulaire en matrixcomponenten van het surrogaat worden gemodificeerd om een ​​verscheidenheid van biologische vragen te beantwoorden. Na het kweken, worden surrogaten gefixeerd en verwerkt voor paraffine, op een wijze vergelijkbaar met de behandeling van borstcarcinoom klinische monsters voor evaluatie van parameters plaats. De evaluatie van een dergelijke parameter, de dichtheid van de cellen aanwezig is uiteengezet, waarbij ImageJ en CellProfiler beeldanalyse software kunnen worden toegepast op microfoto van histologische secties van alternatieve methoden om het aantal kernhoudende cellen per gebied kwantificeren. Dit kan worden gebruikt als een indicator van de verandering van het aantal cellen in de tijd of de verandering in celaantal gevolg van wisselende groeiomstandigheden en behandelingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) cultuurmodellen die nauwkeuriger na te bootsen de tumor micro-architectuur en in vivo in studies gericht op de complexe interacties tussen cellen en hun micro ontleden en werkzaamheid van kandidaat therapieën testen. Tumor dimensionaliteit effecten van zuurstof en voedingsstoffen gradiënten, de uniformiteit van de blootstelling aan het geneesmiddel, interstitiële druk / doorbloeding, en 3D-architectuur 1-4. De aanwezigheid van een geschikte stromale tumor micro bijdraagt ​​aan dimensionaliteit en invloeden cel-ECM signalering en paracrienen tussen bindweefselcellen en kwaadaardige epitheelcellen. De effecten van de tumor dimensionaliteit en het micromilieu op de cellulaire functie zijn goed ingeburgerd, met beide factoren veranderen drug reactie 1,3,5-8. Bovendien, cellulaire groei kinetiek, stofwisseling en cell signaling verschillen tussen tweedimensionale (2D) cultuur en cultuur in 3D, met deze factoren affecting cellulaire respons 1,3,8-10.

In vitro, kan de tumor surrogaat micro gemoduleerd worden door het opnemen van representatieve ECM bestanddelen en stromale cellen populaties. Kwaadaardige epitheelcellen worden beïnvloed door de ECM en kankergeassocieerde stromale cellen hetzij in een synergistisch / beschermende wijze tumorprogressie bevorderen of op een onderdrukkende wijze verdere vermeerdering 5,6,10 tumor remmen. In beide context, kan de stroma en therapeutische respons geneesmiddelafgifte via paracrienen en / of door het verhogen interstitiële druk in de tumor resulteert in verminderde geneesmiddelafgifte 1,6 beïnvloeden. Daarom zal de toevoeging van ECM en stromale cellen in preklinische modellen te recapituleren aspecten van de tumor die niet goed kunnen worden gemodelleerd in 2D cultuur.

Hierin wordt een methode om borstkanker surrogaten dat een samenvattend micro-omgeving op te nemen, met inbegrip van ECM bestanddelen en s vast te stellentromal cellen, in een 3D volume wordt beschreven. In borstcarcinoom, wordt de stromale celpopulatie voornamelijk bestaat uit kanker geassocieerde fibroblasten (CAF) en de stromale ECM bestaat voornamelijk uit collageen type I met een kleinere hoeveelheid matrix onderdeel dat in het basale membraan, waaronder laminine en collageen type IV 1,4,11-13. Daarom zijn deze onderdelen van het micro borstcarcinoom (bijv CAF, collageen I en basaalmembraan) zijn opgenomen in de surrogaten. Deze methode kan worden gebruikt om vaste, niet-geperfundeerde 3D ​​surrogaten (Figuur 1A) genereren of kunnen worden aangepast aan perfusie drager omvatten via surrogaat via een bioreactorsysteem (Figuur 1B). Beide benaderingen zijn beschreven. Deze werkwijze kan ook worden aangepast om andere stromale elementen, zoals tumor-geassocieerde macrofagen omvatten, of andere vaste tumoren modelleren door instellen van de cellulaire en ECM componenten, indien nodig.

