Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54026

⸱

9 juni 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

In dit artikel

Samenvatting

Van patiënten afgeleide xenografts van glioblastoma multiforme kunnen worden geminiaturiseerd tot levende microtumoren met behulp van een 3D-menselijke biogel-kweeksysteem. Deze in vivo-achtige 3D-tumortest is geschikt voor het testen van de reactie op geneesmiddelen en moleculair profileren, inclusief kinoomanalyse.

Samenvatting

Het gebruik van op patiënten gebaseerde xenotransplantaten voor het modelleren van kanker heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de kankerbiologie en medicijnresponsiviteit. Ze zijn echter tijdrovend, duur en arbeidsintensief. Om deze obstakels te overwinnen, hebben veel onderzoeksgroepen zich toegekeerd tot sferoïde culturen van kankercellen. Hoewel nuttig, repliceren tumor sferoïds of aggregaten niet de cel-matrix interacties zoals gevonden in vivo. Derhalve bieden driedimensionale (3D) kweekbenaderingen met behulp van een extracellulair matrixscaffold een realistischer modelsysteem voor onderzoek. Beginnend met subcutane of intracraniale xenotransplantaten, wordt tumorweefsel gedissocieerd in een enkele cel suspensie vergelijkbaar met kanker stamcel neurosferen. Deze cellen worden vervolgens ingebed in een humaan-afgeleid extracellulair matrix, 3D humaan biogel, om een groot aantal microtumoren te genereren. Interessant is dat microtumoren ongeveer een maand kunnen worden gekweekt met hoge levensvatbaarheid en kunnen worden gebruikt voor het testen van medicijnresponsiviteit met behulp van standaard cytotoxiciteitsassays zoals 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) en levend celbeeldvorming met behulp van Calcein-AM. Bovendien kunnen ze worden geanalyseerd via immunohistologie of geoogst voor moleculair profilering, zoals array-gebaseerde high-throughput kinoom profilering, wat hier ook wordt beschreven. 3D microtumoren vertegenwoordigen dus een veelzijdig high-throughput modelsysteem dat de in vivo tumor biologie dichter kan repliceren dan traditionele benaderingen.

Inleiding

De meest voorkomende primaire intracraniële kwaadaardige hersentumoren zijn rang III astrocytomen en graad IV glioblastoma multiforme (glioblastoma of GBM). Deze tumoren bieden slechte prognose met een mediane één-jaars overleving tussen 12-15 maanden met de huidige therapieën voor GBM in de VS 1-3. Multimodaliteit behandelingen omvatten chirurgie, bestraling en chemotherapie waaronder temozolomide (TMZ) en-kinase gerichte agenten. Kinase signalering is vaak verstoord bij GBM, waaronder subgroepen van tumoren met amplificatie of activerende mutaties in het epidermale groeifactorreceptor (EGFR), verhogingen Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) signalering, verhoogde fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) en tumor ondersteunen angiogene signalering door middel Vasculaire Endotheliale groei Factor receptor (VEGFR) en andere kinase pathways gedreven 4-6. Huidige in vitro en in vivo modellen vaak verliezen deze representatieve veranderingen 7. Daarnaast heeft genetische profielen niet aangeboden de verwachte voordelen kan het feit weerspiegelen dat genetische en epigenetische veranderingen wijzigingen niet altijd voorspellen op het niveau van eiwit activiteit, waar de meeste kinase richtende middelen direct werken, en wanneer therapieën met andere werkingsmechanismen kunnen fungeren indirect.

De traditionele geïmmortaliseerde cellijn die kan worden gepasseerd eindeloos is al lang de standaard voor drug tests om goede houdbaarheid en reproduceerbaarheid. Echter, dit model lijdt aan een hoge nutriënt (en kunstmatige) groei omgeving die kiest voor het snel groeiende cellen die sterk afwijken van de oorspronkelijke tumor. Als zodanig is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling realistischer modelsystemen die een complexere tumor biologisch systeem reflecteren zoals aanwezig in de patiënt is. Tumorxenograften direct ontwikkeld van een primaire tumor gegroeid in muizen ( "xenoline," patiënt afgeleide xenograft of PDX) provide een reflectief modelsysteem, met name in de context van kanker therapeutica, zoals zij geacht worden klinisch succes meer betrouwbare voorspelling. 8 Ondanks een reflecterende biologie, deze modellen zijn duur en zijn moeilijk vast te stellen en te onderhouden. Bovendien zijn zij niet vatbaar zijn voor high-throughput studies. De noodzaak om biologische modellen die een betere weerspiegeling van moleculaire veranderingen in de primaire tumoren, en naar het profiel en test deze modellen met behulp van directe metingen van kinase-activiteit, niet surrogaat genetische merkers beter te ontwikkelen, is duidelijk.

