Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Samenvatting

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Samenvatting

Whole-cell patch-clamp is een elektrofysiologische techniek die de studie van de elektrische eigenschappen van een aanzienlijk deel van het neuron toelaat. In deze configuratie is de micropipet in nauw contact met de celmembraan, welke lekstroom nauwkeuriger ionische stroommetingen voorkomt en op basis waarvan voorheen de intracellulaire scherpe elektrode opnamemethode. Klassiek kunnen whole-cell opname worden uitgevoerd op neuronen in verschillende soorten preparaten, waaronder celkweekmodellen, gedissocieerd neuronen, neuronen in hersencoupes, en intact verdoofde of wakkere dieren. Samenvattend heeft deze techniek veel bijgedragen aan het begrip van passieve en actieve biofysische eigenschappen van exciteerbare cellen. Een groot voordeel van deze techniek is dat het voorziet in informatie over hoe specifieke manipulaties (bijvoorbeeld farmacologische, experimentator-geïnduceerde plasticiteit) kunnen specifieke neuronale functies of c veranderenhannels in real-time. Bovendien significante openstelling van het plasmamembraan kan de interne pipetoplossing vrij diffunderen in het cytoplasma, verschaffende middelen voor het inbrengen van geneesmiddelen, bijvoorbeeld agonisten of antagonisten van specifieke intracellulaire eiwitten en manipuleren van deze doelen zonder dat hun functie in naburige cellen. Dit artikel zal zich richten op whole-cell opname uitgevoerd op neuronen in de hersenen plakjes, een preparaat dat het voordeel van het opnemen van neuronen in relatief goed bewaard gebleven hersenen circuits, dat wil zeggen, in een fysiologisch relevante context heeft. Vooral in combinatie met geschikte farmacologie, deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de identificatie van specifieke neuroadaptations die zich na elk type ervaringen, zoals leren, blootstelling aan drugs en stress. Samengevat, whole-cell patch-clamp opnamen in de hersenen plakjes bieden middelen om te meten in ex vivo bereiding langdurige veranderingenin neuronale functies die zijn ontstaan ​​bij intacte dieren wakker.

Inleiding

De patch-clamp techniek elektrofysiologisch techniek die is ontwikkeld in de late jaren 1970 ^1,2, is een primair middel voor het bestuderen van enkele of meervoudige ionkanaal functioneert in levend weefsel. Van de verschillende patch configuraties die kunnen worden bereikt, whole-cell patch-clamp kan de studie van het elektrisch gedrag van een aanzienlijk deel van het neuron. Klassiek wordt deze techniek uitgevoerd in vitro hetzij hersencoupes, net losgemaakte neuronen, of celkweekmodellen ^3. Wanneer uitgevoerd op neuronen in hersencoupes Deze techniek biedt verschillende voordelen. Met name: (i) neuronen worden in relatief geconserveerde hersenen circuits die tot op zekere hoogte, en vergeleken met celkweek preparaten bieden een omgeving die fysiologisch relevant ^3. Hierdoor kunnen vastleggen vroeg of zelfs controle in real time, cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die worden geactiveerd door een soort acute pharmacologsche manipulaties - een tijdsresolutie die niet kunnen worden bereikt met behulp van klassieke in vivo omstandigheden; (ii) het vermogen om visueel hersengebieden te identificeren in de hersenen plakjes maakt hoge regionale specificiteit ³ zowel voor de hersenen regio bestudeerd en specifieke neuronen wanneer ze uiten fluorescerende markers; (iii) de toegang tot de intracellulaire ruimte van de cel door het openen van een aanzienlijk deel van het plasmamembraan (in tegenstelling tot het membraan doorboren met een scherp micropipet voor intracellulaire recordings) ^4. Op zijn beurt kan het gehalte of concentratie van specifieke ionen samenstellen van de interne oplossing worden gemodificeerd moleculaire doelwitten of cellulaire mechanismen kunnen worden bestudeerd onder verschillende condities. Bijvoorbeeld bij vaststelling whole-cell configuratie, een specifiek farmacologisch middel (bijvoorbeeld antagonisten) die men kan toevoegen aan de opname micropipet (patch pipet) oplossing direct verspreiden in het cytoplasma en borg staan ​​putative intracellulaire doelen zonder de doelfunctie in naburige cellen. Bovendien, vergeleken met scherpe micropipet opname, de grote opening aan het uiteinde van de patch clamp elektrode biedt lagere weerstand, minder tegenstrevers ruis, en dus betere elektrische naar het binnenste van de cel ^4. Merk echter op dat de grote opening bij de pipetpunt kan leiden tot cel dialyse, en daarmee het verlies van intracellulaire moleculaire machinerie die essentieel zijn voor de expressie van de biologische verschijnselen die worden bestudeerd ^5,6 zijn. In dit geval kan scherpe elektrode opnames meer geschikt. Dergelijke opnames nodig micropipetten met een porie die is veel kleiner dan die voor whole-cell opnames, waarbij de meeste van de ionenuitwisseling tussen intracellulaire ruimte en de interne pipetoplossing voorkomen.

