Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

Summary

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Abstract

De driedoornige stekelbaars vis zich ontwikkeld tot een krachtig systeem om de genetische basis van uiteenlopende morfologische, fysiologische bestuderen en gedragsmatige fenotypes. De opmerkelijk verschillende fenotypen die zijn geëvolueerd mariene populaties passen aan talloze zoetwatermilieus, gecombineerd met de mogelijkheid mariene en zoetwater vormen kruisen, vormen een zeldzame vertebraat systeem waarin genetica kan worden gebruikt om genomische regio kaart besturen geëvolueerd eigenschappen. Uitstekende genomische middelen zijn nu beschikbaar, het vergemakkelijken van moleculair genetische dissectie van geëvolueerd veranderingen. Terwijl mapping experimenten genereren van lijsten van interessante kandidaatgenen zijn functionele genetische manipulaties nodig om de rol van deze genen te testen. Genregulatie kan worden bestudeerd met transgene reporter plasmiden en BACs geïntegreerd in het genoom via het transposase Tol2 systeem. Functies van specifieke kandidaat-genen en cis-elementen van regelgevende kan worden beoordeeld door het induceren gerichtmutaties met TALEN en CRISPR / Cas9 genoom bewerken reagentia. Alle methoden vereisen introduceren van nucleïnezuren in bevruchte één-cel stekelbaars embryo's, een taak moeilijker geworden door de dikke chorion van stekelbaars embryo's en de relatief klein en dun blastomere. Hier is een gedetailleerd protocol voor micro-injectie van nucleïnezuren in stickleback embryo beschreven transgene genoom en bewerkingssoftware om genexpressie en functie te bestuderen, alsook technieken voor het succes van transgenese beoordelen en herstellen stabiele lijnen.

Introduction

Een fundamenteel onderdeel van het begrip van hoe biodiversiteit ontstaat is het bepalen van de genetische en ontwikkelingsstoornissen bases van geëvolueerd fenotypische veranderingen in de natuur. De driedoornige stekelbaars vis, Gasterosteus aculeatus, heeft ontpopt als een uitstekend model voor het bestuderen van de genetische basis van de evolutie. Stekelbaarzen hebben veel adaptieve evolutionaire veranderingen ondergaan zeevissen talloze zoetwater omgevingen gekoloniseerd rond het noordelijk halfrond, wat resulteert in dramatische morfologische, fysiologische en gedragsveranderingen ^1. De genomen van individuen 20-1 stickleback populaties werden gesequenced en geassembleerd, en een hoge dichtheid koppelingskaart werd gegenereerd om het samenstel te verbeteren ^2,3. Genetische mapping experimenten hebben genomische regio's die ten grondslag liggen aan geëvolueerd fenotypes ^4-6, en in een paar gevallen zijn de functionele rol van specifieke kandidaat-genen getest ^7,8. Een aantal genoomgebieden onderliggende morfologische veranderingen werden geïdentificeerd met veelbelovende kandidaat-genen, maar deze kandidaten nog niet functioneel getest ^9-12. Bovendien, stekelbaars zijn gangbare modellen voor studies van de bevolking genetica / genomics ^13,14, soortvorming ^15, gedrag ^1, endocrinologie ^16, ecotoxicologie ^17, immunologie en parasitologie ^{18 19.} Toekomstige studies in elk van deze gebieden zullen profiteren van de mogelijkheid om functionele genetische manipulaties in sticklebacks. Naast het manipuleren van hun coderende sequenties, kan de rol van kandidaatgenen worden geëvalueerd door het bestuderen van hun cis van regelgevende sequenties en functioneel toenemen, afnemen of elimineren van expressie van het kandidaatgen. Micro-injectie en transgenese methoden in stekelbaars zijn goed ingeburgerd ^7,8,20 en werden in eerste instantie ontwikkeld met behulp van een meganuclease bemiddeldeWerkwijze ²¹ eerst beschreven in medaka ^22. De gemodificeerde micro-injectie hier gepresenteerde methode is geoptimaliseerd voor zowel Tol2 gemedieerde transgenese en recent ontwikkelde genoom bewerken reagentia met inbegrip van Talens en CRISPRs.

