Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID

Summary

Optische klaringstechnieken revolutioneren de manier waarop weefsels worden gevisualiseerd. In dit rapport beschrijven we aanpassingen van het oorspronkelijke Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol dat consistentere en goedkopere resultaten oplevert.

Abstract

Traditioneel vereiste de visualisatie van weefsel dat het weefsel van belang serieel werd gesneden en geïmageert, waardoor elke weefselsectie werd blootgesteld aan unieke niet-lineaire vervormingen, wat de mogelijkheid om cellulaire morfologie, verdeling en connectiviteit in het centrale zenuwstelsel (CZS) te evalueren aanzienlijk belemmerden. Echter, optische clearing-technieken veranderen de manier waarop weefsels worden gevisualiseerd. Deze benaderingen maken het mogelijk om diep in intacte orgaanpreparaten te onderzoeken, wat een enorme inzicht biedt in de structurele organisatie van weefsels bij gezondheid en ziekte. Technieken zoals Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) bereiken dit doel door een matrix te bieden die belangrijke biomoleculen bindt terwijl het lichtverstrooiende lipiden vrij laat diffunderen. Lipideverwijdering, gevolgd door brekingsindex aanpassing, maakt het weefsel transparant en gemakkelijk in 3 dimensies (3D) te beeldvormen. Niettemin kan de elektroforetische weefselclearing (ETC) die in het oorspronkelijke CLARITY-protocol werd gebruikt, uitdagend zijn om succesvol te implementeren en het gebruik van een gepatenteerde brekingsindex aanpassingsoplossing maakt het duur om de techniek routinematig te gebruiken. Dit rapport toont de implementatie van een eenvoudig en goedkoop optisch clearing-protocol dat passieve CLARITY voor verbeterde weefselintegriteit combineert met 2,2′-thiodiethanol (TDE), een eerder beschreven brekingsindex aanpassingsoplossing.

Introduction

De mogelijkheid om volledige neuroanatomische structuren te beeldvormen is ontzettend waardevol voor het begrijpen van de hersenen bij gezondheid en ziekte. Traditioneel heeft 3D-beeldvorming weefselsneden vereist om de axiale resolutie te bieden en om diepe anatomische structuren te visualiseren. Deze benadering kan hoge resolutie data sets produceren, maar vereist geavanceerde beeldreconstructietechnieken en is zeer arbeidsintensief. Als gevolg hiervan is het beperkt gebleven tot het beeldvormen van kleine weefselvolumes^1-3. Optisch sectioeneren daarentegen is goed geschikt voor het creëren van hoge resolutie 3D-beelden van fluorescent gelabelde weefsels. Omdat optisch sectioeneren van nature driedimensionaal is, is er geen uitgebreide berekening nodig om een 3D-beeldvolume te produceren. Echter, lichtverstrooiing en weefselopaciteit beperken de diepte waarop weefsels optisch kunnen worden gesneden. De diepte van de beeldvorming is beperkt tot ongeveer 150 µm in laser scanning confocale microscopie en tot minder dan 800 µm met behulp van twee-foton excitatie microscopie^4-8.

Om deze beperkingen te overwinnen, zijn er recent verschillende optische clearingtechnieken ontwikkeld en vervolgens verder verfijnd om het diepe microscopische beeldvormen van intacte weefsels mogelijk te maken. Het gebruik van benzylalcohol en benzylbenzoaat (BABB) om vaste weefsels transparant te maken was een van de vroegste benaderingen⁹. Deze benadering werd echter beperkt door het blussen van fluorescentie in de monsters en onvolledige clearing van sterk gemyeliniseerde structuren¹⁰. Verfijningen van deze techniek, zoals 3D Imaging of Solvent Cleared Organs (3DISCO), hebben geleid tot zeer snelle en complete weefselclearing, maar lijden nog steeds aan snel verlies van fluorescente signalen, vooral geel fluorescent eiwit (YFP)¹⁰. Op water gebaseerde clearingoplossingen, zoals Sca/e¹¹ en SeeDB¹², behouden fluorescente signalen, maar maken niet volledig zeer gemyeliniseerde weefsels helder. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) is een veelbelovende nieuwe optische clearingtechnologie die de beperkingen van eerder ontwikkelde op water gebaseerde clearingoplossingen lijkt te overwinnen¹³. In tegenstelling tot andere optische clearingtechnieken, begraaft Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)¹⁴ de hersenen in een poreuze matrix die structurele integriteit biedt aan eiwitten, nucleïnezuren en kleine moleculen, terwijl lipiden vrijblijvend zijn. De lipiden worden vervolgens elektroforetisch verwijderd, resulterend in een optisch heldere hersenen die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en even gemakkelijk kunnen worden onderzocht met behulp van algemeen beschikbare technieken.