Elke vorm van ervaring (acuut of chronisch), met inbegrip van het leren van ^7-10, de blootstelling aan drugs ^11,12, stress ^13,14, enz, kunnen diverse aspecten van neuronale functie in specifieke hersengebieden veranderen. Omdat deze veranderingen vereisen vaak tijd om te ontwikkelen (uren tot dagen), whole-cell opnames in hersenen plakjes zijn van dieren die een specifieke ervaring hebben ondergaan kunnen onderzoekers dergelijke veranderingen detecteren. In principe vele (zo niet alle) componenten die deelnemen in neuronale functies (bijvoorbeeld ligand-geactiveerde ionkanalen, voltage-gated ionkanalen, neurotransmitter transporters), en daardoor de hersenen circuit activiteit en gedrag kan worden gewijzigd door ervaring (ervaringsafhankelijke plasticiteit) ^10,15-17. Op het neuronale niveau, de hersenen circuit activiteit blijkt uit een constante interactie tussen synaptische (bijvoorbeeld glutamaat transmissie) en de intrinsieke cellulaire prikkelbaarheid factoren (bijvoorbeeld axosomato-dendritische ionkanalen: natrium, Na ^+, kalium, K ^+, en calcium, Ca ²⁺ ). Onder bepaalde voorwaarden het gebruik van groe-cell patch-clamp elektrofysiologische technieken, signaal veranderingen in het bijzonder afkomstig van de veranderingen in de synaptische versus intrinsieke prikkelbaarheid kan worden geïsoleerd.

Meestal wordt synaptische exciteerbaarheid vastgesteld met behulp van gehele-cel voltage-clamp techniek. Deze opname modus kan het meten van ionenstromen [bijvoorbeeld gemedieerd door α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptoren ( AMPA-receptoren) en N-methyl-D-asparaginezuur receptoren (NMDA-receptoren)] door het neuronale plasmamembraan terwijl de membraanpotentiaal op een ingestelde spanning. Hier, onderzoekers maken gebruik van interne micropipet oplossingen die cesium bevatten (Cs ^+), een brede blocker van K ⁺ kanalen (key intrinsieke prikkelbaarheid factoren). Bij de oprichting van whole-cell configuratie, zal de verspreiding van Cs ⁺ in de intracellulaire ruimte blok K ⁺ kanalen, en daarbij zal zowel een relatief efficiënte ruimte-klem en pre toestaanvent invloed van intrinsieke exciteerbaarheid factoren andere metingen. Space-clamp kwesties, dat wil zeggen, de moeilijkheid om voltage-clamp de gehele cel, ontstaan ​​bij het ​​opnemen van onregelmatig gevormde cellen (bijvoorbeeld neuronen), en in het bijzonder neuronen met een grote en complexe dendritische prieel ^18,19. Omdat somatische voltage clamp slecht controles spanning in de dendritische boom van neuronen worden verschillende aspecten van de dendritische elektrische signalen in studie vertekend in een dendritische afstand-afhankelijke manier. Gecombineerd met farmacologische hulpmiddelen zoals picrotoxine (gamma-aminoboterzuur, _{GABAA-receptorantagonist)} of kynureenzuur (breed blokker van glutamaatreceptoren) opgelost in extracellulaire oplossing (kunstmatige cerebrospinale vloeistof, ACSF), deze techniek kan de meting van glutamaat receptor respectievelijk GABA _A-R gemedieerde.

In tegenstelling, is de intrinsieke prikkelbaarheid gewoonlijk beoordeeld in de huidige-clamp opnamemodus.In tegenstelling tot voltage-clamp deze opnamestand maakt de meting van variaties in membraanpotentialen geïnduceerd door ionen stromen die door de neuronale plasmamembraan. Typisch wordt verandering intrinsieke exciteerbaarheid bepaald door veranderingen in het vermogen van neuronen actiepotentialen, die zowel Na ⁺ en K ⁺ kanalen vereist genereren. Dus bij het ​​uitvoeren stroom-clamp, micropipetten zijn gevuld met een interne oplossing die K ⁺ in plaats van Cs ⁺ bevat. Gecombineerd met farmacologische middelen die glutamaat en GABA blok _A-receptor gemedieerde opgelost in ACSF, deze experimentele ontwerp maakt de meting van de bijdrage van intrinsieke factoren (bijvoorbeeld K ⁺ kanalen) aan neuronale zonder besmetting door potentiële veranderingen in synaptische exciteerbaarheid factoren.

