Methodenartikel

Meting van de productie van koolstofdioxide uit Radioactief gemerkt Substrates in

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54045

⸱

27 juni 2016

1Department of Pharmacology, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een methode voor de meting van brandstofoxidatie in Drosophila melanogaster waarbij sporenhoeveelheden van specifieke radioactief gelabelde metabole substraten aan vliegen worden gevoerd. Het uitgeademde radioactief gelabelde CO2 dat wordt geproduceerd uit brandstofoxidatie wordt verzameld en gemeten.

Samenvatting

De kracht van Drosophila genetica wordt steeds vaker toegepast bevat hormoon signalering en metabolisme en de ontwikkeling van modellen van menselijke ziekte in dit organisme. Gevoelige methoden voor metingen van parameters zoals stofwisseling nodig zijn begrip van de fysiologie en ziekte bij kleine dieren drijven zoals de fruitvlieg. De hier beschreven methode beoordeelt brandstof oxidatie in kleine aantallen volwassen vliegen gevoed levensmiddelen die sporen van 14 C-gelabelde substraten zoals glucose en vetzuren. Na de voertijd en eventuele aanvullende experimentele manipulaties zijn vliegen overgebracht in korte buizen afgedekt met gaas, dat vervolgens in glazen flesjes die KOH-verzadigde filterpapier die vallen uitgeademd worden geplaatst, radiolabeled CO 2 gegenereerd door oxidatie van radioactief gemerkte substraten kaliumbicarbonaat, KHCO3. Dit radiolabeled bicarbonaat wordt gemeten door scintillatietelling. Dit is aqKWANTITATIEVE, reproduceerbare en eenvoudige benadering voor de studie van de brandstof oxidatie. Het gebruik van radioactief gelabeld glucose, vetzuren of aminozuren maakt bepaling van de bijdrage van deze verschillende brandstoffen naar energiemetabolisme onder verschillende omstandigheden, zoals voeding en vasten en in verschillende genetische achtergronden. Dit vormt een aanvulling op andere benaderingen gebruikt om te meten in vivo energiemetabolisme en moet het begrijpen van metabole regulatie bevorderen.

Inleiding

Werkzaamheden in het modelorganisme Drosophila melanogaster heeft sterk bijgedragen tot het begrijpen van de genetische principes, ontwikkelingsprocessen, groei, veroudering, gedrag, immuniteit en menselijke ziekte 1,2. Een groot aantal genetische en celbiologische benaderingen in Drosophila heeft vooruitgang gereden op deze gebieden. Echter, heeft het onderzoek van het metabolisme in de fruitvlieg langzamer ontwikkeld, grotendeels het gevolg van moeilijkheden bij het meten van metabole parameters in zo'n klein dier. De belangstelling voor het gebruik Drosophila als model voor het bestuderen van humane ziekten zoals diabetes en voor het begrijpen van de bijdrage van metabolisme tot groei en diverse pathologieën heeft het veld te ontwikkelen en metabole technieken aan te passen voor dit organisme 3,4 geduwd.

Betrouwbare methoden zijn beschikbaar voor het meten van een aantal metabole parameters in de fruitvlieg. Zo is het eenvoudig om voedselinname te beoordelen 5, niveaus van opgeslagen triglyceriden en glycogeen, en hemolymfe circulerende niveaus van glucose en de belangrijkste circulerende suiker in de vlieg, trehalose, een disaccharide bestaande uit twee moleculen glucose 4. Gebruik van metabole tracers heeft de studie van voedingsopname van de voeding en de omzetting van geabsorbeerde voedingsstoffen nodig zoals glucose de opslagvormen glycogeen en triglyceriden 6. Stofwisseling kan in de fruitvlieg door het meten van het zuurstofverbruik 7,8 en kooldioxide (CO 2) de productie worden beoordeeld. De citroenzuurcyclus oxideert twee-koolstof eenheden die de cyclus acetyl coenzyme A (CoA), die is afgeleid van het metabolisme van dieet en opgeslagen koolhydraten en vetzuren kunnen invoeren. Elke omwenteling van de cyclus maakt een molecuul elk van GTP (ATP) en de elektronendonor FADH 2, drie moleculen NADH en twee moleculen van het afvalproduct CO 2. CO 2 productie kanworden gebruikt voor het basaal metabolisme te schatten. Totale CO 2 productie kan worden gekwantificeerd in Drosophila door gebruik van commercieel verkrijgbare of handgemaakte respirometers 9-10,11.