Elektroforetische weefselclearing (ETC) wordt gebruikt om lipiden te verwijderen uit hydrogel ingebedde weefsels in CLARITY, maar ETC kan moeilijk consistent worden geïmplementeerd en weefsels die onderworpen zijn aan elektroforese kunnen weefselvervorming, bruining, verlies van fluorescentie en antilichaamreactiviteit vertonen. Passieve lipidclearing vermijdt deze beperkingen, maar vereist langere clearingtijden^15-17. Passieve clearing maakt ook het clearing van grote aantallen monsters parallel mogelijk, omdat het niet beperkt is door het aantal beschikbare ETC-apparaten. Het verlagen van de concentratie paraformaldehyde en het uitsluiten van bis-acrylamide uit de hydrogel hebben geleid tot grote toenames in de clearingsnelheid ten koste van grotere weefselexpansie¹⁶. Minder dure alternatieven voor de brekingsindex aanpassende oplossing die in de originele CLARITY-techniek wordt gebruikt, zijn ontwikkeld^17-19. 2,2'-thiodiethanol (TDE) is een goedkope en snelle hersenclearing middel die een deel van de weefselexpansie die optreedt tijdens lipidverwijdering ongedaan maakt¹⁸. Dit rapport bevat passieve clearing van hydrogel ingebed weefsel en het gebruik van TDE als een brekingsindex aanpassende oplossing tot de originele CLARITY-techniek om een zeer reproduceerbaar en goedkoop protocol te produceren voor de optische clearing van het centrale zenuwstelsel van de muis.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Institutional Animal Care en gebruik Committee (IACUC) richtlijnen. Thy1-YFP, PLP-EGFP en PV-TdTomato muizen werden gebruikt voor deze experimenten, maar alle muizen die fluorescerende eiwitten kunnen met succes worden gewist en afgebeeld.

1. Tissue Voorbereiding

Let op: paraformaldehyde (PFA) en acrylamide zijn giftig en irriterende stoffen. Voer experimenten gebruik te maken van deze reagentia in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).

1. Offer het dier euthanasie kamer met ~ 1 ml isofluraan totdat de ademhaling ophoudt (~ 2 - 3 min).
2. Gebruik een peristaltische pomp ingesteld op ~ 5 ml / min intracardiaal perfuseren de muis met perfusievloeistof (tabel 1) bij 4 ° C totdat het bloed wordt geklaard uit de weefsels (5-10 min).
3. Verander het perfusaat te fixatief (tabel 1)bij 4 ° C totdat de nek en de staart zijn aanzienlijk verstijfd (5-10 min).
4. Beëindig de perfusie en onthoofden het dier. Ontleden voorzichtig uit de hersenen van de schedel door eerst het bindweefsel rond de schedel te verwijderen en vervolgens het verwijderen van bot uit het ventrale oppervlak van de schedel en het opheffen van de hersenen uit (figuur 1a), zoals beschreven in ^20.
   Let op: Geef speciale aandacht aan het verwijderen van het bot rond de flocculonodular lobben van het cerebellum en de olfactorische bollen.
   1. Ontleden het ruggenmerg van de wervelkolom door voorzichtig de tip van een fijne, scherpe schaar tussen het ruggenmerg en de wervelkolom en het snijden van de afzonderlijke segmenten wervelkolom verwijderd, zoals beschreven in ^21.
5. Hemisect de hersenen door het in een plastic muizenhersenen matrix en snijden langs de middellijn met een matrix mes.
6. Voeg elk halfrond en het ruggenmerg tot 50 ml scheiden centrifuge tubes met ~ 40 ml hydrogel oplossing (Tabel 1). Vanaf dit punt hebben betrekking op de buizen met aluminiumfolie om de fluoroforen beschermen tijdens alle verdere stappen.
7. Incubeer de buis met het monster in hydrogel bij 4 ° C onder zacht schudden (~ 30 rpm) gedurende 7 dagen.