Dit artikel zal de fundamentele nodige procedurele stappen te beschrijven to (i) bereiden gezonde hersenen plakjes; (Ii) bereiken whole-cell configuratie, en (iii) toezien basisparameters synaptische en intrinsieke exciteerbaarheid beoordelen.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen van UT Southwestern Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurde uitgevoerd en werden gekozen om stress, ongemak en pijn die de proefdieren minimaliseren.

1. Oplossingen

Let op: Bereid micropipet interne oplossingen op voorhand. Voor de meeste elementaire experimentele doeleinden worden gebruikt, moeten twee soorten oplossingen volstaan: Cs ⁺ -gebaseerde en K ⁺ -gebaseerde oplossingen.

1. Gebruik Cs ⁺ -gebaseerde oplossingen (bv Cs ⁺ gluconaat oplossing, zie Materials) voor voltage-clamp experimenten. Bereiden bij kamertemperatuur.
   1. Bereid 117 mm Cs-Gluconate oplossing door het mengen van 4,62 g D-gluconzuur (~ 3,696 ml) met 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
   2. Voeg DDH ₂ O tot 90 ml en laat het evenwicht komen gedurende 30 minuten.
   3. Voeg de vaste ingrediënten (20 mM HEPES = 0,476 g; 0,4 mmol EGTA = 15,2 mg; 2,8 mm NaCl = 16,4 mg; 5 mM tetraethylammonium (TEA) Chloride = 83 mg).
   4. Voeg DDH ₂ O tot ~ 97 ml.
   5. Stel de pH van de oplossing met 50% CsOH tot 7,2-7,3.
   6. Controleer osmolariteit en corrigeer indien nodig met DDH ₂ O.
      Opmerking: Een goed aanbod is ~ 280-285 mOsm. 20 mOsm onder de osmolariteit van standaard ACSF (meestal 300 - - 310 mOsm, 300 mOsm in ons laboratorium) optimale osmolariteit moet 15 zijn. Osmolariteit kunnen variëren afhankelijk van oplossingen voor specifieke composities.
   7. Aliquot tot 1000 pl en bewaar bij -20 ° C of lager.
   8. Bereiden aliquot, bevriezen en voeg ATP / GTP de interne oplossing op de dag van opname.
      1. Voeg 64,63 mg ATP tot 10 mg GTP en los op in 637,11 ul van DDH ₂ O.
      2. Bereid 10 pi aliquots en bewaar bij -20 ° C of lager. Meng 100x elk aliquot met 1000 pi interne oplossing op de dag van het experiment. Zodra ATP / GTP toegevoegd aan de interne oplossing onderhouden op ijs ATP / GTP degradati voorkomenop.
2. Gebruik K ⁺ -gebaseerde oplossingen (bv K-Gluconate oplossing, zie Materials) voor zowel stroom- en voltage-clamp experimenten waarbij K ⁺ conductances blijven functioneel, zodat neuronale afvuren kan worden beoordeeld. Bereiden bij kamertemperatuur.
   1. Weeg alle materialen volgens de gewenste eindvolume. Voor het bereiden 90 ml oplossing, 120 mM K-gluconaat = 2,81 g; 20 mM KCl = 0,149 g; 10 mM HEPES = 0,238 g; 0,2 mM EGTA = 0,008 g; 2 mM _MgCl2 = 0,021 _g.
   2. Gebruik voldoende DDH ₂ O tot 90% van de uiteindelijke oplossing volume te bereiken. Dit moet ervoor zorgen dat er genoeg ruimte overblijft voor pH en osmolariteit aanpassing.
   3. Na het toevoegen van en het mengen van alle ingrediënten, zorg ervoor dat de oplossing helder is voor het meten van de pH.
   4. Terwijl steeds de oplossing roeren, breng de pH op 7,2-7,3 met behulp van K ⁺ hydroxide (KOH).
   5. Na het aanpassen van de pH, gebruik maken van de osmometer en adgewoon osmolariteit tot 280-285 mOsm.
      Let op: Optimale osmolariteit moet 15 zijn - 20 mOsm onder de osmolariteit van standaard ACSF (meestal 300-310 mOsm, 300 mOsm in ons laboratorium). Osmolariteit kunnen variëren afhankelijk van oplossingen voor specifieke composities.
   6. Aliquot tot 1000 pl en bewaar bij -20 ° C of lager.
   7. Voor te bereiden, portie, te bevriezen, en voeg ATP / GTP om de interne oplossing op de dag van de opname (zie stap 1.1.8).
3. Bereid 1 liter standaard ACSF (zie Materials).
   Let op: Wij gebruiken dit recept in ons laboratorium bij het opnemen van medium stekelige neuronen (MSN's) in de hersenen plakjes echter recepten kunnen verschillen tussen laboratoria, en daarom adviseren wij de experimentator gebruik maken van een recept dat routinematig wordt gebruikt bij het opnemen van de hersenen regio van belang .
4. Bereid de dissectie ACSF (snijden oplossing ~ 125 ml Opmerking:. Exacte hoeveelheid zal afhangen van de grootte van het snijden geplaatst zoals volledig de hersenen moet dompelen) voor gebruik bijstappen 2,2-2,8.
   1. Bereid 5 mM kynureenzuur in standaard ACSF (tot glutamaat-receptor geïnduceerde excitotoxische processen te blokkeren) in een voldoende volume om de hersenen onder te dompelen tijdens het snijden. Gebruik een ultrasoonapparaat te helpen bij het oplossen van de kynureenzuur.
      Opmerking: De lengte van sonicatie variabel volume en de hoeveelheid vaste stoffen in de oplossing. De oplossingen moet duidelijk zijn tegen het einde van het proces (ongeveer 1-2 min in onze voorwaarden).
   2. Afkoelen terwijl borrelen met 95% O _{2, 5%} CO2 gas in een emmer ijs totdat de temperatuur op 0 staat - 2 ° C.
5. Bereid ACSF voor opname.
   1. Neem 1 L standaard ACSF (of wat links van de oplossing bereid in stap 1,3) waaraan geschikte farmacologische middelen kunnen worden toegevoegd afhankelijk van de geplande experimenten.
      1. Voeg bijvoorbeeld 100 pm picrotoxine bij het opnemen van de prikkelende postsynaptische stromingen of potentials (EPSCs of EPSPS), glutamaat receptor antagonisten (kynurenic acid, 2 mM; of een combinatie van D-APV 50 uM met CNQX 10 uM) bij opname remmende postsynaptische stroom of potentialen (iPSCs of IPSPs) en zowel picrotoxine en glutamaat receptor antagonisten bij de beoordeling neuronale bij afwezigheid van invloeden van synaptische gebeurtenissen.