Het meten van de totale CO 2 productie, vooral in combinatie met meting van O2 consumptie, verschaft waardevolle inzichten in het gehele lichaam energiemetabolisme. Echter, deze maatregel niet de nutriënt identificeren wordt geoxideerd voor adenosine trifosfaat (ATP) productie. koolhydraten, vetzuren en eiwitten: drie belangrijkste categorieën van voedingsstoffen kan de citroenzuurcyclus na conversie naar acetyl CoA te voeren. Glucose-6-fosfaat, afgeleid van de voeding glucose of glycogeen opgeslagen, kan worden omgezet in pyruvaat, dat wordt gedecarboxyleerd door pyruvaat dehydrogenase acetyl CoA. Afbraak van vetzuren afkomstig uit de voeding of uit opgeslagen triglyceriden door ß-oxidatie levert acetyl CoA die vervolgens komt in de citroenzuurcyclus. EindelijkEen meerderheid van de aminozuren kan de citroenzuurcyclus volgende omzetting in pyruvaat, acetyl CoA of citroenzuur cyclus tussenproducten zoals alfa-ketoglutaraat.

Nutrient-specifieke bijdrage aan energiemetabolisme tijdens basale en gestimuleerde omstandigheden kan worden gemonitord met behulp van radioactieve tracers. De hier gepresenteerde protocol is aangepast voor gebruik in Drosophila van een protocol voor oxidatie in cellen in kweek 12,13 beoordelen. In deze benadering, fruitvliegen gevoed 14 C-radiolabeled metabole substraten (koolhydraten, vetzuren of aminozuren) in het dieet voor een korte (uren) of lange (dagen) puls, achtervolgd op ongelabelde voedsel, en vervolgens blootgesteld aan een kamer die kalium hydroxide (KOH) -verzadigde papieren filter voor het vangen van uitgeademde CO 2 als bicarbonaat. Radiolabeled bicarbonaat kan worden gekwantificeerd door scintillatietelling. Verschillen in radioactief gemerkt-CO 2-productie tussen experimental groepen ongedierte gebruik van verschillende brandstoffen ATP productie in de loop van een langdurige snelle of intrinsieke verschillen in brandstof metabolisme tussen genotypen, bijvoorbeeld weerspiegelen.

Protocol

1. Bereiding van Fly levensmiddelen die Radioactief gemerkt metabole substraten

  1. In een microfugebuis, meng 1-2 uCi radioactief gemerkt substraat (D- [6- 14C] glucose, D- [1- 14C] glucose of [1- 14 C] -palmitic zuur, 40-60 mCi / mmol) met 15 ul FD & C No. 1 blauwe voedselkleurstof en H2O tot een totaal volume van 25 pi gelijk.
    LET OP: Carbon-14 is een lage-energie-beta emitter en beschikt over een korte afstand in de lucht. Echter, zorg om te voorkomen dat morsen van radioactief gemerkte moleculen of accidentele inname door de experimentator. Vlieg voedsel flesjes omvallen gemakkelijk; zorg ervoor dat ze te huisvesten in een container die hen zal verhinderen kantelen, vooral wanneer radioactief label is in vloeibare vorm (stap 1.2) of op onverhard voedsel (stap 1.4). Vliegen die worden gevoed of zijn gevoerd radiolabeled substraten beginnen kleine hoeveelheden radioactief gelabeld CO 2 uitademen. Deze vliegen moeten acrylaat dozen bewaard in wasemkappen, en een schaaltje KOH can worden ingesteld in het vak voor gebruik als een CO 2 scrubber.
  2. Pipet alle radioactief gemerkte substraat en blauwe kleurstof mengsel in de bodem van een lege vlieg voedsel flacon (hoogte: 9,4 cm, breedte 2,2 cm).
  3. Heat standaard vlieg voedsel in een microgolfoven, tot eten gewoon vloeibaar wordt gemaakt (15-20 sec bij energieniveau hoog voor een flacon met 10 ml van voedsel).
  4. Voeg 975 ul gesmolten voedsel aan de radioactief gemerkte substraat / blauwe kleurstof mix en snel wervelen, het toezicht op de uniformiteit van de blauwe kleur om een ​​volledige menging te garanderen.
  5. Laat voedsel afkoelen en stollen geheel bij kamertemperatuur gedurende 20 - 30 min.