2. polymerisatie

1. Gooi ~ 25 ml hydrogel behoud van de monster en ~ 25 ml hydrogel in de centrifugebuis.
2. Deoxygenate het monster door het verwijderen van de kap en het plaatsen van de centrifugebuis in exsiccator pot en het verbinden van de pot om een ​​vacuüm. Onder vacuüm gedurende ten minste 10 minuten om opgeloste gassen uit de oplossing toe en blaasvorming komen. Schud om de bubbels te verwijderen.
3. Vervang het vacuüm in de exsiccator pot met 100% stikstof gas over 2-3 min. Wanneer de druk egaliseert (eenmaal boven de exsiccator pot kan worden geopend) snel dop op de buis naar de herinvoering van zuurstof te voorkomen.
4. Polymeerize de hydrogel door het plaatsen van de buis met het monster in een 37 ° C waterbad gedurende 3 uur totdat de polymerisatie is voltooid. Gepolymeriseerde hydrogel zal een gelachtige consistentie (figuur 1b) nemen. Opmerking: Een kleine hoeveelheid gepolymeriseerde hydrogel boven aanvaardbaar.
5. Gebruik een spatel om de gepolymeriseerde monster uit de centrifugebuis te verwijderen, dan weggesneden het overtollige hydrogel uit het monster.
6. Verwijder het resterende hydrogel door het plaatsen van het monster op een pluisvrije wissen en zachtjes wrijven en slingeren van het weefsel op, met achterlating van slechts een dunne laag gepolymeriseerde hydrogel op het monster.

3. Lipid Removal

Opmerking:-Lipid ontruimd weefsel is breekbaar, voorzichtig behandelen. Gebruik een cel zeef bij het aftappen van de buis om te voorkomen dat monster. Ook zal de monster zwellen gedurende het zuiveringsproces echter zwelling kan worden omgekeerd tijdens de brekingsindex matching proces.

Let op: Sodium dodecylsulfaat (SDS) en boorzuur zijn irriterende stoffen. Experimenten uitvoeren met behulp van hen in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).

1. Transfer gepolymeriseerde monster een schone centrifugebuis van 50 ml en voeg 45 ml clearing buffer (Tabel 1). Incubeer bij 45 ° C onder zachtjes schudden (~ 30 rpm). Verander de buffer dagelijks voor een eerste 7 dagen door het gieten van de gebruikte clearing buffer in chemisch afval en het toevoegen van ~ 45 ml vers clearing buffer. Houd de centrifugebuizen die de betrokken in aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming monsters.
2. Na de eerste 7 dagen incuberen van het monster bij 40 ° C en uitwisseling clearing buffer per 2-3 dagen. Doorgaan clearing totdat alle vetten zijn oplosbaar en weefsel bereikt transparantie (figuur 1c). Dit zal 4-6 weken voor een muis hersenhelft en 2-4 weken voor een ruggenmerg.
3. Zodra weefsel wordt gewist, de overdrachtmonster een nieuwe 50 ml centrifugebuis en was 4 keer in PBST (tabel 1) bij 40 ° C onder zacht schudden (~ 30 rpm) gedurende 24 uur om residueel SDS te verwijderen.

4. Moleculaire kleuring

Let op: 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) is een irriterend en geen experimenten met behulp van het moet worden uitgevoerd in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).

1. Breng het monster een schone 15 ml centrifugebuis en vul met 1 ug / ml DAPI in 1x PBST, pH 7,5. Incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende 24 uur. Houd de centrifugebuizen die de betrokken in aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming monsters.
2. Was 3 keer in PBST bij KT gedurende tenminste 6 uur / was.

5. Refractive Index Matching

Let op: 2,2-thiodiethanol (TDE) is een irriterend en geen experimenten gebruik te maken van deze should worden uitgevoerd in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).