Het is algemeen bekend dat in tegenstelling tot tweedimensionale (2D) monolaag culturen, 3D of meercellige assay modellen kunnen meer fysiologisch bieden relevante eindpunten 9-11. Common 3D cultuur benaderingen betrekken-matrix gecoate microdragers en de vorming cel sferoïde. Bolvormige tumoren kunnen worden gegenereerd via cellulaire aggregatie met behulp van centrifugekolf, pHEMA bord en opknoping druppel technieken. Beperkingen voor teze benaderingen omvatten: de onmogelijkheid voor een aantal cellen om stabiele sferoïden, variabiliteit in de groei en uitdagingen met gemengde celtypen te vormen. Als alternatief, vele synthetische (hydrogel, polymeer) en dierlijke-afgeleide Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix van muis sarcomen, runder collageen) matrices zijn ontwikkeld voor 3D-cultuur bestudeert 12-14. Muis EHS matrix wordt uitgebreid gebruikt maar bekende celgroei en differentiatie bevorderen in vitro en in vivo 15.

Om 3D tumorbiologie repliceren, werd een menselijke biomatrix ontwikkeld door Dr. Raj Singh et al. 16. De natuurlijke, groeifactor-vrij mens Biogel maakt 3D-cultuur steigers (kralen, schijven), die op lange termijn de teelt van meerdere celtypen te ondersteunen. Een reeks 3D menselijke Biogel cultuur ontwerpen worden vastgesteld voor het bestuderen van tumorgroei, adhesie, angiogenese en invasie eigenschappen. Voordelen en eigenschappen van menselijke Biogel vergeleken met gewonemuis EHS gels worden samengevat in tabel 1 en tabel 2.

Bron: Human Amnions (Pooled weefsel)
Pathogeen-vrij, IRB-vrijgestelde / goedgekeurde
ECM natuur: Niet-gedenatureerde Biogel (GLP-productie)
sleutel
componenten: 		Col-I (38%), laminine (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactine en HSPG (<3%)
GF-vrij: Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogene niet-toxisch)

Tabel 1: Eigenschappen van Human Biogel als Vergeleken met Common EHS Gels.

Human Biogel EHS gels
Natuurlijke menselijke matrix Opgeloste muis matrix
Gecontroleerde groei & differentiatie cel Kan bevorderen celgroei en differentiatie
Fysiologische genexpressie Variabele genexpressie
3D weefsel-achtige cultuur model -Plaat gebaseerde cultuur model

Tabel 2: Voordelen van Human Biogel als Vergeleken met Common EHS Gels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Alle xenograft therapie evaluaties werden uitgevoerd met behulp van een orthotope tumor model voor glioblastoma over een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. Isolatie van de patiënt afgeleide GBM Xenograft Cells

