Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling en karakterisering van

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54014

⸱

19 mei 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Samenvatting

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype. Hoewel de ontwikkeling van microfluïdische apparaten is omarmd door ingenieurs meer dan twee decennia, hun biologische toepassingen blijven beperkt. Een fysiologisch relevant in vitro model microvaatje bevestigd met biologische toepassingen is het belangrijk om het veld bevorderen en overbruggen van de kloof tussen in vivo en in vitro onderzoeken. Hier presenteren we gedetailleerde procedures voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk via een microfluïdische inrichting met een lange-termijn perfusie vermogen. We tonen ook aan haar verzoeken om kwantitatieve metingen van-agonist geïnduceerde veranderingen in EG [Ca 2+] i en stikstofmonoxide (NO) productie in real-time met behulp van confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De gevormde microvaatje nettowerken met continue perfusie toonde goed ontwikkelde verbindingen tussen EC. VE-cadherine distributie was dichter bij die waargenomen in intacte microvaatjes dan statisch gekweekte EC monolagen. ATP-geïnduceerde tijdelijke toename van EG [Ca2 +] i en NO productie werden kwantitatief gemeten op individueel celniveau, die de functionaliteit van de gekweekte microvaatjes gevalideerd. Deze microfluïdische apparaat kan ECs te groeien onder goed gecontroleerde, fysiologisch relevante stroom, waarbij de celkweek omgeving dichter bij in vivo dan die in de conventionele, statische 2D culturen maakt. Het microkanaal netwerk ontwerp is zeer veelzijdig, en het fabricageproces is eenvoudig en herhaalbaar. Het apparaat kan eenvoudig worden geïntegreerd in de confocale microscopische of conventionele systeem voor hoge resolutie beeldvorming. Belangrijker, omdat de gekweekte microvaatje netwerk kan worden gevormd door primaire humane EC, zal deze benadering een nuttig instrument om te onderzoeken hoepathologisch veranderde bloedcomponenten van patiënt monsters hebben voor de EC en geven inzicht in de klinische problemen. Het kan ook worden ontwikkeld als een platform voor drug discovery.

Inleiding

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype 1,2. De microfluidics technologie maakt een nauwkeurig gecontroleerde vloeistof door een geometrisch beperkt microschaal (sub-millimeter) kanalen 3, dat de mogelijkheid voor gekweekte cellen voorziet, met name voor vasculaire EC, om te groeien onder de gewenste stroom omstandigheden. Deze eigenschappen maken de celkweekomstandigheden dichter bij in vivo dan de conventionele, statische 2D celkweken. Ze zijn zeer belangrijk bij de microfluïdische apparaten worden gebruikt om verschillende soorten vasculatures modelleren en EG reacties op mechanische en / of chemische prikkels bestuderen.

Ondanks de voordelen aangetoond door de microkanaal-netwerk via een statisch celkweek, de aanpassing en de toepassing van microfluidics in de biomedische field blijven beperkt. Gemeld door een recent overzicht, het merendeel van de publicaties van dit gebied (85%) zijn nog in engineering journals 4. De prestaties van microfluïdische apparaten is niet overtuigend genoeg voor de meeste biologen over te stappen van de huidige technieken, zoals de Transwell test en de macro-schaal cultuur schotel / glasplaatje om dit geminiaturiseerde apparaat. Microfluidics is een multidisciplinair veld, dat interdisciplinaire samenwerking vereist dat dit gebied vooruitgang te boeken. Het doel van dit technische artikel is om de lacunes in de kennis te verminderen tussen disciplines en maken de fabricage procedures begrijpelijk door biologen, terwijl het verstrekken van biologische toepassingen en functionele validatie van de microfluïdische microvaatjes. De gevisualiseerde experimentele protocollen omvatten fabricage van zowel microfluïdische apparaten en hun biologische nutsbedrijven, die een nauwe samenwerking tussen ingenieurs en biologen vertegenwoordigt.