2. Slice Voorbereiding

1. Bouwen of verkrijgen van een stukje herstel kamer.
   Opmerking: Het principe van herstel kamer is eenvoudig en kan worden gemaakt in het laboratorium (figuur 1). Kort samengevat, de kamer een opslagruimte een mand wordt ingebracht om de hersenen plakjes op een niveau dat lager is dan het oppervlak van ACSF houden. Verschillende wetenschappelijke bedrijven verkopen ook slice terugwinkamers.
   1. Als voorbeeld, krijgen vier ringen (4-6 mm) (Figuur 1A, zijaanzicht, B, bovenaanzicht) van het snijden van een 30 cc spuit. Vervolgens lijm gestrekt netten (bijvoorbeeld gesneden uit een nylon hose) aan één zijde van de ringen aan de hersenen plakjes (Figuur 1B) vasthouden en lijm de ringen elkaar.
      Opmerking: Een lijmpistool kan worden gebruikt.
   2. Zodra de vier ringen gelijmd, lijm een gebogen gelijkbenig trapezium-vormige kunststof wand twee van de ringen (Figuur 1A en B) zuurstof de bellen van de herstellende hersenplakken (figuur 1C en D). Zoals getoond in figuur 1D, plaats een diffunderende zuurstof systeem (hier, een gasdispersiebuis) aan dezelfde zijde als de kunststof wanden.
2. Voorafgaand aan het snijden, oxygenaat (95% O _2/5% CO ₂₎ en af te koelen het snijden oplossing (zie stap 1.4) tot 0-2 ° C.
3. Vul het aangepaste recovery kamer met standaard ACSF bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de ACSF goed zuurstofrijk (20 - 30 min, kan variëren, afhankelijk van de kamer volume) voordat u plakjes in het herstel kamer. Zorg ervoor dat gasbellen niet in direct contact met de schijven of verstoren hen.
4. Line de vibratome ijs lade met ijs en vul met koud water, zodat een derde tot de helft van het snijden kamer wordt ondergedompeld. Plaats een zuurstof afgiftesysteem (bijv gasdiffunderende steen) en een temperatuursensor in het snijden kamer, zodat geen van beide voorwerp interfereert met het blad beweging of slice manipulatie zorgvuldig.
5. Bereid de dissectie gebied en de instrumenten die nodig zijn voor het onttrekken van de hersenen en het ontleden van de gewenste hersengebied.
   Opmerking: De precieze dissectie uitgevoerd zal afhangen van de specifieke regio hersenen bestudeerd als andere hersenstructuren vergt snijden op verschillende vlakken (bijvoorbeeld, coronaal, sagittaal of horizontale segmenten.).
   1. Plaats de volgende tools op een onderlegger: onthoofding schaar, scalpel, kleine rechte scherpe punt schaar, vat infusen pincet (of een chirurgisch instrument met een brede tip, zoals rongeurs, die meer geschikt is voor de rat schedels), gebogen hemostatische tang, tweezers, spatel, scheppen spatel, filter papier, petrischaaltje, enkele rand scheermesje en cyanoacrylaatlijm.
6. Wanneer de temperatuur op 0 staat - 2 ° C en breng het snijden oplossing voor het snijden kamer (buffer lade).
7. Verdoven van de muis in een verdroging kamer met behulp van isofluraan. Exacte hoeveelheid kan variëren afhankelijk van de grootte van de gebruikte kamer, maar een kleine schoenendoos tralies een paar druppels (~ 3-4). Laat de muis in de kooi tot immobiel rendered (reageert niet op stimuli tactiele, ongeveer 15 seconden voor de hier beschreven omstandigheden). Voer staart en voeten knijpen tests om ervoor te zorgen het dier is diep verdoofd en vervolgens onthoofden voordat het hart stopt met kloppen (verbetert de levensvatbaarheid van de cellen).