  1. Bereiding van reagentia
    1. Opnieuw vormen collagenase-I in steriel water tot een concentratie van 5 mg / ml en steriel filter. Opslag in 1 ml porties bij -20 ° C (eindconcentratie 50 ug / ml in 100 ml enzymoplossing).
    2. Oplossen 100 pg epidermale groeifactor (EGF) in 2 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren in 100 ui (5 ug / 100 ui) aliquots bij -20 ° C voor een eindconcentratie van 10 ng / ml.
    3. Oplossen 100 ug FGF-β in 2 ml steriele PBS. Bewaren in 100 ui (5 ug / 100 ui) aliquots bij -20 ° C voor een eindconcentratie van 10 ng / ml.
    4. Voeg de fles na een 500 ml Neurobasal Medbis (NBM) tot het volledig NBM bereiden: 10 ml B-27 supplement zonder vitamine A, 5 ml N2 supplement, 100 pl EGF, 100 pi fibroblast groeifactor (FGF) -Basic, 5 ml amfotericine B, 0,5 ml gentamycine, 5 ml L-glutamine.
    5. Bereid deze enzymoplossing combineren: 98,5 ml PBS, 1 ml collagenase-1, 0,5 ml 10x trypsine / EDTA en steriliseer door filtratie door 0,22 um poriën filter.
    6. Bereiden of verkrijgen van een kleine hoeveelheid steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 celkweekmedium met 7% foetaal runderserum (FBS) en 1x PBS zonder calcium of magnesium.
  2. tumor Uitsplitsing
    OPMERKING: Athymische nu / nu-muizen die eerder geïnjecteerd met tumorcellen in de rechter flank en men onder een groot tumormassa nodig voor deze procedure. In de hier getoonde voorbeelden, gebruikten we de patiënt afgeleide xenograft GBM cellen, JX10 en JX12 17.
    1. Steriliseren werkgebied door het sproeien van 2% chloorhexidine en het opzetten van het werkgebied with benodigde instrumenten / supplies waaronder wegwerp chuck, pincet, scalpel, glazen petrischaal, enzymoplossing, PBS, en chloorhexidine (zie Figuur 2A).
    2. Euthanaseren muis / muizen die een flank tumor. Streven naar een 20% / min verplaatsingssnelheid CO 2 via 30% CO2. Nadat de muis toont ademhalingsstilstand handhaven CO 2 stroom gedurende 1 min (meestal 3 min totaal). Muizen worden uit de kamer verwijderd en cervicale dislocatie wordt uitgevoerd als een secundaire bevestiging euthanasie. Spray het dier met 3% chloorhexidine aan de huid te ontsmetten.
    3. Houd de muis stabiel maken halfronde huidincisie ~ 1,5 cm van tumormassa (flank geïmplanteerde tumor) met een steriele scalpel met # 11 blad begint craniaal van de tumormassa en insnijden naar de buik van de muis en rond de caudale einde.
    4. Reflect huid over tumormassa met de vingers met zachte tractie op caudale einde van de incisie en druk op de huidoppervlak van de tumor tot beste toegang zonder het aanraken van de tumor te verhogen (zie figuur 2B).
    5. Gebruik stompe dissectie met een tang om voorzichtig vrij tumormassa van peritoneale muur en van de huid (zie figuur 2C).
    6. Transfer tumor massa met een tang om steriele glazen petrischaal (Gebruik GEEN plastic schaaltjes om te voorkomen dat het breken tijdens het fijnhakken) en op de juiste gooi karkas en leg deze instrumenten opzij.
    7. Gebruik nieuwe set steriele instrumenten (scalpel met # 11 blade, semi-gebogen pincet) om tumorweefsel van necrotisch weefsel en membraneuze gastheer bindweefsel die tumor debrideren.
    8. Plaats 15 ml enzymoplossing in een steriele geventileerde-trypsinizing fles met roerstaaf en beginnen te roeren langzaam in de kap.
    9. 5 maal met steriele PBS om overtollig bloed te verwijderen (kan gieten of gebruiken spuit om ze te spoelen met de PBS) - in een steriele glazen petrischaal, 3 wassen geoogst tumoren. Voorzichtig tilt schotel en pipet of zuig het wassen materiaal. mince finely met twee # 11 scalpel messen (zie figuur 2D).
    10. Voeg 14 ml van de enzymoplossing gehakt tumor en pipet zachtjes op en neer 2-3 keer. Transfer mengsel ontlucht-trypsinizing kolf en roer langzaam gedurende 20 min. Bereid 5 50 ml conische buizen door toevoeging van 1,5 ml FBS aan elk om de trypsine te neutraliseren stap 1.2.11.
    11. Na 20 min, laat 14 ml celoplossing van trypsinizing kolf en voeg een buis met FBS. Voeg 14 ml verse enzymoplossing aan kolf en blijf roeren.
    12. Centrifugeer cellen verzameld bij 150 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Voeg 45 ml van complete NBM aan de pellet, meng voorzichtig, en herhaal centrifugeren te spoelen serum. Re-schorten pellet in 5 ml compleet NBM en houd op ijs.
    13. Herhaal celoogst stappen voor een totaal van 5 oogsten, waarin alle geoogste cellen in een conische buis op ijs.
    14. Plaats een 40 um cel zeef bovenop een 50 ml conische buis. Prep tHij cel zeef passeren door 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS door en vervolgens wassen met 10 ml PBS.
    15. Voeg langzaam celsuspensie zeef, zodat het door middel druppelen (zie Figuur 2M). Til het lipje van de cel zeef tussen elke nieuwe toevoeging aan een vacuüm te breken en laat de gesuspendeerde cellen vrij te passeren (zie figuur 2 N).
    16. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie zoals hierboven. Resuspendeer in 10 ml compleet NBM en tel totale aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw 0,04% en een hemocytometer bepaald. Houd cellen op ijs tot microtumor generatie.