We hebben onlangs melding gemaakt van enkelebiologische toepassingen die de in vitro microvaatje netwerk microfluïdische apparaat 5. Om op passende ontwerp van de afmetingen van het microkanaal netwerk en breng de gewenste schuifspanning werd een numeriek model gebouwd met numerieke stromingsleer software om het stromingsprofiel nauwkeurig schatten. Primaire humane navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC) die werden gezaaid in de microkanalen confluentie bereikten, dat wil zeggen onder de volledige binnenoppervlakken van het microkanaal, 3-4 dagen continue perfusie. De barrièrevorming juiste bleek uit VE-cadherine kleuring en vergeleken met die gevormd in statische celkweekomstandigheden en in intacte microvaatjes. Door toepassing van de experimentele protocollen ontwikkeld individueel intacte geperfundeerde microvaatjes 6-8, we kwantitatief gemeten veranderingen in EG [Ca2 +] i en stikstofoxide (NO) in reactie op adenosine trifosfaat (ATP) met fluorescerende indicators en confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De door agonist geïnduceerde toenamen in EG [Ca2 +] i en NO productie gemeld noodzakelijk intracellulaire signalen voor inflammatoire mediator-geïnduceerde toenames in permeabiliteit microvaatjes 6-15. Hoewel sommige eerdere studies beelden van DAF-2 DA beladen microfluïdische apparaten 16,17 toonde, had juiste resolutie en data-analyse nog niet bereikt 18. Voor zover wij weten, deze studie toont de eerste kwantitatieve metingen van door agonist veroorzaakte dynamische verandering in endotheelcellen [Ca2 +] i en NO opstelling met microfluïdische systeem.

Microproductietechnieken de flexibiliteit om microkanalen fabriceren tot een paar micrometer en maken de ontwikkeling mogelijk van complexe patronen op de geometrie van in vivo microvasculatuur nabootsen. Hier presenteerden we een typische microkanaal netwerk met drie niveaus van vertakking. Dezenetwerk wordt vervaardigd door de combinatie van fotolithografie die wordt uitgevoerd in een cleanroom microfabrication en zachte lithografie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. microfluïdische apparaat Fabrication