Voor de borstcarcinoom surrogaat beschreven, hebben we gebruik gemaakt van de MDA-MB-231 (231) borstkanker cellijn, CAF eerder geïsoleerd uit humane borstcarcinoom 14 en een ECM samengesteld uit 90% collageen I ( 6 mg / ml) en 10% groeifactor verlaagd basaal membraan materiaal (BM). De draagmoeder is ofwel gekweekt in een 8-well kamer slide (vast surrogaat) of een bioreactor systeem wordt gebruikt om continue perfusie van voedingsstoffen (doorbloed surrogaat) te verstrekken. Elke perfusie bioreactorsysteem die geschikt een volume van ECM bevattende cellen kunnen worden gebruikt 15. Als voorbeeld beschrijven we de bereiding van het weefsel surrogaten in ons bioreactorsysteem. Dit systeem is in eigen huis ontwikkeld en is niet in de handel verkrijgbaar. Omdat onze focus ligt hierbij op de voorbereiding en de analyse van de 3D-weefsel surrogaten, hebben we niet gegaan in uitgebreide details met betrekking tot de specifieke kenmerken van de fabricage en assemblage van onze bioreactor systeem. Echter, een gedetailleerde beschrijving vanDit systeem en de ontwikkeling ervan is gepubliceerd 16. In het bioreactorsysteem, wordt een polydimethylsiloxaan (PDMS) stromingskanaal gebruikt om het surrogaat, die wordt ondersteund door een PDMS schuim huis (gevormd onder toepassing van werkwijzen vergelijkbaar met die beschreven door Calcagnile et al. 17). Deze hoeveelheid wordt gepenetreerd door 4 microkanalen (elk 400 urn diameter) die continu door medium perfusie via een microphysiologic pomp zuurstof en nutriënten naar de draagmoeder.

Passende analyse van de surrogaten cruciaal om relevante informatie te verkrijgen over cellulaire functie in respons op behandeling of andere manipulaties. Surrogaten kunnen worden geanalyseerd op verschillende manieren inclusief directe beeldvorming van intacte surrogaten via confocale microscopie of ander niet-invasieve beeldvorming, indirect cellulaire analyse door het bepalen van de geconditioneerde media of perfusaat voor uitgescheiden producten of analyse van histologische secties na fixatie en verwerking naarparaffine. Een dergelijke parameter die kan worden beoordeeld op histologische secties celdichtheid. Wij presenteren een benadering celdichtheid te meten (dat wil zeggen, het aantal kernhoudende cellen per groep gebied) door middel van semi-automatische beeldverwerking toegepast voor microfoto surrogaat histologische secties gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E). De celdichtheid kan worden gebruikt als een indicator van de relatieve verandering van het aantal cellen in de tijd of als gevolg van wisselende groeiomstandigheden en behandelingen.

figure-introduction-1
Figuur 1. 3D volume en bioreactorsysteem. A) Schema van de werkwijze om vaste 3D surrogaten genereren. Top: cartoon van vaste 3D-volume met ECM (roze), epitheliale carcinoma cellen (geel), en CAF (oranje); Bottom:. Bovenaanzicht van 8-well kamer dia met surrogaten B) Schematische voorstelling van het proces voor het genereren van 3D-doorbloed surrogaten. Top: cartoon van 3D-volume met kanalen mogelijk te maken voor middelgrote perfusie en met ECM (roze), epitheliale carcinoma cellen (geel), en CAF (oranje); Midden: beeld van PDMS stroom kanaal met PDMS schuim (zwarte pijl) te injecteren met een mobiele + ECM en gepenetreerd door roestvrij staaldraad-polymeer beklede (roze pijl) van 400 micrometer in doorsnede; Onder:. Beeld van de PDMS stromingskanaal met een surrogaat en verbonden met het bioreactorsysteem om continue perfusie medium (peristaltische pomp en media reservoir niet getoond) C) Foto's van verwerkingsstappen voor zowel vaste als geperfundeerd surrogaten na het kweken. Links: beeld van de cryomold met specimen verwerking gel en surrogaat; Midden: beeld van een paraffine blok met een vast en verwerkt surrogaat; Rechts:. Beeld van een glasplaatje met een H & E-gekleurde histologische doorsnede van een surrogaat Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultuur van de Cel