2. Alternate Tissue Aggregatieniveau Protocol

  1. Geautomatiseerde weefsel dissociator en disaggregatie systeem.
    1. Plaats de opsplitsing buis in de cellulaire dissociator, selecteert u het programma "Tumor _02_02" en druk op start en een looptijd van 32 sec. Verbindingsbuis naar rotator, plaats in de 37 ° C incubator gedurende 40 minuten.
    2. Centrifugeer cellen gesuspendeerd bij 150 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Terwijl centrifugeren van de cellen, opgericht reagentia voor de behandeling van de celsuspensie. Voeg 10 ml serum-vrij NBM en zachtjes vermaal schorsing.
    3. Na centrifugatie verkregen celpellet met een ~ 10 - 30 x 10 6 levensvatbare cellen (~ 0,3 ml). Re-schorste de pellet in 10 ml serumvrij NBM (zie figuur 2O). Bepaal de levensvatbare cellen door uitsluiting assay (zie stap 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid volledige NBM als in 1.1.4 en voor te bereiden geneutraliseerde High Density menselijk Biogel (HuBiogel) (HDHG 3 mg / ml) per interne protocol. Biogel soortgelijke matrices kunnen eveneens worden gebruikt.
  2. Microtumor Productie en Cultuur
    1. Verkrijgen net losgemaakte PDX cellen als enkele celsuspensie in volledige NBM, op ​​ijs.
    2. Meng de cel suspension met een gelijk volume van trypan blauwe oplossing (0,4% in PBS) en te gebruiken hemacytometer om het aantal cellen en de levensvatbaarheid bepaald door trypan blauw exclusie 18. Verwijderen volume moet 50.000 cellen te / microtumor waarbij volume = (50.000 cellen / tumorcel * # tumoren) / (telling van levensvatbare cellen / 1 ml) en plaats in een nieuwe conische buis.
    3. Concentreren cellen door centrifugatie bij 150 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met ijskoude HDHG oplossing in een uiteindelijke verhouding van 1 deel cellen in FBS en 4 delen HDHG.
    4. Gebruik een elektronische multichannel pipet tot 10 pl per pin cel-HDHG mengsel af te geven op een 96-pins stalen plaat (met waterafstotende coating) aan microtumors (2 mm bolletjes met elk 50.000 cellen) te genereren.
    5. Plaats 3D tumor kralen in weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 bevochtigde) gedurende 15 minuten om de kralen geleren.
    6. Na geleren, overdracht van de microtumors (10 μ, L) een aangepaste suspensiekweek kamer (50 ml) of groot volume kweekschaal (10 cm) met een totale NBM middel van een elektronische multichannel pipet en aangepaste pin-apparaat.
    7. Na 1-2 dagen in weefselkweek incubator, transfer microtumors 96 putjes die 50 pi NBM / putje met behulp van een brede mond pipet afgeven en uitvoeren van verschillende assay en analyseprotocollen.
  3. Drug Treatment en onderhoud van microtumors
    1. Selecteer eindconcentraties voor drug het testen.
      OPMERKING: Indien het geneesmiddel werkzaamheid bekend 2D cultuur, selecteert 2x het IC 50 als middelste concentratie dosis en selecteer 3-voudige seriële verdunningen en boven een totaal van 5 doses. Bijvoorbeeld, als de IC 50 is 9 pM voor het geneesmiddel in 2D cultuur, selecteert 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 pM en 162 pM als eindconcentratie voor drug testen.
    2. Bereid 2x drug dosering oplossing in volledige NBM van dimethyl sulfoxide (DMSO) voorraad. Verdun dosering oplossing in 1% DMSO medium tot een 5 dosis, 3-voudige seriële verdunning te bereiden.
    3. Voeg 50 ul van doseringsoplossing de microtumor putje met 50 pl in testplaten om een ​​uiteindelijke DMSO concentratie van 0,5% te bereiken. Herhaal dit voor elke repliceren (bijvoorbeeld 4) bij elke drug dosis bepaald in 3.3.1.
    4. Handhaaf culturen in 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 1-14 dagen. Feed culturen tweemaal per week door verfrissende media en drugs oplossing als hierboven.