   Opmerking: Met de juiste rechtvaardiging, sommige laboratoria de machtiging om live onthoofding uit te voeren om zo veel mogelijk prikkelende processen te minimaliseren en te verbeteren levensvatbaarheid van de cellen te verkrijgen.
8. Voer de dissectie.
   Opmerking: De hersenen moetsnel gewonnen (<45 sec).
   1. Met behulp van de scalpel te snijden de oppervlakkige huid op de top van de schedel van rostraal naar caudaal.
   2. Schil de hoofdhuid aan weerszijden van de weg.
   3. Met behulp van kleine rechte scherpe punt schaar, knip de interparietal bord langs de lambdoïde hechting aan de kleine hersenen te verwijderen. Verwijder het achterhoofd bot.
   4. Met behulp van dezelfde schaar, knip de pijlnaad.
   5. Schuif het vat infusen pincet (of rongeurs als het breken van een rat schedel) onder elke pariëtale botten en trek naar de hersenen bloot te leggen.
   6. Met behulp van de gebogen hemostatische tang, knijp de voorhoofdsbeenderen om ze te breken, gebruik dan een pincet of het schip infusen tang om de gebroken botten te verwijderen. Snijd en verwijder de dura mater zo voorzichtig mogelijk als het kan interfereren met de dissectie.
   7. Schuif de spatel onder de hersenen en trek de hersenen uit de schedel te plaatsen in het snijden kamer (buffer lade) eerder gevuld met ijskoude ACSF. Laat de hersenenafkoelen 1-2 min.
   8. Bereid de dissectie platform door het invullen van een petrischaal met ijs en wat ijs water tot een grotere oppervlakte contact mogelijk te maken, dek het af met het deksel en plaats een papieren filter op de top. Bevochtig het filterpapier met koud ACSF.
   9. Zodra de hersenen is afgekoeld, plaats de hersenen op de met ijs gevulde petrischaal en snel de passende dissectie voor het verkrijgen van het gewenste vlak van snijden.
   10. Om sagittale plakken met de nucleus accumbens (NAC) te verkrijgen, gebruik dan een enkele rand scheermesje te snijden en verwijder de olfactorische knobbels en de kleine hersenen als ze zijn nog steeds aanwezig. Voer vervolgens een sagittale cut van 2-3 mm van de laterale rand van de rechter hersenhelft op het platte vlak dat zal worden gelijmd op het monster die plaat te verkrijgen (zie stap 2.8.11).
       Opmerking: Scherpe slechts 2-3 mm van de laterale rand van de halve bol zal het verzamelen van schijfjes met de NAC van beide hersenhelften mogelijk te maken. De geschikte dissectie hangthet hersengebied dat wordt onderzocht. Hier wordt de ontleding uitgevoerd zodat NAc neuronen kunnen worden opgenomen in sagittale hersencoupes.
   11. Snel lijm (met cyanoacrylaatlijm op het monster holdingsplaat) het platte snijoppervlak van de hersenen op de plaat volgens het gewenste vlak van snijden. Voor het verkrijgen van sagittale brain slices zie stap 2.8.10.
   12. Onmiddellijk plaats en zet het model die plaat in het snijden kamer, zodat de hersenen wordt gesneden rostro-caudaal (voor de veiligheid, het opzetten van de bladhouder alleen wanneer het monster plaat is bevestigd).
   13. Stel de vibratome met geschikte snijden parameters (parameters die worden gebruikt in het laboratorium voor de in Materials genoemd vibratome: snelheid 3-4, trillingen 9-10, en slice dikte van 250 pm).
   14. Bij het snijden, gebruik dan een plastic-bijgesneden overdracht pipet naar de hersenen plakjes aan het herstel kamer (bij RT) over te dragen (zie stap 2.3). Herstel kan variëren, afhankelijk van de neuronale type dat wordt onderzocht(Gewoonlijk 30-90 minuten).