Wijzigingen in cis van regelgevende elementen worden gedacht van cruciaal belang voor morfologische evolutie te zijn, zoals cis van regelgevende veranderingen die de negatieve gevolgen van pleiotrope codering mutaties ²³ kunnen voorkomen. Daarom is het testen en vergelijken van vermeende cis van regelgevende sequenties is uitgegroeid tot een centrale doelstelling van een toenemend aantal evolutionaire studies. Daarnaast hebben de meeste menselijke ziekten varianten zijn regulerende varianten ^24,25, en het model gewervelde systemen zijn hard nodig om cis van regelgevende element functie en logica te bestuderen. Vissen die hun embryo's extern bemesten in grote aantallen bieden krachtige gewervelde systemen om cis -regeling te bestuderen. Het Tol2 transposon systeem, waarbij buign DNA te integreren in het genoom wordt geflankeerd door Tol2 transposase bindingsplaatsen en co-geïnjecteerd met Tol2 transposase mRNA, werkt met hoge werkingsgraad voor succesvolle integratie plasmide constructen in fish genoom ^26-28. Typisch wordt een mogelijke enhancer gekloneerd stroomopwaarts van een basale promotor (zoals hsp70l ²⁹⁾ en fluorescerende reportergen zoals EGFP (verhoogd groen fluorescent eiwit) of mCherry in een Tol2 hoofdketen en geïnjecteerd met transposase mRNA ^26. Waarneming van expressie van het fluorescerende reporter, hetzij geïnjecteerde embryo's of nakomelingen met stabiel geïntegreerde transgenen, geeft informatie over de spatio-temporale regulatie van genexpressie aangedreven door de vermoedelijke enhancer. In verdere experimenten, kan bevestigd versterkers worden gebruikt om weefselspecifieke overexpressie van genen van belang drijven.

Voor de analyse van grotere cis van regelgevende regio's, van hoge kwaliteit met grote insert genomic bibliotheken met behulp van bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) zijn gebouwd voor zowel zee- en zoetwater stekelbaars ^30. Deze BACs kunnen worden recombineered een gen te vervangen door een fluorescerende reporter gen in de context van een groot (150-200 kb) genomisch gebied ^31. De fluorescerende reporter wordt vervolgens uitgedrukt in een spatiotemporele patroon, zoals bepaald door de regelgevende sequenties binnen de BAC. Voor studies in vis, kan Tol2 locaties worden toegevoegd aan de BAC op genomische integratie ^32,33 vergemakkelijken. In latere stadia van ontwikkeling in situ hybridisatie technisch uitdagend, kan de fluorescentie van de BAC worden gebruikt om patronen van genexpressie te bestuderen, zoals is getoond stickleback Bone morfogenetisch eiwit 6 (BMP6) ^20. Bovendien kunnen fluorescerende expressiepatronen bij een individu worden gevolgd in de tijd, die niet kan worden bereikt met in situ hybridisatie. BAC's kunnen ook worden gebruikt om een ​​additiona toevoegenl kopie van een genomisch gebied de dosering van een gen van belang te verhogen.

Voor het onderzoek van genfunctie, genoom bewerken is een explosief groeiende sector die kan worden gebruikt om gerichte wijzigingen genomische sequenties in diverse organismen ³⁴ te produceren. Transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) zijn modulair, sequentie-specifieke nucleasen oorspronkelijk geïsoleerd uit plantaardige pathogenen die nauwkeurig kan worden ontworpen om direct te binden aan een genoomsequentie van de keuze en het genereren van een dubbele streng te breken ^35,36. Geclusterde regelmatig afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CAS werden oorspronkelijk gevonden in bacteriën en gebruik een gids-RNA en eiwit Cas9 om een breuk in een doel DNA sequentie complementair aan de geleiding ³⁷ te genereren. De daaropvolgende reparatie van de dubbelstrengbreuk door zowel Talens en CRISPRs vaak laat een kleine insertie of deletie, waarbij de functie van de doelsequentie kunnen verstoren35-37. In sticklebacks zijn Talens gebruikt om genexpressie ontwrichten via manipulatie van een versterker ^20, en beide Talens en CRISPRs met succes geproduceerd coderende mutaties (ongepubliceerde gegevens). Een gedetailleerd protocol voor het genereren van CRISPRs voor gebruik in zebravis kan worden gebruikt als richtlijn om CRISPRs voor stekelbaarsjes ³⁸ ontwikkelen.