4. morfologische en fenotypische analyse van Microtumors

  1. Bepaal celmorfologie in microtumors met behulp van standaard voor live-cell kleuring.
    1. Bereid 1 mM voorraad calceïne-AM in DMSO. Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
    2. Op gewenste tijdstippen cultuur (1, 7 en 14 dagen), voeg calceïne-AM oplossing bereid in PBS (zonder Ca / Mg) aan 96-wells plaat 1 uM eindconcentratie.
    3. Incuberen20 min in een 37 ° C, 5% CO 2 bevochtigde incubator, en het beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop op 2x, 4x, en 10X (excitatie: 450-490 nm band pass, emissie: 515 nm lange pass, Dichroic 500 nm) .
  2. Microtumor Groei / Proliferation Assay
    1. Ontbinden MTT poeder in PBS (zonder Ca / Mg) tot 12 mm in voorraad te bereiden. Steriel filter, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
    2. Op gewenste tijdstippen cultuur (1, 7 en 14 dagen), voeg 20 ul MTT-oplossing aan 96-well plaat per 100 pl kweek volume. Incubeer 2 uur in weefselkweek incubator.
    3. Bereid verse lysis oplossing van 10% SDS in 0,01 M HCl en voeg gelijke hoeveelheid aan cultuur volume platen. Incubeer verzegelde platen overnacht in 37 ° C incubator.
    4. Lees absorptie bij 570 nm met behulp van een multi-plate reader.
  3. Microtumor Voorbereiding voor Kinomic Analyse
    1. Bereid lysisbuffer door vooraf koelen tot 4 ° C en daarna toevoegen van een 1: 100 verhouding van elk 100x Proeiwit fosfatase remmer (PPI) en 100x Protein proteaseremmer (PI). Meng goed en blijf op ijs.
    2. Overdracht 2 microtumors elk van de drie 1,5 ml microcentrifugebuis. Verwijder supernatant en voeg 40 ul lysisbuffer bevattende PPI en PI aan elke buis en lyse gedurende 30 min bij 4 ° C.
    3. Pipet monsters krachtig om tumor kralen te breken. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en bewaar monsters bij -80 ° C tot kinomic analyse.