  1. Standard Fotolithografie Fabrication van een SU-8 50 Master Mold
    1. Reinig de siliciumwafel voor spin-coating. Gespoeld kale 2 inch silicium wafer met aceton gedurende 15 minuten gevolgd door isopropylalcohol (IPA) gedurende 15 min. Dehydrateer de wafer door het op een verwarmingsplaat bij 150 ° C gedurende 1 uur. Na dehydratatie Koel de wafer bij kamertemperatuur.
    2. Spin-coat het silicium wafer met SU-8. Voeg 2 ml SU-8 op de wafer. Ramp de wafel 500 rpm en 100 rpm / sec versnelling gedurende 10 seconden, gevolgd door 1000 rpm bij 300 rpm / sec versnelling gedurende 30 sec. (Zie Aanvullende Video 1)
    3. Pre-bak de wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10 min, vervolgens zacht bakken bij 95 ° C gedurende 30 minuten.
    4. Met UV blootstelling aan de ontworpen patroon te vormen van een film masker op het roterend bedekken fotoresist. Druk de patroon op een dunne transparante film als een film masker. Plaats de film masker boven despin-beklede fotoresist en blootstellen aan UV met een dosis van 300 mJ / cm2. (Zie Aanvullende Video 2)
      Let op: In dit protocol, het microkanaal netwerk patroon (159 micrometer breed moeder kanalen vertakking in vier 100 micrometer breed dochter kanalen) is ontworpen met CAD-software. Het patroon op de film toont als ruim baan en de rest van de film wordt bedekt met zwarte inkt. Omdat SU-8 is een negatieve fotoresist, wordt het gedeelte van de fotoresist die is blootgesteld aan UV verknoopt en onoplosbaar oplosmiddel worden tijdens de ontwikkeling van schimmels (stap 1.1.6). Na de ontwikkeling wordt het onoplosbare gedeelte het ontworpen netwerkpatroon repliceren en dienen als meester mal.
    5. Post-bak de belichte wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 1 min, vervolgens 95 ° C gedurende 10 minuten.
    6. Ontwikkel de meester mal. Gebruik SU-8 developer als oplosmiddel om de niet-verknoopt fotoresist te verwijderen. Dompel de wafer in SU-8 developer gedurende 3 minuten en spoel af met IPAgedurende 1 min.
    7. Herhaal deze ontwikkelen cyclus 2-3 keer totdat er geen witte streep vorming (residu van niet uitgeharde fotolak) na de IPA spoelen. Voorzichtig drogen van de wafel met stikstofgas en onderzoekt de kleine elementen van het patroon onder een microscoop. Herhaal dit extra ontwikkelen cycli indien nodig.
    8. Hard bak de wafer op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 15 minuten.
  2. Soft Lithography
    1. de twee delen (basis en verharder) van polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer handmatig te mengen in een gew. verhouding van 10: 1.
    2. De gas de PDMS mengsel met een exsiccator verbonden met een vacuümbron voor 15 min. Werpt het PDMS oplossing op de fotolak meester mal. De dikte van de PDMS moet zijn dan 3 mm een ​​stabiele aanhouden van de inlaat / uitlaat slang verschaffen. De-gas de PDMS opnieuw voor 15 minuten, en verwijder de resterende luchtbellen met stikstofgas indien nodig. Hard de gegoten PDMS in een oven bij 65 ° C gedurende 3 uur.
    3. Reinig het oppervlak vanhet glas dekglaasje met een plakband en een plasma-cleaner (30 sec plasma behandeling). Spin-coat-un uitgeharde PDMS (0,5 ml) op de glazen dekglaasje door verhoging tot 4000 rpm en 500 rpm / sec acceleratie voor 30 sec. Hard de PDMS roterend bedekken dekglaasje in een oven bij 65 ° C gedurende ten minste 30 min.
    4. Knip en laat de uitgeharde PDMS van de master mal. Vervolgens maakt een inlaat en een uitlaat met een 1 mm diameter perforator bij het distale einde van de moeder kanalen.
    5. Binden het apparaat naar de PDMS roterend bedekken dekglaasje. Oxideren van de oppervlakken van de PDMS en dekglaasje met een plasma reiniger voor 1 min. Na de zuurstof plasmabehandeling, plaats een druppel gedeïoniseerd water (DI water) aan het verbindingsoppervlak en plaats de twee delen samen. Bak de inrichting in een oven bij 65 ° C gedurende 30 minuten om een ​​permanente verbinding te verkrijgen.

figure-protocol-1
Aanvullende Video 1 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-protocol-2
Aanvullende Video 2 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