Transgene en genoom bewerken experimenten vereisen invoering van nucleïnezuren in een pasbevruchte eencellige embryo. Door het inbrengen van het transgen of genoom-editing tool vroeg in de ontwikkeling, is het aantal genetisch gemanipuleerde dochtercellen in het embryo gemaximaliseerd. Geïnjecteerde embryo's worden vervolgens visueel onderzocht op fluorescentie of moleculair gescreend genoom wijzigingen. Als cellen die bijdragen tot de kiemlijn succesvol zijn gericht, kan het transgen of mutatie worden doorgegeven aan een subset van nakomelingen, zelfs wanneer na injectie dodelijkheid hoog. Het mozaïek vis kan worden outcrossed ofgekruist en hun nakomelingen gescreend om de mutant allelen of een stabiel geïntegreerd transgen van rente terug te vorderen. Dit protocol beschrijft methoden voor het introduceren van transgenen en genoom bewerken reagentia in één cel stekelbaars embryo's en het toezicht op voor een succesvolle genomische modificaties.

Protocol

Alle vis werk werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of California-Berkeley (protocol nummer R330).

1. Bereid nucleïnezuren voor injectie

1. Tol2 Plasmid Transgenese (Aangepast van Fisher ^26).
   1. Snijd 10 ug plasmide transposase (PCS-Tp) ³⁹ met 10 U NotI in geleverde buffer gedurende 1 uur bij 37 ° C te lineariseren.
      Opmerking: Material Transfer Agreements kan worden verplicht om Tol2 plasmiden te verkrijgen.
   2. Extraheer de gesneden plasmide met een 25: 24: 1 mengsel van fenol: chloroform: isoamylalcohol en ethanol precipitaat met natriumacetaat volgens standaardprotocollen ^40. Resuspendeer plasmide in 50 pi RNase-vrij water.
      Opmerking: Fenol-chloroform worden gebruikt in een kap en het afval moet goed worden afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen.
   3. Stel een Sp6 transcriptiereactie volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Gebruik een RNA isolatie kit opruimen transcriptiereactie volgens de instructies van de fabrikant; mengen RNA in 50 pi RNase-vrij water.
   5. Verwijderen 1 pi aliquot van RNA. Verwarm tot 65 ° C gedurende 5 minuten denatureert secundaire structuren dan onmiddellijk koelen op ijs. Freeze resterende transcriptiereactie bij -80 ° C.
   6. Voer het RNA monster op een 1% agarosegel in 0,5 x TAE (Tris base, Azijnzuur Ethyleendeniaminetetraacetaat) loopbuffer met een RNA standaardmaat in een rijstrook. Het verwachte product is 2200 bp; verwijderen wanneer> 5% van het totale RNA in een uitstrijkje kleiner dan 2200 bp, die volledige afbraak aangeeft (figuur 1) weergegeven.
   7. Kwantificeren RNA onder toepassing van een spectrofotometer bij 260 nm. Verdun tot 350 ng / ul in RNase-vrij water en bewaar 1 gl aliquots bij -80 ° C (goed gedurende ten minste twee jaar).
   8. Kloon Tol2 reporterplasmide (bijvoorbeeld met behulp pT2HE ⁸ of plasmiden uit de kit Tol2 ⁴¹⁾ cis- Regulerende element van belang. In het kort PCR amplificeren een genomische DNA-sequentie van belang met primers die restrictieplaatsen in het plasmide, verteren het PCR product en vector met het enzym (en), het inzetstuk ligeren in de vector en transformatie verkregen plasmide in competente E. coli ^40. Isoleer plasmide met een kit die een endotoxine spoeling bevat volgens het protocol van de fabrikant.
   9. Voer een tweede zuivering van het plasmide Tol2 een PCR zuivering kit volgens protocol van de fabrikant. Elueren in 30 pi RNase-vrij water.
      Opmerking: de opbrengst van deze stap kan laag zijn (soms onder 50% van de input plasmide).
   10. Verdun plasmide naar ~ 125 ng / ul in RNase-vrij water.