  1. Ontdooi BM component overnacht bij 4 ° C, op ijs.
  2. Warme medium tot 37 ° C. Groei van zowel 231 cellen en CAF ondersteunt, gebruikt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) plus 10% foetaal runderserum (FBS).
    Opmerking: Het gebruikte medium zal afhangen van het celtype en de experimentele doelen.
  3. Verwijder medium uit de cultuur schotel (10 cm) in de buurt van confluente 231 cellen en voeg 1,5 ml trypsine / EDTA. Incubeer gedurende 1-3 min bij 37 ° C, controleren op cel losraken. Zodra cellen beginnen te ronden en te komen van de plaat, stop de reactie door het toevoegen van 3 ml van het medium dat serum. Pipet het medium en cellen in een 15 ml conische buis.
  4. Centrifugeer het medium en cellen bij 150 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml medium.
  5. Tel het aantal cellen per volume met trypan blauw en een hemocytometer. Cellevensvatbaarheid moet groter zijn dan 90% bedragen.
  6. HerhaalWerkwijze met andere celtypen worden opgenomen in het surrogaat. Voor de hier beschreven surrogaat, wordt het proces herhaald met het CAF.
  7. De geschikte volume van elke celsuspensie het gewenste aantal cellen te verkrijgen.
    Opmerking: Bij de hier beschreven surrogaat, een celdichtheid van 2,1 x 10 6 cellen per 100 pl ECM, met een 2: 1 verhouding van epitheelcellen fibroblasten (1,4 x 10 6 231 cellen en 7 x 10 5 CAF per 100 gl ECM) wordt gebruikt. Deze cel dichtheid is een goed uitgangspunt; Toch zal de optimale celdichtheid afhankelijk van het celtype, de duur van de cultuur en de doelstellingen van het experiment.
  8. Plaats het geschikte volume van elke celsuspensie in een 15 ml conische buis (één buis per celtype). Centrifugeer het medium en cellen bij 150 xg gedurende 5 minuten.
  9. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant, opnieuw te schorten één type cel in celcultuur kwaliteit water (178,8 pl, zie tabel 1) en de andere celtype 10x DMEM (100 pl, zie Tabel 1, met fenolrood pH controleren). Plaats de buizen die de cellen op ijs en gaat snel bereiding van ECM hieronder. Tijdslimiet de cellen blijven in water levensvatbaarheid behouden.
    Opmerking: Zowel 10x DMEM en celkweekniveau water nodig bestanddelen van de ECM; Daarom hebben wij ervoor gekozen om opnieuw te schorten cellen in beide. Hier hebben we willekeurig gekozen om opnieuw te schorten de 231 cellen in celkweek kwaliteit water en CAF in 10x DMEM, hoewel beide typen cellen kunnen opnieuw worden gesuspendeerd in een van deze twee componenten.

2. Bereiding van cellen in ECM (6 mg / ml collageen Type I + 10% BM)

Opmerking: Een ECM uit 90% collageen I + 10% BM werd gekozen om invasief borstcarcinoom model omdat de tumor stroma in deze maligniteit bestaat voornamelijk uit collageenI met componenten van de BM, zoals laminine, collageen IV, en entactine, omvattende een kleiner deel van de ECM 12,13,18,19.

  1. Op ijs, componenten in Tabel 1 opgesomde voegen, teneinde, in een 2 ml microcentrifugebuis.
    Let op: dit bedrag is genoeg voor 8 vaste surrogaten of met behulp van de bioreactor systeem hier beschreven 4 doorbloed surrogaten.
Bereiding van cellen in ECM
(6 mg / ml collageen Type I + 10% BM)
178,8 μl Celkweekniveau water met daarin het gewenste aantal van 231 cellen (hierboven bepaald)
606 pl Collageen I (10 mg / ml runder), voeg druppelsgewijs
100 gl Basaal membraan, ontdooid
100 gl 10x DMEM (met fenol rood) met het gewenste aantal CAF (hierboven bepaald)
15.2 pl 7,5% (v / v) natriumbicarbonaat, voeg druppelsgewijs

Tabel 1. Bereiding van cellen in ECM.

  1. Meng door pipetteren, het vermijden van de vorming van zeepbellen. Bewaken van de pH-niveau met behulp van de fenol rood in de 10x DMEM. Controleer of het mengsel is een oranje / roze kleur wijst op een pH van ~ 7. Als de pH te laag (te geel), voeg langzaam additionele 7,5% natriumbicarbonaat één druppel per keer (~ 5 ul) dat de gewenste kleur wordt bereikt.
    1. Houd het mengsel op ijs en werken snel om voortijdige ECM polymerisatie te voorkomen.