1. Breng het monster een schone 15 ml centrifugebuis en vul met 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubeer bij 40 ° C onder zacht schudden (~ 30 rpm) gedurende 24 uur.
2. Exchange 30% TDE met 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubeer bij 40 ° C onder zacht schudden gedurende 24 uur.
   Opmerking: De sample wordt weer krimpen tot ongeveer oorspronkelijke grootte.
3. Op een vlak, schoon oppervlak gooit stuk herbruikbare kleefstof in een cilinder met uniforme diameter net iets groter dan de dikte van het monster.
4. Leg de herbruikbare kleeflaag cilinder in een open cirkel (~ 25 mm inwendige diameter met een kleine opening aan de bovenkant) op een 40 mm glazen bodem schaal. Als correcties moeten worden gemaakt, verwijdert u de cilinder van het glas en gesneden met een scheermesje.
5. Gebruik een P1000 pipet tip om een ​​afdichting tussen de herbruikbare lijm en glas te creëren doorrollen rond de buitenste rand van de cilinder.
6. Plaats ~ 100 ul 63% TDE op de glazen schaal verspreid over het glasoppervlak in de cirkel van herbruikbare kleefstof omvatten.
7. Met behulp van een spatel voorzichtig plaatst het monster in het midden van de cirkel, zorg niet om bellen te vormen.
8. Pipet nog eens 100 ul van 63% TDE direct op het monster, dan meteen plaats een 40 mm ronde deksel glas over de herbruikbare kleeflaag.
9. De index, midden en ringvinger van beide handen voorzichtig op rond de omtrek van de cirkel tot het dekglas contact met het monster gemaakt.
10. Langzaam breng de glazen onderste schaal rechtop rusten tegen een oppervlak, voeg 63% TDE met een pipet totdat de oplossing de kleine opening aan de top bereikt. Gebruik een pluisvrije doekje om drogen van de pipetpunt zodat de oplossing druipt niet op het glas. Om te bellen in de kamer te vermijden, nooit leeg de pipet helemaal.
11. naarde kleine opening, voeg silicium elastomeer om de cirkel omsluiten en een gesloten kamer. Wacht 5 minuten tot het droog is voor de beeldvorming.

6. Microscopie

Let op: De lasers gebruikt in confocale, enkel vlak verlichting en licht blad microscopie zijn zeer krachtig en kan blindheid veroorzaken. Elke experimenten met behulp van lasers moet worden uitgevoerd na uitgebreide training en met grote voorzichtigheid en passende oogbescherming.