2. endotheelcellen zaaien en Cultuur

  1. Sterilisatie-inrichting en fibronectine Coating
    1. Het behoud van de hydrofobe eigenschap van het PDMS oppervlak rond de inlaat / uitlaat van oxidatie. Bedek het PDMS oppervlak rond de inlaat en uitlaat met strookjes plakband om oxidatie te voorkomen. Deze procedure kan voorkomen DI water verspreiden over het bovenoppervlak van de inrichting tijdens het vullen stap (2.1.3).
    2. Behandel de PDMS apparaat met zuurstof plasma for 5 min veranderen het oppervlak hydrofiel, waardoor vloeistofstroom door de microkanaal vergemakkelijken en te voorkomen dat de belletjesopsluitfilterdeel de vulprocedure (2.1.3).
    3. Gebruik ofwel een spuit met een naald bevestigd of een pipet om het apparaat met DI-water te vullen van de inlaat. Blijven de vulling tot er een druppel DI water (30-50 ui) geaccumuleerd bij de uitlaat. Onderzoek van het apparaat onder een microscoop om te controleren of er luchtbellen gevangen in de microkanaal. Verwijder de buitensporige waterdruppeltje bij de inlaat en uitlaat met een tissue.
    4. Steriliseer het apparaat in een petrischaal met UV gedurende minimaal 3 uur in een laminaire bioveiligheid kap. Om verdamping te voorkomen, hebben betrekking op de ingang / uitgang met een dun stukje PDMS, zet een natte papieren tissue binnen het gerecht, en wikkel het gerecht met Parafilm.
    5. Coat het apparaat met fibronectine. Spoel het apparaat eerst met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), smeer met 100 ug / ml fibronectine overnacht in de koelkast (4 ° C). Plaats een druppel oplossing bij de inlaat, en vervolgens een negatieve druk bij de uitlaat met een huisvacuüm, een injectiespuit met een naald of een pipet.
    6. Vul het apparaat met celkweek media. Spoel het apparaat met PBS handmatig 3 keer voordat de celkweek media. Warm-up van het apparaat in een incubator bij 37 ° C.
  2. EC Zaaien en lange termijn Perfusion
    Opmerking: In vergelijking met gebruikelijke statische 2D EG cultuur, de in vitro microvaatje netwerkmodel continue perfusie uit de celkweek omgeving dichter bij de in vivo omstandigheden. De in vitro microvaatje netwerk aangetoond in dit protocol kan maximaal twee weken gehandhaafd. De goed-gecontroleerde perfusie zal continu aan te vullen voedingsstoffen, te verwijderen afval, en te voorkomen dat over-samenvloeiing van de EC monolaag. Derhalve kan worden uitgebreid tot een langere termijn studies, nabootsen van de cellulaire en hemodynamische omgeving onder verschillende Physiological en pathologische omstandigheden.
    1. Meng primaire HUVECs in HUVEC cultuur media (MCDB 131) met 8% dextran (molecuulgewicht 70.000). Het dextran wordt gebruikt om de viscositeit van het afdrukmateriaal verhogen en bereiken een betere cel seeding resultaat. De aanbevolen celdichtheid ongeveer 2-4 x 10 6 cellen / ml.
    2. Zaad van de cellen in het apparaat. Plaats een 10-20 ul druppel van cellen via inlaat. Introduceer een zachte stroom door ofwel het kantelen van het apparaat, of de capillaire werking met een glazen Pasteur pipet bij de uitlaat. De sleutel voor een succesvolle cel laden moet de stroomsnelheid regelen minder dan 1 mm / sec in de kleinste kanalen.
    3. Controleer de cel zaaien. Na de eerste enting, incubeer de inrichting voor 15-20 min (bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C) voor het controleren van de status van enten onder de microscoop. Voer eventueel aanvullende celbelading een gewenste celdichtheid bereikt.
    4. Voorzichtig Spoel het apparaat met celkweekmedium (37° C) om het dextran te verwijderen. Cultuur de inrichting in afwezigheid van bereikte na 6 uur in een incubator (5% CO2 bij 37 ° C).
    5. Stel de slangaansluiting voor langdurige perfusie. Tape het apparaat in een petrischaaltje om verplaatsing te voorkomen. Maak kleine gaatjes in het deksel van de petrischaal voor inlaat en uitlaat slang inserties. Sluit de inlaat slang aan op een injectiespuit met een naald voor de celkweek media perfusie. Sluit de uitlaat slang aan een inzamelaar van afvalstoffen.
      Opmerking: Plaats het apparaat en de afvalinzamelaar in een celkweek incubator, terwijl het plaatsen van een perfusie pomp buiten de couveuse en sluit deze met het apparaat door de lange inlaat slang. De perfusie wordt bepaald door het experimentele ontwerp. In de onderhavige inrichting gebruikt een perfusiesnelheid van 0,35 pl / min en een afschuifspanning bereik tussen 1-2 dyne / cm2. Op grond van deze perfusie toestand, de HUVEC's te bereiken samenvloeiing in ongeveer 3-4 dagen.

3. Immunofluorescent kleuring

  1. Bevestig de EC in de inrichting door perfusie van 2% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij 4 ° C, gevolgd door spoelen 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min, en 1% BSA blokkering gedurende 30 min. Gebruik een perfusie snelheid die dezelfde is als die gebruikt voor celkweek.
  2. Permeabilize vaste ECS antilichaam kleuring met 0,1% Triton X-100. Perfuseren het apparaat met Triton voor 5-7 min tot label VE-cadherine, en 3 min naar label F-actine.
  3. Laad de antilichamen in het apparaat. Perfuseren het apparaat met 1x PBS gedurende 15 minuten te spoelen de vorige oplossingen. Handmatig te laden het primaire antilichaam tegen VE-cadherine (anti-geit) in het apparaat bij een concentratie van 2 ug / ml (totaal volume 20-50 ui). Houd het apparaat in een koelkast bij 4 ° C overnacht. Perfuseren het secundaire antilichaam (ezel anti-geit) van een injectiepomp bij een concentratie van 7 ug / ml gedurende 45-60 min.
  4. Label EC F-actine met phalloidin. Perfuseren het apparaat met 1x PBS for 15 min voor handmatig laden phalloidin (10 ug / ml) gedurende 7-10 min.
  5. Label EC kernen (zie Materials List).
  6. Spoel het apparaat met 1x PBS en handhaven bij 4 ° C tot beeldvorming.