3. Surrogate Voorbereiding

  1. Voor vaste 3D culturen (Figuur 1A):
    1. Werken in een celkweek kap met behulp van steriele techniek, het etiket van het deksel van een steriele kamer 8 putjes slide elke experimentele variatie in surrogaten geven.
    2. Houden van de kamer schuif op ijs vroegtijdige ECM polymerisatie langzaam pipet 100 ul van de cellen + ECM mengsel in elk putje van de 8-well kamer dia.
      Opmerking: Pipetting de cel + ECM mengsel rond de randen van de eerste en helpt de cel + ECM mengsel beter verdelen in de put.
    3. Incubeer surrogaten bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 45 min ECM polymerisatie mogelijk.
    4. Na ECM polymerisatie, voeg 100 ul kweekmedia aan elk putje en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende de duur van het experiment,veranderende cultuur medium om de twee dagen.
  2. Voor geperfuseerd 3D culturen in een bioreactorsysteem (Figuur 1B):
    1. Steriliseren alle bioreactor componenten voor 3D kweek opstart (dwz bioreactor, slangen, forceps, en hulpstukken noodzakelijk bioreactor setup) met de werkwijze specifiek voor de bioreactor te gebruiken.
      1. In het voorbeeld bioreactorsysteem hier gebruikt, een combinatie van een autoclaaf (bijvoorbeeld 12 min blootstelling bij 121,1 ° C met 15 min drogen) en het incuberen in 70% ethanol gedurende 1 uur.
    2. Bereiden en het gedeelte van het bioreactorsysteem dat de draagmoeder zal huisvesten monteren.
      1. In het voorbeeld bioreactorsysteem hier wordt gebruikt, plaatst u een PDMS schuim ruggengraat in het PDMS stromingskanaal buis behulp van een tang. Druk vier (400 pm)-polymeer beklede roestvrij staaldraad in de PDMS schuim om parallelle microkanalen te genereren.
    3. In een celkweek kap, met behulp van sterile techniek en een 26 gauge naald met spuit, injecteren de cel + ECM mengsel in het gebied van de perfusie bioreactor ontworpen om cellen te bevatten. Gaat snel naar de volgende stap.
    4. Te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van cellen in de surrogaten, plaats de bioreactor component behuizing van de surrogaten in een 50 ml conische buis (onder celcultuur kap) en continu roteren bij ~ 18 rpm gedurende incubatie bij 37 ° C gedurende 45 minuten om ECM toestaan polymerisatie.
      Opmerking: Rotatie kan worden afgewikkeld via een rotator in de incubator of een oven met een ingebouwde rotator, zoals een hybridisatie oven ingesteld op 37 ° C.
    5. Sluit de bioreactor samenstel met de surrogaat op de perfusiepomp middels instructies van de fabrikant.
      Opmerking: De details van dit proces is afhankelijk van de bioreactor en pomp worden gebruikt.
      1. In het voorbeeld bioreactorsysteem hier wordt gebruikt, verwijdert u de roestvrij staaldraad voorafgaand aan het aansluiten van de bioreactor montage aan de pomp.
    6. Start medium perfusie (bulk stroomsnelheid van 167,1 pl / min; microkanaal afschuifspanning van 1 dyne / cm2) in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
      Het tarief drager perfusie kan worden aangepast, afhankelijk van de bioreactor setup en de doelstellingen en de opzet van het experiment.
    7. Verder medium perfusie gedurende de duur van het experiment veranderende kweekmedium elke zeven dagen.

4. Surrogate Fixatie en Processing (figuur 1C)

  1. Label cryomolds en kunststof weefselcassettes voor surrogaat fixatie en verwerking.
  2. Vervolgens zet je surrogaten in specimen verwerking gel, die een waterige materiaal dat vloeibaar is bij warme temperaturen, maar stolt op kamertemperatuur. Het monster verwerking gel helpt bij het ​​houden van de surrogaten intact tijdens de verwerking en vergemakkelijkt histologische snijden 14,20-22.
    1. Specimen smelt verwerken gel in een 60 ° C waterbad om het vloeibaar te maken, waarbij bij deze temperatuur tot gebruik. Verplaats de bioreactor met de draagmoeder om een ​​bioveiligheid kast.
    2. Pipetteer ongeveer 300 ul specimen verwerking gel in de bodem van de gemerkte cryomold (figuur 1C, linkerpaneel).
    3. Met behulp van een scalpel (nr 10 voorkeur) en een tang voorzichtig de draagmoeder te verwijderen uit de bioreactor of uit de bron van een 8-well kamer dia's en plaats deze in de cryomold met monster verwerking gel.
      Opmerking: weefsel markeerinrichting kleurstoffen (zie Materialen / Apparatuur List voor een specifiek voorbeeld) van verschillende kleuren kunnen worden gebruikt om surrogaten te markeren, waardoor meerdere monsters op te nemen in een weefselcassette op onderscheiden wijze.
    4. Pipetteer ongeveer 300 gl monster verwerking gel de surrogaat in cryomold dekken en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min solidify.
    5. Zodra het monster verwerking gel is gestold, verwijder het monster verwerking gel met de draagmoeder van het cryomold, en plaats deze in een weefsel cassette.
  3. Plaats het weefsel cassette die het surrogaat in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 10 tot 12 uur bij kamertemperatuur geroerd om volledige fixatie mogelijk.
  4. Na fixatie, verplaatsen het weefsel cassette met de draagmoeder tot 70% ethanol totdat verwerkt tot paraffine.
    Let op: de draagmoeder overbrengen van formaline tot ethanol voorkomt over-fixatie met formaline, die het verlies van immunoreactiviteit van sommige epitopen 23 kunnen veroorzaken. De tijd in ethanol is niet kritisch. Deze verandering fixatief is belangrijk als het surrogaat wordt gebruikt voor immunohistochemie of immunofluorescentie. De vaste surrogaat is nu klaar voor verwerking tot paraffine (figuur 1C, middelste paneel). Deze bewerking wordt typisch uitgevoerd in een weefselprocessor in een ca.opriately uitgerust histologie laboratorium. Een kortere programma wordt aanbevolen vanwege de omvang en de delicate aard van de surrogaten. 24