3. Opname Micropipetten en Rig Voorbereiding

1. Zie de richtsnoeren van manuele de trekker gebruiker om de gewenste eigenschappen te verkrijgen micropipet.
   Opmerking: Voor MSN, maken we gebruik van een pipet weerstand reeks 3,2-4,0 MQ.
2. De zuurstof ACSF en de stroom naar 2 ml / min instellen. Vacuüm ACSF met een peristaltische pomp of vacuumleidingen in de faciliteit geïnstalleerd.
3. Schakel de perfusie besturing toestel en de temperatuurinstellingen aanpassen om de gewenste temperatuur te verkrijgen (bijvoorbeeld 31,8-32,2 ° C).
   Opmerking: De temperatuur stabiliteit hangt af van het hebben van zowel een constant ACSF niveau en een constante stroomsnelheid in de kamer. Aangezien verschillende biofysische eigenschappen van neuronen (bijvoorbeeld ingangsweerstand, _Ri, ook wel membraanweerstand, _Rm) temperatuurgevoelige handhaving van een stabiele temperatuur belangrijk.
4. Schakel de compu-Ter gecontroleerde versterker, camera, micromanipulator en microscoop achtergrond licht. Als uitvoeren van een experiment dat elektrische stimulatie van het weefsel vereist, zet stimulus controller en de isolatie-eenheid.
   Opmerking: Sommige versterkers van andere fabrikanten raden een "warm-up" voor gebruik, dus het is aangeraden om de handleiding te raadplegen voor de exacte werkwijze.
5. Start camera vast te leggen, signaal acquisitie en versterker software.
6. Slice Plaatsing en visualisatie:
   1. Met behulp van een plastic getrimd-tip overdracht pipet voorzichtig tekenen in één brein slice van het herstel kamer.
   2. Plaats de overdracht pipet in de opname kamer en knijp het segment van de pipet op de dekglaasje langs de bodem van de kamer.
      Opmerking: Zolang er geen overloop optreedt, is het onschadelijk voor sommige ACSF van het herstel kamer morsen in het bad te hebben.
   3. Tang om de positie van het segment s wijzigeno het gewenste gebied precies in het midden van de opname kamer worden geplaatst. Gebruik de microscoop laag vermogen (4x) objectief en het oculair voor hulp bij het positioneren.
   4. Nadat de gewenste positie is bereikt, zet de hersenen slice positie met een schijfje vasthoudelement (ook bekend als een "harp") in de kamer.
   5. Schakel over naar een hoog vermogen (40X) objectief en laat deze voorzichtig totdat contact wordt gevormd met de ACSF in de kamer.
   6. Gebruik de fijnafstelling wiel om het weefsel in beeld te brengen. Terwijl in contact met ACSF, niet de grofinstelling wieltje op de microscoop het verlagen van de objectieflens overmatig kan het segment verbrijzelen of breken dekglas langs de bodem van de kamer, die kunnen leiden ACSF morsen op de condensor en beschadigen.
   7. Wanneer de focus op weefsel niveau en observeert de cellen in de beoogde regio voor staat. Dode cellen zijn gemakkelijk herkenbaar door hun zwol plasmamembraan en de kern ( Figuur 1E). Gezonde cellen moeten verschijnen als rond, eivormig of elliptisch homogene structuren (figuur 1E).
   8. Kijk voor een doelcel. Markeren op het computerscherm om te helpen de opname micropipet. Bij gebruik van software zoals QCapture, teken een vierkant rond het doel cel door de linker muisklik.
   9. Breng de objectieflens, zodat er voldoende ruimte in de kegel gevormd door de objectieflens in contact met ACSF te plaatsen en verplaatsen de opname micropipet is.
7. Micropipet plaatsing en positionering
   1. Met behulp van een 1 ml spuit, een niet-metalen micro-naald, en een speciale filter, vul een micropipet met de interne oplossing voorbereid op basis van de geplande experiment (K ⁺ -gebaseerde of Cs ⁺ gebaseerde interne oplossing, zie stap 1.1., 1.2 en Materialen voor compositie). Gebruik voldoende oplossing, zodat de interneoplossing in contact komt met de chloride-gecoate zilverdraad elektrode in de micropipet houder.
      Opmerking: De zilveren draad elektrode kan worden gechloreerd door het weken in bleekwater. Nucleoside trifosfaten (ATP en GTP) tot een interne oplossing vóór gebruik worden toegevoegd. Houd de spuit met de oplossing op ijs ATP / GTP degradatie te voorkomen.
   2. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micropipet als ze kunnen komen, terwijl de micropipet is in het weefsel en obscure de snee.
   3. Plaats de micropipet in de elektrodehouder Hierdoor wordt de oplossing in contact komt met het zilverchloride beklede draadelektrode.
   4. Draai de pipet dop zodat de kegel ring een afdichting rond de micropipet zal vormen.
   5. Solliciteer positieve druk voor het onderdompelen van de micropipet in de ACSF om te voorkomen dat vuil uit het invoeren van de pipet.
   6. Plaats de headstage in de vergrendelde positie (tegenover de kamer), en met behulp van de micromanipulator, gHANDLEIDING beneden naar de kamer zodat het ongeveer onder het midden van de ondergedompelde doel.
   7. Terwijl u de micropipet met de micromanipulator (ingesteld op gemiddelde tot hoge snelheid), gebruikt het scherm om de micropipet te lokaliseren en begeleiden hem naar de locatie van de cel op het XY-as.
   8. Meet de micropipet weerstand door een spanning stap (bijvoorbeeld 4 mV gedurende 100 msec), die met de hand of automatisch kan worden uitgevoerd via specifieke software zoals "bad" stand bij gebruik "Membraan Test" in Clampex software (zie ook stap 4) . Om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen of andere voorwerpen blokkeren de micropipet toepassing overdruk met de met lucht gevulde injectiespuit (bijvoorbeeld 30 cc spuit) die met de micropipet houder met polyethyleen buis.
   9. Na het wissen van de micropipet, voert een voltage offset pipet stroom tot nul te reduceren, die met de hand of via specifieke software zoals & # kan worden bewerkstelligd39; pipet offset 'op de computergestuurde versterker commandant.
      Opmerking: Deze functie zal compenseren voor eventuele spanning veroorzaakt door concentratie verschillen tussen het bad en de micropipet oplossingen (dat wil zeggen, vloeibare junction potentiële ^20).