4. Fluorescentie Imaging van endotheliale [Ca 2+] i

  1. Perfuseren het apparaat met albumine (10 mg / ml) -Ringer's oplossing gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Gebruik dezelfde perfusie tarief als die wordt gebruikt voor celkweek. De concentraties van alle componenten van albumine-oplossing Ringer's zijn beschreven in de Materialen List.
  2. Opgezet confocale systeem voor het EG [Ca 2+] i beeldvorming met fluo-04:00. Gebruik van een confocale microscopische voor Ca2 + imaging. Gebruik een argon laser (488 nm) voor excitatie en stel de uitstoot band als 510-530 nm. Verzamel de beelden met een 25X objectief (onderdompeling in water, NA: 0,95) bij 512 x 512 scan-formaat. Gebruik een z-stap van 2 urn en een scanning interval voor elke stapel images van 20 sec.
  3. Perfuseren het apparaat met fluo-04:00 (5 uM) gedurende 40 min bij 37 ° C, dan was het lumen fluo-04:00 met een oplossing van albumine-Ringer's.
  4. Acquire beelden van fluo-4 geladen microvaten. Verzamel de basislijn afbeeldingen voor 10 min. Perfuseren het apparaat met ATP (10 pM) en de veranderingen in fluorescentie-intensiteit (FI) opnemen 20 min.

5. Fluorescentie beeldvorming van productie van stikstofoxide

  1. Perfuseren het apparaat albumine-oplossing van Ringer gedurende 15 min. Gebruik een perfusie snelheid die dezelfde is als die gebruikt voor celkweek.
  2. Stel de fluorescentie afbeeldingssysteem maat ATP-geïnduceerde productie van stikstofoxide. Gebruik een microscoop uitgerust met een 12-bit digitale CCD camera en een computergestuurde sluiter voor stikstofmonoxide meting. Gebruik een 75 W xenon lamp als lichtbron.
    Let op: Selecteer de excitatie en emissie golflengte voor DAF-2 DA door een interferentie filter (480/40 nm) en een dichroïsche spiegel(505 nm) met een band-pas barrière (535/50 nm). Gebruik een 20X objectief (NA: 0,75) om de beelden te verzamelen. Fotobleken te minimaliseren, plaatst een grijsfilter (0,5 N) voor het interferentiefilter en beperken de blootstellingstijd aan 0,12 sec.
  3. Laad de cellen met DAF-2 DA (5 pm). Perfuseren het apparaat met DAF-2 DA gedurende ongeveer 35-40 minuten bij 37 ° C. Noteer de basislijn van DAF-2 fluorescentie-intensiteit (FI DAF) na de eerste belasting.
    Opmerking: DAF-2 DA continu aanwezig is in het perfusaat gedurende het experiment 7.
  4. Verzamel DAF-2 beelden. Noteer de basislijn FI DAF 5 minuten. Perfuseren het apparaat met ATP (10 pM) en verzamel de afbeeldingen voor 30 min met 1 minuut intervallen. Verzamel alle van de beelden van dezelfde groep cellen op hetzelfde focal plane.

