Method Article

Ontwikkeling en karakterisering van In Vitro Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca 2+] i En productie van stikstofoxide

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype. Hoewel de ontwikkeling van microfluïdische apparaten is omarmd door ingenieurs meer dan twee decennia, hun biologische toepassingen blijven beperkt. Een fysiologisch relevant in vitro model microvaatje bevestigd met biologische toepassingen is het belangrijk om het veld bevorderen en overbruggen van de kloof tussen in vivo en in vitro onderzoeken. Hier presenteren we gedetailleerde procedures voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk via een microfluïdische inrichting met een lange-termijn perfusie vermogen. We tonen ook aan haar verzoeken om kwantitatieve metingen van-agonist geïnduceerde veranderingen in EG [Ca 2+] i en stikstofmonoxide (NO) productie in real-time met behulp van confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De gevormde microvaatje nettowerken met continue perfusie toonde goed ontwikkelde verbindingen tussen EC. VE-cadherine distributie was dichter bij die waargenomen in intacte microvaatjes dan statisch gekweekte EC monolagen. ATP-geïnduceerde tijdelijke toename van EG [Ca2 +] i en NO productie werden kwantitatief gemeten op individueel celniveau, die de functionaliteit van de gekweekte microvaatjes gevalideerd. Deze microfluïdische apparaat kan ECs te groeien onder goed gecontroleerde, fysiologisch relevante stroom, waarbij de celkweek omgeving dichter bij in vivo dan die in de conventionele, statische 2D culturen maakt. Het microkanaal netwerk ontwerp is zeer veelzijdig, en het fabricageproces is eenvoudig en herhaalbaar. Het apparaat kan eenvoudig worden geïntegreerd in de confocale microscopische of conventionele systeem voor hoge resolutie beeldvorming. Belangrijker, omdat de gekweekte microvaatje netwerk kan worden gevormd door primaire humane EC, zal deze benadering een nuttig instrument om te onderzoeken hoepathologisch veranderde bloedcomponenten van patiënt monsters hebben voor de EC en geven inzicht in de klinische problemen. Het kan ook worden ontwikkeld als een platform voor drug discovery.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype 1,2. De microfluidics technologie maakt een nauwkeurig gecontroleerde vloeistof door een geometrisch beperkt microschaal (sub-millimeter) kanalen 3, dat de mogelijkheid voor gekweekte cellen voorziet, met name voor vasculaire EC, om te groeien onder de gewenste stroom omstandigheden. Deze eigenschappen maken de celkweekomstandigheden dichter bij in vivo dan de conventionele, statische 2D celkweken. Ze zijn zeer belangrijk bij de ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. microfluïdische apparaat Fabrication

  1. Standard Fotolithografie Fabrication van een SU-8 50 Master Mold
    1. Reinig de siliciumwafel voor spin-coating. Gespoeld kale 2 inch silicium wafer met aceton gedurende 15 minuten gevolgd door isopropylalcohol (IPA) gedurende 15 min. Dehydrateer de wafer door het op een verwarmingsplaat bij 150 ° C gedurende 1 uur. Na dehydratatie Koel de wafer bij kamertemperatuur.
    2. Spin-coat het silicium wafer met SU-8. Voeg 2 ml SU-8 op de wafer. Ramp de wafel 500 rpm en 100 rpm / sec versnelling gedurende 10 seconden, gevolgd door 1000 rpm bij 300 rpm / sec versnelling gedurende 30 sec. (Zie Aanvullende Video 1)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit gedeelte wordt een aantal van de resultaten verkregen met de gekweekte microvaatjes netwerk ontwikkeld met dit protocol resultaten. Het microkanaal patroon is een drie niveau vertakking netwerk (figuur 1A). In dit ontwerp, een 159 micrometer breed moeder kanaal takken in twee 126 micrometer brede kanalen, en takken weer in vier 100 micrometer breed dochter kanalen. Een 3D numerieke simulatie werd uitgevoerd om de schuifspanning verdeling schatten onder de stroomsn.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk, de karakterisering van EG kruispunten en F-actine cytoskelet distributie en de kwantitatieve metingen van EG [Ca2 +] i en NO-productie met behulp van een microfluïdische apparaat. Geperfundeerde microfluïdische apparaat verschaft een in vitro model dat een getrouwe simulatie van de in vivo microvasculaire geometrieën afschuiving stroomomstandigheden toelaat. Sinds.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen of conflicterende belangen te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL56237, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 en EPS-1003907).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
AcetoneFisher ScientificA929
Biopsy punchMiltex33-31 AA
Bovine AlbuminMP Biomedicals810014
Bovine Brain Extract (BBE)LonzaCC-4098
Cover-slipFisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary AntibodyLife technologiesA-11055
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-250
DRAQ5 (nuclei staining) Cell Signaling Technology4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Fetal Bovine SerumGibco16000-044
FibronectinGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml)Gibco15750-078
Glass coverslipFisher Scientific12-548B
Glass Pasteur pippetteVWR14672
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES Buffered Saline SolutionLonzaCC-5024
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)LonzaCC-2517
Isopropyl alcohol (IPA)VWR89125
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4.6 mM)Fisher ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM)Fisher ScientificM63-500
Glucose (5.5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5.0 mM)Fisher ScientificS233-500
Hepes Salt (9.1 mM)Research Organics6007H
Hepes Acid (10.9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Culture MediumLife technologies10372-019
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
Phalloidin (F-actin staining)Sigma-AldrichP1951
Phosphate Buffered Saline Life technologies14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
ScalpelExel Int29552
Scotch tape3M34-8711-3070-3
Silicon waferVWR14672
SU-8 photoresistMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 developerMicroChemY020100
tissue culture flasksSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
Trypsin Neutralizer solutionGibcoR-002-100
Trypsin/EDTA Solution (TE)GibcoR-001-100
TubingCole-ParmerPTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiotechnologySC-6458
Name of EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Biosafety Laminar hoodNuAireNU-425 Class II, Type A2
CCD cameraHamamatsuORCA
Confocal microscopeLeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
HotplateWenescoHP-1212
IncubatorForma Scientific3110
Isotemp ovenBarnstead3608-5
Lithography benchKarl SussMA6 Contact Lithography
Optical microscopeNikonL200 ND & Diaphod 300
Shutter for the CCD cameraSutter InstrumentLambda 10-2
Plasma cleanerPVA TePla/Harrick plasmaM4L/PDC-32G
Spin coaterBrewer ScienceCee 200X
Syringe pump systemHarvard Apparatus703005
Name of SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
CAD softwareAutodeskAutoCAD 2015
CFD simulation softwareCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Images acquire and analyse for NO production Universal ImagingMetafluor

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

Related Articles