5. Kinomic Profilering van Microtumors

  1. Protein Tyrosine Kinase (PTK) profilering
    1. Dooi reagens (10x eiwitkinase (PK) buffer en 2% runderserumalbumine (BSA)) naar 4 ° C Belasting PK buffer (300 pl 10x PK buffervoorraad in 2,7 ml dH 2 O) in de spuit op positie 2 op de profilering platform.
    2. Open de kinase assay software programma en het PTK protocol bestand en druk op 'START' te laden, annoteren monsters binnen softwzijn programma na het scannen chips. Plaats fiches op profilering platform en load 25 ul van 2% runderserumalbumine (BSA) per array en druk op LOAD om de software-gecontroleerde protocol blokkeert stap te beginnen.
    3. Verdun 6 micrometer van 100 mM ATP voorraad met 54 pl dH 2 O tot 10 mm adenosine trifosfaat (ATP) te maken. Wanneer de software begint het 3e en laatste wasstap (zichtbaar op het scherm) brengen 15 ug lysaat gebracht tot 28 ul met dH 2 O, mengen en toe te voegen aan array.
    4. Bereid PTK master mix (MM) (voor maximaal 12 monsters). Voeg 32,6 ul dH 2 O aan dithiothreitol reconstrueren (DTT) en voeg 6 ul DTT, en 60 ul 10x PK-oplossing, om PTK-MM1 buis (al bevat 60 pi 10x BSA).
    5. Wacht tot 'Load' prompt in het kinase assay software verschijnt en voeg dan 126 ul van PTK-MM1, 60 ul PTK additief, en 60 ui 10 mM ATP MM2 (bevat eerder in porties 4,5 ul PY20 FITC antilichaam) en meng.Voeg 16 ul van deze PTK master mix aan elk monster lysaat buisje en de pipet mix 5 keer.
    6. Zorgen voor dekking van glas is schoon en voeg dan 35 ul lysaat / master mix per array, dicht carrousel deksel en druk op de knop LOAD.
  2. Serine / Threonine kinase (STK) Profiling:
    1. Dooi reagens (10x PK buffer, 10x STK buffer en 2% BSA) tot 4 ° C. Load PK buffer (300 ul in 2,7 ml dH 2 0) in de spuit positie # 1, 1:10 en STK buffer (300 ul in 2,7 ml dH 2 0) in de spuit positie # 2.
    2. Open het kinase assay computer software programma en het STK protocol bestand en druk op START te laden, annoteren monsters binnen het programma na het scannen chips. Plaats fiches op profilering platform en load 25 ul van 2% BSA per array en druk op LOAD om de software-gecontroleerde protocol blokkeert stap te beginnen.
    3. Verdun 6 micrometer van 100 mM ATP met 54 ul dH 2 O. Tijdens het laatste (3e) wasstap mix2 ug lysaat aan tot 32,6 pl met dH 2 O, mengen en toe te voegen aan array.
    4. Maak STK master mix: Voeg 70 ul 10x PK aan STK-MM1 buis (bevat 7 pl 100x BSA), en voeg dan 42 ul dH 2 O aan STK-MM1 buis.
    5. Wacht tot 'Load' prompt in het kinase assay software vervolgens: Voeg 18 ul 10 mM ATP om STK-MM1 en voeg 9 ul MM1 aan elk monster lysaat. Goed mengen.
    6. Zorgen voor dekking van glas is schoon en voeg 35 ul lysaat / master mix per array, dicht carrousel deksel en druk op LOAD.
    7. Tijdens de finale (3e) Wash Stap add 1,05 ul STK-FITC secundaire antilichaam aan DMAB buis (bevat 3,03 ul STK primaire antilichaam mix), voeg 39,6 pl AB Buffer te DMAB, voeg 356,0 pl dH 2 O tot DMAB, voeg 30 ul aan DMAB aan elke array, en druk op LOAD .
  3. Analyse van de gegevens Kinomic 19,20
    1. Open analyse software en laad het Image Analysis App. Seteer image map met barcode en tijdstempel hele reeks foto's voor PTK of STK gegevens, selecteert u artikelnummer geëvenaard reeks layout-bestand (86.312 voor PTK en 87.102 voor STK), en de belasting eerder gegenereerde reeks annotatie File.
    2. Controleer of de juiste gridding van alle afbeeldingen en lopen Exposure Time Scaling App. Statistisch vergelijken blootstelling / helling log2 getransformeerde waarden, en bevestig met voorwas kinetische curves 19-21.
    3. Run bovenstrooms kinase voorspelling software om gewijzigde kinomic profielen tussen de voorwaarden te vragen voor de bovenstroomse kinases 22,23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben laten zien dat 3D Biogel cultuur systeem ondersteunt groei op lange termijn en de functie van meerdere celtypen. In dit samenwerkingsproject, zijn patiënt afgeleid GBM xenolines (PDX) gebruikt voor de productie van honderden microtumors. Gedissocieerde cellen (3 x 10 5) of neurosferen (40 - 50) zijn ingebed in Biogel parels (2 mm) en na snelle gelering ze gekweekt in een NB-medium gevuld custom bioreactor. Cellulaire levensvatbaarheid (calceïne-AM), groeiprofiel (MTT...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritische stappen in het protocol voornamelijk betrekking op productie, en dosering van geneesmiddelen en onderhoud microtumor. Omdat de microtumor kralen zijn kwetsbaar en gemakkelijk gescheurd, is uiterste zorg nodig beide ontwikkelingsstadia van een test en onderhoud. Indien tijdens een van deze processen een fout optreedt, kan experimenteel interpretatie worden aangetast, waardoor verlenging of onnodige herhaling van experimenten of zelfs van gegevenssets.