2. Feeding Radioactief gemerkte metabole substraten voor volwassenen fruitvliegjes

  1. Verdoven volwassen vliegen met een CO 2 verlamming inrichting bestaande uit poreuze polyethyleen gefuseerd aan een acryl basis verbonden met een CO 2 tank met een drukregelaar. Flow CO 2 in de inrichting verlamming bij 5 l / min.
    1. Transfer Verdovend vliegt naar flacons met radioactief gemerkt, blauw geverfd food (n = 15-30 vliegen per flacon). Cap flesjes met een schuim stop, en de rest horizontaal totdat vliegen wakker. Transfer flacons een deksel acryl container (180 cm x 180 cm x 240 cm hoog).
  2. Voor de korte termijn voeding, verhongeren vliegt voor 18-24 uur voor het overbrengen van vliegen naar het radioactief gemerkte voedsel voor een 2 -. 3 uur voeden stap T hij honger stap is belangrijk omdat gevoed vliegt een nieuwe bron van voedsel aan hen niet op betrouwbare wijze zullen eten . Voor lange termijn voeding in de loop van 5-7 dagen, behoeven vliegen niet uitgehongerd, maar de experimentator het watergehalte van het radioactief gemerkte voedsel in de flesjes vliegen worden ondergebracht in opvolgen en een naald en spuit water flesjes toevoegen met droogvoer.
  3. Transfer vliegt naar ongelabelde voedsel door "tikken" ze in een nieuw flesje. Een eerste chase periode van 2-4 uur laat vliegen om radioactief gemerkt etensresten te verwijderen van hun nagelriemen en maakt vertering van radiolabeled voedselresten in de darm. De voortgang van het voedsel door de darm door visuele inspectie van vliegen op zoek naar blauwe abdomens.
  4. Vervolgens overdracht vliegt naar verschillende soorten voedsel (12-24 uur op standaard voedsel of 1% agar voor het meten van effecten van gevoerd versus nuchtere toestand op de ademhaling) of omgevingstemperaturen (12-96 uur bij 18 ° C en 30 ° C voor genetische manipulaties met behulp van temperatuurgevoelige GAL80 (GAL80 ts), voor bijvoorbeeld).
    Opmerking: De lengte van deze uitwasperiode zal variëren met het experiment wordt uitgevoerd. Voor bijvoorbeeld, kan een 96 uur chase bij 30 ° C nodig zijn experimenten met GAL80 ts om volledig te activeren GAL4-afhankelijke transgenexpressie.