Figuur 1. transposase mRNA gel. Gezuiverd transcriptiereactie proleiding (1 ui) werd verwarmd tot 65 ° C, gekoeld op ijs en lopen op een 1% agarosegel met 0,5 x TAE-loopbuffer bij 100 V. De groottes van de RNA ladder in kilobasen (kb) zijn aangegeven aan de linkerkant . De volledige lengte transposase mRNA is een lichte band bij ~ 2,2 kb. Een kleine maar aanvaardbare hoeveelheid van aangetaste of onvolledige mRNA wordt onder de 2,2 kb gezien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. BAC Transgenese (Zie Suster ^32,33 voor BAC recombineering Techniques)
   1. Bereid BAC van E. coli gebruikt BAC zuivering kit volgens protocol van de fabrikant. Gebruik ethanolprecipitatie om DNA te herstellen met een standaard natriumacetaat-ethanol extractie ⁴⁰ en resuspendeer DNA bij ~ 250 ng / ul in RNase-vrij water.
   2. Bereid transposase mRNA zoals in paragraaf 1.1.
3. Mutatie Inductie met Talens (See Cermak 35 voor het ontwerp van Talens)
   1. Gebruik de web-based applicatie om Talens te ontwerpen voor het gen van belang ^42. Indien mogelijk, ontwerp Talens om een ​​restrictie-enzym cut site te verstoren om moleculaire analyse te vergemakkelijken.
   2. Clone Talens en voor te bereiden plasmiden voor transcriptie volgende gepubliceerde protocol ^35.
   3. Transcriberen TALEN mRNA met een Sp6 transcriptiereactie volgens de instructies van de fabrikant en het schoonmaken van mRNA zoals beschreven in paragraaf 1.1.4 transposase. Kwantificeren met een spectrofotometer en verdund tot 200 ng / ul in RNase vrij water. Run TALEN mRNA op een gel om ervoor te zorgen is het de juiste maat en niet zijn aangetast, zoals beschreven in stap 1.1.6.
   4. Ontwerp een paar PCR primers tot ongeveer 100-200 bp rond het TALEN doelsequentie met behulp van een primer design tool en het doelwit DNA-sequentie ⁴³ te versterken. Bestel de geschikte restrictie-enzym te testen van laesies op de doelplaats basis van stap 1.3.1.
4. CRISPR Transgenese (Zie Talbot en Amacher ³⁸ voor het ontwerp en de voorbereiding van CRISPRs):
   1. Ontwerp en voor te bereiden CRISPRs en Cas9 mRNA volgens het protocol ^38, en orde passende controle primers en restrictie-enzymen zoals beschreven in stap 1.3.4.