Wijzigingen en het oplossen van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

R.S. en R.S.S. zijn werknemers van Vivo Biosciences. J.C.A. wordt gedeeltelijk gefinancierd door de UAB Kinome Core.

Dankbetuigingen

Ondersteund door NIH-subsidie ​​R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), hersentumor SPORE award (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) en SBIR contract (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase-I Sigma-AldrichCO130
Trypsin EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 SupplementLife Technologies17502-0481x eindconcentratie
B-27 Supplement w/o Vitamin ALife Technologies12587-0101x eindconcentratie
Recombinant Human FGF-basicLife TechnologiesPHG026610 ng/ml eindconcentratie
Recombinant Human EGFLife TechnologiesPGH031510 ng/ml eindconcentratie
L-GlutamineCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM eindconcentratie
FungizoneOmega ScientificFG-702,5 µg/ml eindconcentratie
Penicillin StreptomycinOmega ScientificPS-20100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin eindconcentratie
GentamicinLife Technologies15750-06050 ng/ml eindconcentratie
MTTLife TechnologiesM6494bereide op 5 mg/ml in PBS en steriel gefilterd, 1 mg/ml in de put
SDSFisherBP166voor MTT lysis buffer, bereid tot 10% in 0,01 M HCl, 5% in de put
HClFisherA144SI-212voor MTT lysis buffer, bereid tot 0,01 M met SDS, 5 mM in de put
Calcein AMLife TechnologiesC14301 mM in DMSO voorraad, 2 µM in PBS kleuringsoplossing, 1 µM in de put
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail Pierce ThermoScientific784201:100 verhouding in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce ThermoScientific877861:100 verhouding in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231voor oplossing van calcein AM & verbindingen
Phosphate-Buffered Saline without Ca/MgLonza17-517Qverdund tot 1x met MiliQ ultrapuur water en steriel gefilterd (voor celcultuur)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVverdund tot 1x met MiliQ ultrapuur water (voor pre-fixatie wassen)
10% Neutral Buffered FormalinProtocol032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
High Density HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt's Protein Phosphatase InhibitorPierce78420
Halt's Protein Protease InhibitorPierce87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)Thermo Scientific78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chipPamGene86312
PTK kinase bufferPamGene36000300 µl 10x PK buffer stock in 2,7 ml dH2O, catalogusnummer voor PTK reagent kit
ATPPamGene36000catalogusnummer voor PTK reagent kit
PY20- FITC-geconjugeerd antilichaamPamGene36000catalogusnummer voor PTK reagent kit
PTK AdditivePamGene32114
PTK-MM1 tube (10x BSA)PamGene36000catalogusnummer voor PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chipPamGene87102
STK kinase bufferPamGene32205catalogusnummer voor STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube)PamGene32205catalogusnummer voor STK reagent kit
FITC-geconjugeerd secundair antilichaamPamGene32203
STK-MM1 tube (100x BSA)PamGene32205catalogusnummer voor STK reagent kit
STK Antilichaam BufferPamGene32205catalogusnummer voor STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterielFisher3120030
#3 scalpel handgrepen, sterielFisher08-913-5
100 mm glazen Petri schotelsFisher08-748D
Semicurved pincettenFisher12-460-318
Trypsinisatie flesFisher10-042-12B
Magnetische roerderFisher14-490-200
3/4" roerstaafFisher14-512-125
B-D cell strainer Fisher#352340
B-D 50 ml centrifugebuisFisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analyse software PamGene
Evolve Kinase Assay SoftwarePamGene
UpKin App software (upstream kinase voorspelling)PamGene
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS)SyntheconRCCS-Dmet 10 ml wegwerp HARV

Referenties

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D menselijke biogelmicrotumorkweekpati ntafgeleide xenotransplantatentumor disaggregatiefiltratie met cellenzeeflive cell imagingMTT assay
Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.