3. Bereiding van de CO 2 -Collectie Apparatus

  1. Monteer materialen te bouwen "pods vliegen ', mesh capped buizen die vliegen gelabeld met 14 C-glucose of 14 C-palmitinezuur en tha zal bevattent zal openstaan ​​voor de atmosfeer blijven. Snijd de top 50 mm of 12 mm x 75 mm polypropyleen buizen, waardoor 25 mm lange, ronde bodem buizen. Bereid 35 mm x 35 mm vierkantjes van 130 um nylon mesh. Ook het verkrijgen van transparante tape in een tape dispenser.
  2. Monteer materialen voor de CO 2 -collection apparaten. Voor elke vliegen pod, assembleren een 20 ml glazen scintillatieflesje, een rubberen stop met een off-center hole, een centrum goed door het gat in te voegen in de top stopper, rang GF / B glas microfiber papieren filter (2,1 cm diameter cirkel, 1 micrometer porie). GF / B filtreerpapier wordt gebruikt vanwege zijn hoge natte sterkte en een hoog laadvermogen.
  3. Bereid 5% KOH vers op de dag van gebruik. Vlak voor stap 3.4, vouwen en plaats de ronde GF / B-filter papier in het centrum goed, dat is voorzien van schroefdraad door het gat van de rubber stop en verzadigd is met 100 ul van 5% KOH. Zie Figuur 1.
  4. Na incubatie (s) op ongelabelde media, eennesthetize vliegt met CO 2. Borstel vliegt in de cutoff polypropyleen buis, cap met nylon mesh, en het gebruik van transparante tape om mesh houden aan de buis. Werk snel om te voorkomen dat vliegen wakker worden en te ontsnappen voordat het gaas veilig is aangebracht op de buis. Een gelijk aantal vliegen worden gebruikt in elke fly pod voor een bepaald experiment; 10-20 vliegen per fly peul voldoende radioactief gemerkt-CO 2 voor meting door scintillatietelling (stap 4.1 hieronder).
  5. Breng de fly pod om een ​​20 ml glazen scintillatieflesje. Cap het glazen flesje met de rubberen stop met een center putje met KOH-verzadigde GF / B-filter papier. Vouw de brede top van de rubberen stop op de lip van de glazen scintillatieflesje. Zie Figuur 1.
  6. glazen flesjes set met vliegen in een deksel, acryl container, en incubeer gedurende kortere of langere tijd (2 tot 12 uur werkt goed).

4. Analyse van de resultaten

  1. Ophet einde van de incubatie Haal het beschermkapje glazen flesjes en transfer-KOH verzadigde GF / B filtreerpapier met een 6 ml scintillatie plastic flacon met 4 ml scintillatiecocktail.
  2. Indien nodig, te bevriezen vliegen in fly peulen op droog ijs en bewaar bij -80 ° C voor latere bepaling van opgeslagen substraten. Merk op dat deze monsters radioactieve en dienovereenkomstig worden opgeslagen.
  3. Bereid extra scintillatieflesjes: één met ongebruikt GF / B-filter papier om te dienen als achtergrond en 1-2 anderen met 0,1-0,5 uCi radioactief gemerkte substraat cpm te bepalen / uCi.
  4. Meet cpm voor elk monster onder toepassing van een scintillatieteller volgens het protocol van de fabrikant.
  5. Bereken pmol 14 CO 2 / cpm en pmol 14 CO 2 per fly per uur. Trek de achtergrond cpm van de cpm waarde voor elk monster. Van de nette radioactief gemerkte substraat data, berekent de achtergrond gecorrigeerde cpm / uCi van het monster geteld.
    1. Gebruik deFabrikant geleverde specifieke activiteit en radiochemische concentratie van de radioactief gemerkte substraat (bijvoorbeeld, 50 uCi / pmol en 0,1 uCi / ul, respectievelijk) naar pmol / cpm berekenen. Gebruik deze factor aan-achtergrond gecorrigeerde fly pod data om te zetten van 14 cpm CO 2 / monster tot 14 pmol CO 2 / monster. Dan delen door het aantal vliegen en het aantal uur in de vlieg pod.

Resultaten

De hoeveelheid uitgeademde en gevangen radioactief gemerkt CO 2 dat wordt geproduceerd uit het metabolisme van een radioactieve substraat moet correleren met het aantal vliegen in een vlieg peul en de hoeveelheid tijd die de dieren het in het CO 2 verzamelapparaat. Om dit te testen werden vliegen die werden gevast gedurende 18 uur toegevoerd radioactief gemerkt palmitinezuur (0,02 uCi / ul voedsel) gedurende 2 uur en vervolgens getest op radiolabeled CO 2 productie in groepen van 12 of 25 dieren voor 3 of 6 uur incubaties. De hoeveelheid CO 2 door 25 vliegen was bijna dubbel door 12 vliegen bedrag en het bedrag voor elke groep verdubbeld wanneer de incubatietijd was verhoogd van 3 uur tot 6 uur (Figuur 2A). De pmol 14 CO 2 / fly / uur was nagenoeg gelijk in elke groep.