6. Data Analysis

  1. Selecteer handmatig de regio van belang (ROI) van de verzamelde beelden op individueel celniveau. ElkROI bestrijkt het gebied van een individuele cel die de fluorescentie lijnen worden aangegeven.
  2. Aftrekken achtergrond fluorescentie en berekent het gemiddelde FI van elk ROI.
  3. Meet ATP-geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i en NO productie. Kwantificeren ATP-geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i door het berekenen van de veranderingen in Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, waarbij FI 0 is de gemiddelde basislijn FI tijdens albumine-Ringer perfusie voor het toevoegen van ATP) minus de gemeten achtergrond. Kwantificeren NO productie snelheid door het uitvoeren van de eerste differentiële conversie van de FI DAF in de tijd.
    Opmerking: Het tijdsverloop van FI DAF is een cumulatieve productie van NO in de tijd. Daarom wordt de NO-productie berekend op basis van het profiel van FI DAF zowel onder basale en ATP gestimuleerde omstandigheden. Details van data-analyse en experimentele procedures zijn beschreven in een eerdere publicatie 7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit gedeelte wordt een aantal van de resultaten verkregen met de gekweekte microvaatjes netwerk ontwikkeld met dit protocol resultaten. Het microkanaal patroon is een drie niveau vertakking netwerk (figuur 1A). In dit ontwerp, een 159 micrometer breed moeder kanaal takken in twee 126 micrometer brede kanalen, en takken weer in vier 100 micrometer breed dochter kanalen. Een 3D numerieke simulatie werd uitgevoerd om de schuifspanning verdeling schatten onder de stroomsn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk, de karakterisering van EG kruispunten en F-actine cytoskelet distributie en de kwantitatieve metingen van EG [Ca2 +] i en NO-productie met behulp van een microfluïdische apparaat. Geperfundeerde microfluïdische apparaat verschaft een in vitro model dat een getrouwe simulatie van de in vivo microvasculaire geometrieën afschuiving stroomomstandigheden toelaat. Sinds...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen of conflicterende belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL56237, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 en EPS-1003907).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ATPSigma-AldrichA2383
AcetoneFisher ScientificA929
Biopsy punchMiltex33-31 AA
Bovine AlbuminMP Biomedicals810014
Bovine Brain Extract (BBE)LonzaCC-4098
Cover-slipFisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary AntibodyLife technologiesA-11055
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-250
DRAQ5 (nuclei staining) Cell Signaling Technology4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Fetal Bovine SerumGibco16000-044
FibronectinGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml)Gibco15750-078
Glass coverslipFisher Scientific12-548B
Glass Pasteur pippetteVWR14672
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES Buffered Saline SolutionLonzaCC-5024
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)LonzaCC-2517
Isopropyl alcohol (IPA)VWR89125
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4.6 mM)Fisher ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM)Fisher ScientificM63-500
Glucose (5.5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5.0 mM)Fisher ScientificS233-500
Hepes Salt (9.1 mM)Research Organics6007H
Hepes Acid (10.9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Culture MediumLife technologies10372-019
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
Phalloidin (F-actin staining)Sigma-AldrichP1951
Phosphate Buffered Saline Life technologies14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
ScalpelExel Int29552
Scotch tape3M34-8711-3070-3
Silicon waferVWR14672
SU-8 photoresistMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 developerMicroChemY020100
tissue culture flasksSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
Trypsin Neutralizer solutionGibcoR-002-100
Trypsin/EDTA Solution (TE)GibcoR-001-100
TubingCole-ParmerPTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiotechnologySC-6458
Name of EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Biosafety Laminar hoodNuAireNU-425 Class II, Type A2
CCD cameraHamamatsuORCA
Confocal microscopeLeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
HotplateWenescoHP-1212
IncubatorForma Scientific3110
Isotemp ovenBarnstead3608-5
Lithography benchKarl SussMA6 Contact Lithography
Optical microscopeNikonL200 ND & Diaphod 300
Shutter for the CCD cameraSutter InstrumentLambda 10-2
Plasma cleanerPVA TePla/Harrick plasmaM4L/PDC-32G
Spin coaterBrewer ScienceCee 200X
Syringe pump systemHarvard Apparatus703005
Name of SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
CAD softwareAutodeskAutoCAD 2015
CFD simulation softwareCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Images acquire and analyse for NO production Universal ImagingMetafluor

Referenties

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797(2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Endotheelcellenmicrofluïdisch apparaatschuifstroomcalcium-imagingconfocale microscopiefluorescentiemicroscopieVE-cadherine-kleuringATP-stimulatie
Ontwikkeling en karakterisering van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.