1. Plaats de beeldvorming kamer met het monster binnen op het stadium van een laser scanning confocale microscoop.
2. Open de imaging software (zie tabel of Materials). Voor het inschakelen van de argon excitatie laser, klikt u op het tabblad configuratie aan de bovenkant van het programma op het pictogram laser. Vink het vakje aan naast argon aan het laservermogen en beweeg de schuif schaal tot 30%. Neem de aanwijzer langzaam opwarmen naar de geselecteerde positie.
   1. Terug naar het tabblad verwerven aan de top. In de grote doos "Beam Path Instellingen &# 34; ga naar het laden / opslaan instelling en selecteer het drop down menu om een ​​geschikte golflengte kanaal om het YFP (527 nm) te selecteren.
3. Kies passende doelstellingen voor de beeldvorming door het lokaliseren van de rode link met het label "doelstelling: huidige object" onder het vak kanaal instellingen. Door te klikken op de tab opent alle beschikbare doelstellingen en een selectie wordt automatisch roteren het torentje.
   1. Gebruik doelstellingen (bijv., 10X) met een grote werkafstand (groter dan de dikte van het weefsel af te beelden, bijvoorbeeld 11 mm) en een grote numerieke apertuur (bijv., 0,3) te maximaliseren in het vlak beeldresolutie minimaliseren optische sectie dikte.
4. Op de linker kolom van de drop-down menu's, open de "XY: de resolutie" window acquisitie matrix ingesteld, genaamd "format", tot 1024 x 1024 of een waarde die geschikt is voor de laterale resolutie limiet van de doelstelling. Stel de zoomfactor zo laag mogelijk (bijv., 10,7).
5. In hetzelfde venster, set 8 lijn gemiddelde en 1 beeld gemiddelde parameters die door de individueel gelabelde menu's dienovereenkomstig te laten vallen naar beneden. Met grote waarden voor een hoge signaal-ruisverhouding en lage waarden voor snelle acquisitie.
   Opmerking: 8 lijn gemiddelden en 1 beeld gemiddelde zal afbeeldingen van hoge kwaliteit van een muis hersenhelft te verwerven in ongeveer 4 uur.
6. Zoek het monster met behulp van het podium controles. Zodra een vertegenwoordiger veld zichtbaar is, stellen de gain en offset.
   Opmerking: De versterking en offset aanzienlijk variëren, afhankelijk van het weefseltype, fluoroforen en / of anatomische functie af te beelden. Voor YFP, ingestelde waarden 760-780 voor de winst en van -1,0 naar -1,5 voor de offset.
7. Selecteer "tegel scan" en selecteer de grenzen van de regio van belang. Stel de boven- en ondergrenzen van de z-stack te verwerven. Stel de dikte van de optische sectie op basis van optische gedeelte resolutie beperking van de doelstelling van.
   Opmerking: Een objectieve'soptische gedeelte resolutie limiet wordt bepaald in de eerste plaats door zijn numerieke lensopening. De meeste microscoop control software berekent automatisch een waarde die geschikt is voor het doel wordt gebruikt. Een 10X objectief met een numerieke apertuur van 0,3 die ongeveer 11 urn zou zijn.
8. Start de overname.
   Opmerking: Dit kan meerdere uren in beslag nemen.
9. Verzamel hogere resolutie beelden met behulp van een hogere vergroting doelstellingen van specifieke gebieden van belang.

Results

Visualiseren van de structurele organisatie van de hersenen is van cruciaal belang om te begrijpen hoe de morfologie en connectiviteit beïnvloeden hersenfunctie in gezondheid en ziekte. Optische clearing technieken maken het mogelijk om de afbeelding celpopulaties in 3D in intacte weefsels, waardoor wij de morfologie en connectiviteit in samenhang te bestuderen.

Muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie gedreven door pr...

Discussion

Passieve clearing hydrogel ingebedde weefsels (passief CLARITY) is een eenvoudige en goedkope werkwijze voor het opruimen van grote stukken weefsel. Deze benadering vereist geen speciale apparatuur en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een thermisch geïsoleerde shaker. Over de tijdspanne van een paar weken, zelfs grote, sterk gemyeliniseerde weefsel, zoals een gehele hersenen of het ruggenmerg, wordt transparant en geschikt voor microscopie worden. Hoewel dit verslag was gericht op het opruimen van CNS weefsels, kan p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x phosphate buffered saline (PBS)	Fisher	BP399-1	buffers
32% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15714-5	perfusie en hydrogel
2,2'-thiodiethanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	oplossing voor brekingsindex aanpassing
40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140	hydrogel
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142	hydrogel
VA-044 initiator	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	hydrogel
Boorzuur	Sigma-Aldrich	B7901	clearing buffer
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Fisher	BP166-5	clearing buffer
Natriumhydroxide	Fisher	55255-1	buffers
Natriumazid	Sigma-Aldrich	52002-100G	conserveermiddel
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	buffers
Heparine	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusie
Natriumnitraat	Fisher	BP360-500	perfusie
DAPI	Molecular Probes	D1306	nucleaire kleurstof
99,9% isofluraan	Phoenix	57319-559-06	anestheticum
Zoutzuur	Fisher	A1445-500	buffers
Glazen bodemschaal	Willco	HBSB-5040	Willco schalen
Herbruikbaar plakmiddel	Bostick	371351	Blu-Tack
Siliconen elastomeer	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Lintvrije doek	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Muis hersenmatrix	Roboz	SA-2175	weefsel segmentering
Matrix mesjes	Roboz	RS-9887	weefsel segmentering
Peristaltiekpomp	Cole-Parmer	77122-24	perfusie
Laser-scanning confocale microscoop	Leica	SP5	microscopie
Beeldvormingssoftware	Leica	LAS AF	microscopie