Vasten stimuleert de afbraak van vetzuren door ß oxidation; Daarom CO 2 productie van vetzuur oxidatie moet worden verhoogd in nuchtere dieren vergeleken met gevoede dieren. Om te bepalen of dit het geval was, 18-uurs nuchtere vliegen kregen radioactief gemerkt palmitinezuur voor 2 uur. Na deze korte puls voeden, werden vliegt in twee groepen verdeeld en overgebracht naar ongelabelde vlieg voedsel of 1% agar voor 3 uur en vervolgens overgebracht naar pods vliegen 2 uur. In twee afzonderlijke experimenten, vliegen gejaagd op agar produceerde significant radiolabeled CO 2 tegen vliegen gejaagd voeding (Figuur 2B) dat aangeeft dat ß oxidatie verhoogd in nuchtere dieren.

figure-results-1
Figuur 1. Inrichting voor het verzamelen uitgeademd Radioactief gemerkt CO 2.
Vliegen die radioactief gemerkte metabole substraten hebben verbruikt zijngeplaatst in een "fly pod" (FP), een cutoff centrifugebuis afgedekt met gaas (M). De vlieg pod werd in een 20 ml glazen scintillatiebuisje en afgesloten met een rubberen stop (S) die een excentrische opening, waardoorheen geplaatst een centrale kuiltje (CW) die GF / B filtreerpapier verzadigd met 100 ul bevat 5% KOH. Uitgeademde CO2 reageert met het KOH en wordt gevangen op het filtreerpapier als bicarbonaat. Gevangen, kunnen radioactief gemerkte CO 2 worden gekwantificeerd door scintillatietelling van de verzadigde filter papier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. 14 CO 2 productie correleert met Time en het aantal vliegen in eenFly Pod en reageert op Fed en nuchtere toestand.
(A) De hoeveelheid 14 CO 2 geproduceerd in vliegen toegevoerd radiolabeled palmitaat correleert met het aantal vliegen getest (n = 12 (open staven) of 25 (gesloten staven)) en de tijd doorgebracht in een vlieg pad (3 of 6 uur ). Op een per-fly basis, vliegen geproduceerd 0,99, 1,13, 1,10 en 1,01 pmol 14 CO 2 / uur (in dezelfde linker vermelde juiste volgorde als grafiekgegevens data).
(B) vliegen die werden achtervolgd op agar geoxideerde meer radioactief gelabeld palmitaat dan vliegen die werden achtervolgd op voedsel. Gegevens zijn afkomstig van twee experimenten en worden gerapporteerd als gemiddelden standaarddeviatie, n = 16-17 vliegen / groep (experiment 1); n = 10 vliegen / groep (experiment 2). * P = 0,017, t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het meten van de oxidatie van specifieke radioactief gemerkte substraten in volwassen Drosophila melanogaster. Deze techniek is eenvoudig kwantitatieve, reproduceerbare en gevoelige en vult het bestaande methoden de totale CO 2 productie en O 2 verbruik te meten omdat het kan worden gebruikt om de nutriënt (en) wordt geoxideerd ATP productie te identificeren.

Meting van CO2 vrijgemaakt uit de oxidatie van specifieke radioactief gemerkte substraten als hier beschreven is complementair aan technieken totale CO 2 productie te meten. Totale CO 2 productie (V CO2) maakt schatting van metabolisme en bij totale O2 verbruik (V O2) bekend is, kan de stofwisseling berekend en wordt de brandstof voor oxidatie kan worden geschat op basis van de respiratoire ruilverhouding (V CO2 / V O2 = RER). Wanneerkoolhydraten zijn de exclusieve substraat RER = 1, maar wanneer vetzuren zijn de enige bron, RER = 0,7, vanwege de stoechiometrie van de reactie van glucose en lipiden oxidatie. Aangezien apparatuur zuurstofverbruik in Drosophila 14 te meten, kan de oxidatieve brandstof niet worden geïdentificeerd. Echter, door labeling vliegt met sporen van een radioactief substraat of andere en meten van snelheden van radiolabeled CO 2 productie, kan men conclusies trekken over de mogelijkheid van vliegen naar een bepaald substraat op verschillende tijdstippen oxideren tijdens een stimulus of de effecten van een gegeven mutatie op brandstof oxidatie.