4. Membraan Test

Opmerking: Deze stap is het in de genoemde materialen versterker.

1. Bij gebruik van een computergestuurde versterker commandant zet deze altijd voltage-clamp modus om het membraan uit te voeren.
   Opmerking: Als membraan test in "bad" mode, het membraan proef maakt de meting van de micropipet weerstand en de afdichting weerstand bij de afdichting wordt gevormd.
2. Zodra het membraan wordt verbroken (zie stap 5.8), schakelt het membraan test om "Cell" mode zodat serie weerstand (R _s) (ook wel toegang weerstand, R _a), R _i en membraan capaciteit (C _p) kanworden verkregen.

5. Final Approach, Seal Formation, en het verkrijgen van de Whole-cell configuratie

1. Met behulp van het scherpstellen wiel, gaan richten neer terwijl het geleidelijk verlagen van de micropipet. richten zich altijd eerst neer en laat de micropipet naar beneden op het vlak van focus. Dit zal ervoor zorgen dat de micropipet tip zal niet abrupt doordringen in de slice.
2. Wanneer de micropipet komt in contact met het oppervlak van de slice, vertragen de micromanipulator snelheid tot medium-low-modus.
3. Voorzichtig toe te passen licht positieve druk met de met lucht gevulde injectiespuit verbonden met de pipet houder om eventuele vuil van de aanpak pad vrij.
4. Nader de cel hetzij door afwisselend de XYZ knoppen of door diagonaal benaderen (als de micromanipulator model toelaat) waarin XZ beide assen worden gewijzigd met de rotatie van de Z-as te draaien. Laatstgenoemde methode verticale compressie van het weefsel te voorkomen.
   Let op: Hier is het de bedoelingom de cel te benaderen door het toebrengen van minimale schade aan het segment. Wanneer de micropipet dicht genoeg bij de cel een kuiltje verschijnt (ronde verkleuring van het celoppervlak door de positieve druk uitgeoefend langs de tip van de micropipet) (figuur 2).
5. Wanneer het kuiltje weergegeven (figuur 2-1), breng dan een zwakke en korte zuiging door de buis die is verbonden met de pipet houder zuigbuis teneinde de afdichting (figuur 2-2) te creëren. Houd toezicht op het membraan-test.
   Opmerking: als een gedeeltelijke afsluiting wordt gevormd (<1 GQ), het injecteren van negatieve stromen door het verlagen van de holding potentieel (op de computergestuurde versterker commander) kan de vorming van afdichting ( "gigaohm zegel" of "gigaseal" te vergemakkelijken en te bereiken gigaohms weerstand> 1 - 5 GQ). De hoge weerstand van de afdichting (> 1 GQ) zowel geluidsbelasting besmetting van het geregistreerde signaal en bijdragen aan de mechanische stabiliteit van depatch.
6. Terwijl een gigaseal vormt, gebruikt de computer-gestuurde versterker commandant de cel bedrijf potentieel zo dicht mogelijk bij fysiologische rustpotentiaal (V _rust) om plotselinge veranderingen te voorkomen wanneer het membraan wordt gescheurd brengen. Bijvoorbeeld, MSN's zijn meestal-spanning geklemd bij -70 of -80 mV (fysiologische V _rust: -70 tot -90 mV).
7. Nadat de gigaseal heeft gevormd, te compenseren voor snelle en langzame capaciteit handmatig of automatisch. Bij gebruik van een computergestuurde versterker commandant zoals Multiclamp commandant, drukt u op 'Auto' voor 'Cp Fast' en 'Cp Slow ".