5. Sectioning en H & E kleuring (figuur 1C, rechter paneel)

  1. Na verwerking van de surrogaten een paraffineblok, deel hen met een standaard microtoom voor het snijden van formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels 24,25.
    Opmerking: Dit kan worden uitgevoerd in een gekwalificeerd histologie laboratorium, of in een onderzoekslaboratorium, mits goed uitgerust en ervaren. De dikte van de histologische secties kan variëren afhankelijk van het beoogde gebruik van de secties; gebruiken we echter meestal secties die 5 urn dik. De PDMS schuim hier gebruikt in de geperfuseerde surrogaten is gemakkelijk coupes met een microtoom.
  2. Plaats secties op gewoon glas histologische dia's.
  3. Na het snijden, bak de histologische secties bij 58 ° C gedurende 10-12 uur te bereiden kleuringmet hematoxyline en eosine (H & E). Het bakken smelt de paraffine en maakt het ook mogelijk een betere hechting van secties om het glaasje.
  4. H & E kleuring:
    1. Stel de in tabel 2 beschreven Coplin potten of glazen schotels kleuring stations, afhankelijk van het aantal dia's vlekken. Zodra reagentia worden opgezet, bewegen de delen door middel van elk station, in volgorde, incubatie gedurende de volgende 24 aangegeven tijd.
    2. Monteer een dekglaasje aan elke dia met behulp van de montage media.
    3. Laat de montage media drogen voordat beeldvorming.
H & E kleuring
Station Oplossing Tijd
1 xyleen 5 minuten
2 xyleen 5 min
3 xyleen 5 minuten
4 100% ethanol 5 minuten
5 100% ethanol 5 minuten
6 95% ethanol 5 minuten
7 95% ethanol 5 minuten
8 Kraanwater 5 minuten
9 Gedeïoniseerd water 5 minuten
10 hematoxylin 7211 5 minuten
11 Kraanwater 5 minuten
12 clarifier * 10 dips
* Richard Allan # 7401 of 70% ethanol + 0,5% HCl
13 Kraanwater 5 minuten
14 Bluing Reagent 30 sec
15 Kraanwater 5 minuten
16 95% ethanol 10 dips
17 Eosine-Y 1 minuut
18 95% ethanol 10 dips
19 95% ethanol 10 dips
20 100% ethanol 10 dips
21 100% ethanol 10 dips
22 100% ethanol 5 minuten
23 xyleen 10 dips
24 Xyleen 5 minuten

Tabel 2 H & E kleuring.

6. Meten Cell Density

  1. Afbeelding ten minste één volledige H & E gekleurde histologische deel van de draagmoeder het gebruik van helderveld microscopie bij 400X vergroting, het opslaan van de beelden als .tif-bestanden.
    Opmerking: De beeldverwerking beschreven is alleen ingevuld met behulp van afbeeldingen in kleur. Hoewel niet getest, we geloven dat het dezelfde verwerking moet ook van toepassing zijn op grijswaardenafbeeldingen zijn.
  2. Download CellProfiler van het Broad Institute 26 (http://cellprofiler.org/download.shtml) en ImageJ van de National Institutes of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), die beide die publiekelijk beschikbaar zonder kosten.
  3. Om het gebied van de draagmoeder in elk beeld te meten, geopend ImageJ, selecteer "Metingen" (onder het tabblad "Analyseren"), selecteer "Area", en selecteer "Oke & #34 ;.
  4. Open een afbeelding (TIF-bestand) van de draagmoeder. Met behulp van de polygoon gereedschap in ImageJ (zie figuur 2), een overzicht van de oppervlakte van de draagmoeder in het beeld door de muis te slepen en klikken om ankerpunten te maken. Gebruik de randen van het ECM als richtlijn. Eenmaal geschetst, kiest u "Measure" onder het tabblad "Analyseren".

figure-protocol-1
Figuur 2. ImageJ analyse. Screenshot van ImageJ verwerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Herhaal dit voor elk beeld van het weefsel surrogaat. Bewaar metingen en bijbehorende afbeelding identifiers naar een spreadsheet-programma.
  2. Upload beeldbestanden gebruikt voor het gebied te meten in ImageJ in CellProfiler door het slepen van bestanden naar de "List File". Wijs een naam aan de in geïmporteerde afbeeldingende "NamesAndTypes" input module en selecteer de afbeelding type (dat wil zeggen, "Kleurenfoto").