Er zijn een aantal kritische stappen in dit protocol. In de eerste plaats moet erop worden gelet bij het gebruik van radioactieve stoffen te morsen en verontreiniging van onderzoeksgebieden te voorkomen. Ten tweede, als verlamming vliegen tijdens de stappen 2.1 en 3.4, de experimentator moet snel werken om effecten van langdurige CO 2 te voorkomenexposure op de stofwisseling en het gedrag. Een groep van 20 vliegen worden verdoofd en overgebracht naar een nieuw flesje of in een vlieg pad in 20 seconden of minder. Wanneer overgebracht van een narcose apparaat aan een levensmiddel flacon, moet de flacon worden rustte op zijn kant om te voorkomen dat verdoofde vliegen vast komen te zitten op het voedsel oppervlak. Bij vliegen worden gevoed radioactief gemerkt voedsel in de loop van enkele dagen als in stap 2.2, moet de onderzoeker te verzekeren dat het voedsel niet uitdroogt hemelsbreed zijn gevoelig voor uitdroging.

De gevoede of nuchtere toestand voorafgaand aan de etikettering, de keuze van het label, de lengte van de etikettering van de tijd, de tijd in de vlieg pod, en de wijze van verdoving zijn parameters die kunnen worden onderworpen aan het oplossen van problemen en aanpassen bij het gebruik van deze techniek. Eerst, vliegen onderworpen aan korte perioden labeling (2-3 uur) geen wezenlijke hoeveelheden radioactief gemerkte voedsel consumeren tenzij onderworpen aan een vastenperiode vooraf. Ten tweede, de keuze van het label ceen invloed hebben op de conclusies is men in staat te stellen over metabole fenotypes. Bijvoorbeeld radiolabeled CO 2 productie van D- [1- 14C] glucose oxidatie kan via de citroenzuurcyclus of de pentosefosfaat shunt reflecteren, terwijl radiolabeled CO 2 productie van D- [6- 14C] glucose oxidatie weerspiegelt via de citroenzuurcyclus alleen 12,15,16. Toevoeren vliegen met een radioactief gemerkte tracer voor een essentieel aminozuur 17,18 zou een goede strategie voor het beoordelen oxidatie van aminozuren afgeleid van eiwitten. Tenslotte langdurig labelen met radioactief gemerkt glucose ook de mogelijkheid van opneming van deze precursor verhogen in andere klassen van moleculen zoals triglyceriden 19 en aminozuren zoals alanine, die gemakkelijk interconverts met pyruvaat. Dit kan worden bepaald door het meten van radioactiviteit ingebouwd in de verschillende klassen van moleculen 6. Inderdaad kunnen aparte cohorten vliegen worden gevoed radiolabeled substraten op dezelfde wijze en vervolgens gebruikt voor vlieg pod experimenten of meting van radiolabel die is opgeslagen en blijft in glycogeen en triglyceriden bij voeden als bij vasten 6, bijvoorbeeld. Een andere strategie is om korte periodes labeling die waarschijnlijk oxidatie van het radioactief gemerkte voedingsstoffen zelf en niet opslagvormen van deze voedingsstoffen bekend zijn gebruikt. Ten derde is het ook mogelijk dat twee groepen vliegen identieke snelheden van 14 CO 2 productie gedurende een bepaalde tijd, maar zeer uiteenlopende snelheid initieel kan hebben. Derhalve variëren van de hoeveelheid tijd die vliegt door in de vlieg pod kan een belangrijke parameter te wijzigen bij de beoordeling van fenotypische variatie. Ten slotte is dit protocol vraagt ​​om het gebruik van een korte periode van CO 2 anesthesie bij het ​​aantrekken vliegen in de vlieg pod apparaat. Het is mogelijk dat de CO 2 anesthesie metabolische functie kan beïnvloeden in de loop van de vlieg pod experiment. Een alternatieve eenAANPAK is om stikstof narcose die geen invloed heeft op de stofwisseling 20 gebruiken.