8. Als de verzegeling stabiele en boven 1 GQ (of injecteren minder dan 10 - 20 pA de cel aan het gewenste membraanpotentiaal houden) blijft, breng dan een korte en sterke zuigkracht door dezelfde buis in 5,5 naar de plasmamembraan barsten (Figuur 2 -3).
   Let op: Dit kan verschillende proeven te nemen. Een goede membraan breuk wordt bereikt wkip zuigkracht sterk genoeg zodat gescheurde membraan de micropipet (wat kan leiden tot een verhoging van _Rs tijdens opname), maar zwak genoeg niet verstoppen zodat geen valse een groot deel van het membraan of de cel uitgevoerd.
9. Na het bereiken van een succesvolle whole-cell configuratie, regelmatig toezicht op de micropipet locatie om te beoordelen en te corrigeren voor significante drift als het kan leiden tot verlies van de patch. Drift amplitude kunnen variëren afhankelijk van verschillende factoren, bijvoorbeeld de kwaliteit van het tuig installatie en trekkrachten op de headstage. Idealiter drift nagenoeg onbestaande.
10. Door over te schakelen op "Cell" modus het membraan proef zien verschillende parameters van de cel zoals _{Ri, Rs} en _Cp. Monitor deze parameters tijdens het opnemen.
    Opmerking: Al deze parameters kunnen helpen beoordelen initiële gezondheidstoestand van de cellen en celtypen (zie "Membraan test" sectie, stap 4).
11. Zodra the bovenstaande stappen zijn voltooid, blijven in voltage-clamp-modus om stroom te meten (bijv EPSCs, iPSCs), of over te schakelen naar de huidige-clamp-modus als je van plan om veranderingen in de membraan spanning (bijv actiepotentiaal vuren) te meten. Voor deze laatste, injecteren zowel positief als negatief stroom naar de cel aan het gewenste membraan spanning houden (om deze stap uit te voeren, raadpleegt u de handleiding gids versterker).

Resultaten

Temperatuur, een factor die gemakkelijk wordt gecontroleerd door de experimentator, beïnvloedt de biofysische eigenschappen van ionkanalen en receptoren en daardoor de golfvorm van postsynaptische stroom (PSC) (EPSC en iPSCs) en het vermogen van neuronen pieken wekken. Figuur 3 en figuur 4 tonen het effect van temperatuur op neuronale en de helling van opgeroepen EPSCs (eEPSCs) respectievelijk. De reeks flitsen (Figuur 3) (dwz l...

Discussie

Dit protocol wordt de basisprocedure voor het uitvoeren whole-cell patch-clamp experimenten aan neuronen in hersencoupes. Echter, de complexiteit en mogelijke gevoeligheid van deze techniek kan niet worden volledig beschreven in dit artikel. Hier hebben we geprobeerd om de meest elementaire stappen af ​​te bakenen en onderstrepen belangrijke parameters die moeten worden gecontroleerd voor het bereiken van een succesvolle en strenge whole-cell opnames. Voor verdere theoretisch leren, hebben veel boeken en artikelen gepub...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate interne oplossing (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
K-Gluconate interne oplossing (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Standard kunstmatige hersenvocht (ACSF, osmolariteit ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4•H2O, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Aanvullende verbindingen gebruikt voor de bereiding van oplossingen
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375