figure-protocol-2
Figuur 3. CellProfiler bijvoorbeeld pijplijn. Screenshot van de pijpleiding is ontworpen om het aantal cellen met kernen in CellProfiler meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Maak een analyse pijpleiding die de volgende modules omvat om het aantal cellen per beeld te berekenen, door te klikken op de "+" teken naast "Adjust Module" (figuur 3, aan de onderkant van de linker paneel). Voeg elk van de volgende modules.
    1. Selecteer "ColorToGray" (figuur 4).
      1. Selecteer de naam van de afbeelding input van de drop-down menu, noem de output beeld, en selecteer het originele beeld type ( dat wil zeggen, RGB als kleurenbeeld input).
        Opmerking: deze module niet nodig zou zijn als het gebruiken van beelden in grijstinten
    2. Selecteer "ImageMath" (Figuur 5).
      1. Selecteer de "Omkeren" operatie, noemen de output beeld, en selecteer de grijswaardenafbeelding in het tabblad "select eerste afbeelding".
    3. Selecteer "IdentifyPrimaryObjects" (Figuur 6).
      1. image Selecteer ingang (afbeelding na wiskunde correctie), de naam van de primaire doel te identificeren (kernen), en voer de diameter bereik voor de objecten die moeten worden gemeten in pixel-eenheden (ongeveer 25-65). Selecteer "adaptive" drempel strategie "Otsu" drempelwaarde methode met "drie klassen". Gebruik geen andere parameters van de standaard instellingen niet te wijzigen.
        Opmerking: optimaal bereik van diameters moet worden bepaald door een afbeelding te openen in het beeld invoermodule en het meten van de diameter van de kernen (dat wil zeggen,het primaire doel) met behulp van de maatregel lengte tool.
    4. Selecteer "IdentifySecondaryObjects" (Figuur 7).
      1. Selecteer de afbeelding ingang (afbeelding na wiskunde correctie), selecteer de ingang objecten (kernen), en de naam van de objecten die moeten worden geïdentificeerd (cellen). Kies de "propagatie" methode om secundaire objecten te identificeren, gebruik dan de "adaptive" drempel strategie en "Otsu" methode met "twee klassen" minimaliseren "gewogen variantie". Kies "geen smoothing" en een drempel correctiefactor van 1, onder- en bovengrens van 0 en 1, en een regularisatie factor van 0,05. Gebruik geen andere parameters van de standaard instellingen niet te wijzigen.
    5. Selecteer "MeasureObjectSizeShape" (Figuur 8).
      1. Selecteer cellen (secundaire object) en kernen (eerste object) als de te meten objecten.
    6. Selecteer "FilterObjects" (Figuur 9 ).
      1. Noem de uitgang objecten en selecteer de kernen (primaire object) als object te filteren.
      2. Houd de komende twee parameters volgens de standaardinstellingen. Selecteer "AreaShape" als de meting om te filteren op categorie, en "formfactor" als de meting.
      3. Selecteer "Ja" om te filteren met behulp van een minimale meetwaarde en voeg een minimale waarde van 0,52.
      4. Selecteer "Nee" om te filteren met een maximale meting.
      5. Selecteer "Ja" om de contouren van gefilterde objecten te behouden en de naam van de geschetste beeld.
    7. Selecteer "ExportToSpreadsheet" (Figuur 10)
      1. Selecteer waar u het bestand en de naam "Output Files" op te slaan.
    8. Na de analyse pijplijn wordt gegenereerd (Stappen 6.7.1 tot 6.7.7.1), begint "Test Mode" in CellProfiler en evalueren van elke stap, met inbegrip van dat de kernen imago van de test op de juiste wijze worden gefilterd, om een ​​optimale pa verzekerenrameters werden gekozen om cellen te identificeren. Figuur een output afbeelding van CellProfiler na filtering, waar de kernen worden correct geïdentificeerd (omcirkeld in groen) 11 toont, en de achtergrond wordt uitgefilterd.
    9. Zodra parameters worden geëvalueerd en vastberaden voldoende te zijn, het project opslaan en klik op 'Analyze Images ". Dit project kan herhaaldelijk worden gebruikt voor toekomstige analyse.
      Let op: Als parameters zijn vastgesteld, wordt het programma in te stellen om alle beelden in de "List File" te analyseren, sequentieel. Dit staat voor meerdere ramen voor elke geanalyseerde beeld met een langere verwerkingstijd veroorzaakt.
      1. Om een ​​langere verwerkingstijd te voorkomen, klikt u op het oogpictogram op alle modules, behalve "ExportToSpreadsheet" onder de rubriek "Analysis modules".
    10. Zodra alle surrogaat beelden zijn door CellProfiler verwerkt, opent u de spreadsheet met de beeldgegevens gegenereerd door Cell Profiler en de spreadsheet met de omgeving gemeten met ImageJ. Kopieer de gefilterde kernen data (kolom D in de CellProfiler spreadsheet) en het beeld identifiers (kolom R) en plak ze in de spreadsheet met de gemeten data gebied.
    11. Bereken de som van alle verkregen voor het aantal kernen per beeld van de draagmoeder metingen.
    12. Bereken de som van de verkregen surrogate gebied van elk beeld van de draagmoeder metingen. Verdeel de totale oppervlakte gemeten door 1x10 6.
    13. Verdeel het totale aantal kernen van de totale oppervlaktemeting in de stap hierboven om een waarde voor het aantal cellen per 1x10 6 pixels 2 te verkrijgen.