Zoals met elke techniek die een dergelijk complex systeem als brandstof oxidatie en stofwisseling meet de hier beschreven werkwijze heeft beperkingen. Ten eerste is het mogelijk dat vliegt in verschillende groepen kunnen verschillende hoeveelheden radioactief gemerkt voedsel consumeren en zou dus de CO 2 verzamelfase van de assay te gaan met verschillende uitgangsposities hoeveelheden substraat. Dit kan voor het tot op zekere hoogte worden gecontroleerd door het uitvoeren van het experiment met grote steekproeven en door het voeren van vliegen en masse. Voor korte periodes labeling, vliegt met vergelijkbare blauw gekleurde lef het radiolabel zal verbruikt hebben en kunnen zich aan de jacht deel van het experiment worden uitgevoerd. De resterende hoeveelheid in een groep vliegen radiolabel kan worden gemeten aan het eind van het experiment en in afzonderlijke cohorten vliegen na afloop van de voeding en de eerste uitwasperiode. Ten tweede, de activiteit tussengroepen van vliegen in de vlieg peulen kunnen verschillen. Dit moet proefondervindelijk worden bepaald en in aanmerking worden genomen bij het interpreteren van data. Ten derde, is deze techniek niet gemeten totale CO 2 productie, maar de productie van een bepaalde voedingsstof of de opslag vorm (s) van deze voedingsstof. Dit protocol is geen vervanging van maar een aanvulling op de metingen van VCO 2 omdat het verschillende en aanvullende informatie.

De hier beschreven methode meet uitgeademd, radiolabeled CO 2 die een product van de oxidatie van sporenhoeveelheden specifieke metabolische substraten. Door het variëren van het etiket - glucose, vetzuren of aminozuren - men steeds geavanceerdere experimenten de bijdragen van verschillende substraten metabolisme onder verschillende fysiologische omstandigheden, zoals honger en verschillende genetische achtergronden beoordelen ontwerpen. Toekomstige toepassingen van deze techniek omvatten meting van metabolism in het larvale en popstadium ontwikkelingsfasen twee fasen van de levenscyclus Drosophila die worden gekenmerkt door extreme nutriënt opslag en analyse, respectievelijk.

Openbaarmakingen

De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

De auteur bedankt Drs. Mingjian Lu en Morris Birnbaum voor hun nuttige adviezen en de financieringsondersteuning van NIDDK (R21DK089391).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCiPerkinElmerNEC075H050UC
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCiPerkinElmerNEC045X050UC
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCiPerkinElmerNEC043X050UC
Drosophila Vials, Narrow, PolystyreneGenesee Scientific32-116
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mmFisher Scientific14-959AA
Mesh, nitex nylon, 120 µmGenesee Scientific57-102
20 ml borosilicate glass scintillation vialsFisher Scientific03-337-15
Flask top stopper with off-center holeFisher ScientificK882310-0000
Polypropylene center wellFisher ScientificK882320-0000
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameterFisher Scientific09-874-20
Ecoscint ANational DiagnosticsLS-273
6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off CapsNational DiagnosticsSVC-06

Referenties

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
  4. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  5. Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  6. Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
  7. Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
  8. Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
  9. Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
  10. Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681(2014).
  11. Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
  12. Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
  13. Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
  14. Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
  15. Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
  16. Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
  17. Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  18. Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
  19. Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
  20. Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Brandstofoxidatiescintillatiemetingkaliumhydroxidemontage van fly podkoolstof 14 glucosekoolstof 14 palmitinezuurrespirometrie
Meting van de productie van koolstofdioxide uit Radioactief gemerkt Substrates in
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.