figure-protocol-3
Figuur 4. CellProfiler pijplijn: het veranderen van de grijswaarden Screenshot van "ColortoGray" module..s: //www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig4highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 5. CellProfiler pijplijn:.. Beeld inverteren Screenshot van "ImageMath" module Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-5
Figuur 6. CellProfiler pijplijn:.. Identificeren kernen Screenshot van "IdentifyPrimaryObjects" module Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 7. CellProfiler pijplijn:.. Identificeren van cellen Screenshot van "IdentifySecondaryObjects" module Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-7
Figuur 8. CellProfiler pijplijn:.. Meten objecten Screenshot van "MeasureObjectSizeShape" module Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-8
Figuur 9. CellProfiler pijplijn. Verfijning voorwerpen Screenshot van "FilterObjects "module. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-9
Figuur 10. CellProfiler pijplijn:.. Exporteren van gegevens Screenshot van "ExportToSpreadsheet" module Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-10
Figuur 11. CellProfiler uitgang na filtering. Screenshot van de output scherm in cel profiler volgende object filtering. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volle en geperfuseerd 3D borstkanker surrogaten werden bereid zoals boven beschreven en gedurende 7 dagen. Vervolgens werden surrogaten vastgesteld, verwerkt tot paraffine, in secties verdeeld en gekleurd met hematoxyline en eosine, zoals hierboven beschreven. Het aantal kernhoudende cellen per gebied (zowel 231 cellen en CAF) van elk surrogaat werd gemeten. Zoals te zien in figuur 12, representatieve microfoto van het H & E gekleurde secties tonen een hogere concent...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin is een werkwijze voor 3D cultuur beschreven dat componenten van het weefsel micro, waaronder de extracellulaire matrix (ECM) en humane stromale fibroblasten bevat, in een hoeveelheid die dichter modellen menselijke borstkanker om voor de ontwikkeling van een samenvattend 3D morfologie . De 3D kweekmethode beschreven representatiever menselijke ziekten dan traditionele 2D celkweek die meerdere celtypen opgenomen in een 3D-volume van ECM. Er wordt opgemerkt dat deze parameters (dat wil zeggen, verschillend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het University of Alabama at Birmingham Center for Metabolic Bone Disease voerde de histologische verwerking en het snijden van surrogaten uit. Southern Research (Birmingham, AL) zorgde voor ondersteuning bij de vervaardiging van het bioreactorsysteem. Financiering werd verstrekt door het Breast Cancer Research Program (BC121367) van het United States Department of Defense.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM)Corning CellGro10-014-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1xCorning25-053-CI
Tissuc Cultuur platen, 100 mmCellTreat Scientific Products229620Steriele
Tissuc Cultuur platen, 35 mmCellTreat Scientific Products229638Voor PDMS schuim vorming 
9" Glass pijpjesFisher 13-678-20DSteriele
10 ml pijpjesCellTreat Scientific Products229210BSteriele
1,000 µl pijpjes tipsFisherBrand02-717-166Steriele Gefilterd
200 µl pijpjes tipsFisherBrand02-717-141Steriele Gefilterd
10 µl pijpjes tipsFisherBrand02-717-158Steriele Gefilterd
15 ml conische buisjesCellTreat Scientific Products229410Steriele
50 ml conische buisjesCellTreat Scientific Products229422Steriele
1.5 ml microcentrifugebuisjesFisherBrand05-408-129Steriele
Trypan blauwCorning Cellgro25-900-CISteriele
Sylgard 184Electron Microscopy Sciences24236-10PDMS elastomer en verhardingsmiddel. Gebruikt voor onze in-house bioreactor.
PDMS FoamGemaakt in huis voor gebruik in onze in-house bioreactor.
High Concentration Bovine Collagen Type IAdvanced Biomatrix5133-AFibriCol ~10 mg/ml
Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane)Corning354230Basement membrane materiaal
Sodium BicarbonateSigmaS8761
Molecular Biology Grade WaterFisherBP2819-1
DMEM 10x Sigma-AldrichD2429
Nunc Lab-Tek Chamber Slide System Thermo Scientific1774028-well
BioreactorGemaakt in huis.
Spring-Back 304 roestvrij staal—Gecoat met PTFE polymeerMcMaster-Carr1749T19Roestvrijstalen draden om microkanalen te genereren in ons in-house  bioreactorsysteem. 0,016" Diameter
BioPharm Plus platina-gecureerde siliconen pompbuis, L/S 14MasterflexEW-96440-14Voor gebruik in ons in-house bioreactorsysteem. Buis ID: 1,6 mm, Slang draad scherm grootte: 1/16 in.
2-Stop Tubing Sets, niet-verflensd PVC, 1.52 mm IDCole-Parmer EW-74906-36Voor gebruik in ons in-house bioreactorsysteem (met microperistaltische pomp). 
Six Channel precision micro peristaltic pompCole-ParmerEW-74906-04Voor gebruik met ons in-house bioreactorsysteem
Tuberculin SpritzenBD Medical30962526 gauge 3/8 in. naald; Steriele
Dissecting Tissue ForcepsFisherBrand13-812-365,5 inch
Mini Tube RotatorBoekel Scientific260750Apparatuuroptie voor surrogaat rotatie. Gebruikt met carrousel voor 50 ml buisjes (modelnummer 260753)
50 ml buisje carrouselBoekel Scientific260753Gebruikt met mini tube rotator
Bambino  HybridisatieovenBoekel Scientific230301Apparatuuroptie voor surrogaat rotatie
HistoGel Specimen Processing GelThermo ScientificHG-4000-012Specimen Processing Gel beschreven in Stap 5.2
CryomoldAndwin Scientific456615 mm x 15 mm x 5 mm
Tissu Marking DyeCancer Diagnostics, inc. 03000PKan worden gebruikt om surrogaten te markeren,  waardoor meerdere monsters in één weefsel cassette kunnen worden opgenomen 
Hinged tissue cassettes FisherBrand22-272-416
FormalinFisher23-245-685
GoldSeal Plain Glass SlidesThermo Scientific3048-002
XyleneFisherX3P-1GAL
Ethanol, 200 proof (100%), USPDecon Laboratories, Inc.2805M
HematoxylinThermo Scientific Richard-Allan Scientific7211
ClarifierThermo Scientific Richard-Allan Scientific7401
Bluing SolutionThermo Scientific Richard-Allan Scientific7301
Eosin YThermo Scientific Richard-Allan Scientific7111
Cytoseal XYL mounting mediaThermo Scientific Richard-Allan Scientific83124
CoverslipsFisher Scientific12-548-5G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
  2. Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
  3. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  4. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).
  5. Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).
  6. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  7. Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).
  8. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).
  9. Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).
  10. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
  11. Bergamaschi, A., et al. Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome. J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).
  12. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, S66-S72 (2013).
  13. Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies. JBC. 204 (3), 291-301 (2014).
  14. Sadlonova, A., et al. Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 4, (2004).
  15. Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity. Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).
  16. Marshall, L. E., et al. Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
  17. Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. Polymeric foams with functional nanocomposite cells. RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).
  18. Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, (2014).
  19. Lochter, A., Bissell, M. J. Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer. Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).
  20. Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).
  21. Varsegi, G. M., Shidham, V. Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells. J Vis Exp. (29), e1316(2009).
  22. Sadlonova, A., et al. Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease. Am J Pathol. 170 (3), (2007).
  23. Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol. Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).
  24. Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering. J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).
  25. Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies. J Vis Exp. (11), (2008).
  26. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  27. Kwon, Y. -J., et al. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines. Clin Exp Metastasis. (28), (2011).
  28. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J Vis Exp. (99), e52293(2015).
  29. Pal, A., Kleer, C. G. Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells. J Vis Exp. (86), e51311(2014).
  30. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088(2014).
  31. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  32. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), e52526(2015).
  33. Sadlonova, A., et al. Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts. Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).
  34. Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels. Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).
  35. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).
  36. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  37. Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).
  38. Caruso, R. A., et al. Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review). Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).
  39. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).
  40. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
  41. Ogino, S., et al. Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease. Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).
  42. Otali, D., et al. Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition. Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Driedimensionale kweekstromale fibroblastenextracellulaire matrixperfusie bioreactorsysteemECM polymerisatiehistologisch doorsnedenImageJ analyseCellProfiler softwaremeting van de celdichtheid

Gerelateerde artikelen