2. Bereid Injection reagentia

1. Gebruik Borosilicate haarvaten Needles bereiden zoals hieronder beschreven.
   Opmerking: deze capillairen zijn niet de standaard capillairen voor zebravis micro-injectie, en zijn gemaakt van een dikker en sterker glas dat kritisch voor de zware stekelbaars chorion doorboren.
   1. Draag altijd nitril of latex handschoenen bij het trekken van naalden, en niet toestaan ​​dat naalden contact de huid of de huid oliën.
   2. Bepaal micropipet trekken parameters empirisch door ramp tests die na de instructies van de micropipet puller de fabrikant. Bijvoorbeeld, met een doos filament, werden de volgende parameters ontmoedigengedolven optimaal te zijn: (Heat = 515, Pull = 60, Velocity = 60, Delay = 85, druk = 500). Deze instellingen produceren een naald die steil bij ongeveer 12 ° gedurende ~ 2 mm en een lange extensie die taps toeloopt bij ongeveer 2 ° tot ~ 6 mm (figuur 2) taps toeloopt.
      Opmerking: De juiste parameters verschillen per trekker en filament en blind gebruik van een programma zonder bepaling van de parameters eerste tot helling tests kunnen permanent vernietigen van de trekker van filament, die moeilijk en duur om te vervangen.
   3. Volg de instructies van de fabrikant om ten minste 4 micropipet naalden van borosilicaatglas te trekken met de cijfers bepaald in 2.1.2-instellingen.
   4. Store naalden verticaal in capillaire opslag pot met de punt naar beneden.
   5. Vóór het injecteren, plaatst capillaire opslag pot op ijs naalden relaxen. Voeg een stuk vochtige papieren handdoek om de pot om verdamping te voorkomen wanneer de naalden worden gevuld.
2. Bemesten Eieren (AllStappen die worden uitgevoerd bij kamertemperatuur)
   1. Strip ei clutch van zwangere vrouwelijke stekelbaars door zachtjes knijpen in de buik en streelde in een anterieure richting posterior om de eieren uit te duwen door de cloaca en in een 35 x 10 mm ² petrischaal. Voeg een vochtig stuk keukenrol aan één kant van de petrischaal (niet aanraken van de eieren) te bevochtigingskamer maken. Leg het deksel op de petrischaal dus eieren vochtig blijven.
   2. Euthanize mannelijke stekelbaars in 0,025% tricaïne-S gebufferd met 0,1% natriumbicarbonaat.
   3. Opengesneden de buik, verwijder testes en macereren in 250 pl Hank's oplossing (zie Westerfield ⁴⁴ voor de volledige protocol voor Hank's oplossing voorbereiding).
   4. Bemesten ten hoogste 100 eieren met 50 ul sperma-oplossing en roer voorzichtig met een pipet tip om ervoor te zorgen alle eicellen worden bevrucht. Als de koppeling> 100 eieren, bevruchten helft van de eieren later dat alle embryo's op een één-cellig stadium ten tijde van de injectie. Eieren kunnen onbevruchte worden overgelatenbij kamertemperatuur gedurende een uur, en sperma algemeen duurt 1-7 dagen bij 4 ° C in Hank's oplossing.
   5. Houd embryo's bedekt met petrischaal deksel na de bevruchting om uitdroging te voorkomen. Laat 20-25 min voor de eerste cel te voorschijn te komen en opzwellen (bereiden injectie materialen gedurende deze tijd).
   6. Vul een 150 mm x 15 mm petrischaal met stekelbaars water. (Om stekelbaars water te maken, eerst voor te bereiden 10% natriumbicarbonaat opgelost in gedemineraliseerd water. Voeg vervolgens 3,5 g kunstmatig zeewater mix en 0,217 ml 10% natriumbicarbonaat per 1 liter gedemineraliseerd water, en roer / schud krachtig om zout op te lossen.)
3. Bereid Injection Solution (Terwijl Eieren worden bemesting)
   1. Bereid injectieoplossing volgens tabel 1 en op te slaan op ijs.
      Opmerking: de concentraties van bepaalde nucleïnezuren zijn gestegen van die gepubliceerd zebravis wijten aan de toename van de stickleback blastomeer.

Reagens	Tol2 injectie	BAC injectie	TALEN injectie	CRISPR injectie
Tol2 mRNA	350 ng	350 ng	-	-
DNA	150-200 ng plasmide	200-300 ng BAC	-	-
TALEN mRNA	-	-	200 ng elk	-
CRISPR gids RNA	-	-	-	200 ng
Cas9 mRNA	-	-	-	400 ng
0,5% fenolrood inDulbecco PBS	0,5 pl	0,5 pl	0,5 pl	0,5 pl
RNAse gratis water	tot 5 gl	tot 5 gl	tot 5 gl	tot 5 gl

Tabel 1:. Injection reagentia Alle mengsels moeten bereid zijn om een totaal volume van 5 ul en op ijs bewaard.

4. Vul Naalden (On Ice, moet minstens 10 min voor Needles te vullen).
   1. Backfill ten minste drie naalden pipetteren 0,5 pl injectieoplossing op de stompe top van de naald tijdens het naalden verticaal opknoping capillaire opslagkruik. Zorg ervoor dat de daling blijft aan de bovenkant en druipt niet langs de zijkant en vermijd bubbels.
   2. Na de rode vloeistof meestal is afgevoerd naar de spitse punt van de naald, voeg nog 0,5 ul aan het stompe einde van de naald en laat ze uitlekken.

3. Bereid Injecteren Rig en Naalden voor micro-injectie

Let op: Deze stappen cEen gewoonlijk uitgevoerd na bevruchten de eieren.

1. Schakel transilluminatie licht voor de microscoop ontleden en plaats een ~ 13 cm x 13 cm glazen plaat op de microscoop lichte basis met 15 cm gips zaagblad op de top van de glazen plaat ^7. Oriënteren de zaag loodrecht op de injectie-inrichting de uitsparingen gericht naar de naaldhouder.
2. Schakel de luchttoevoer en zorgen voor de druk is ingesteld op ~ 200 kPa van de toezichthouder.
3. Schakel de schakelkast en de instellingen aan te passen. Insteldruk aan ~ 150-175 kPa. Stel duur injectie tot 180 msec.
4. Draai de naald houder, plaatst u een gevulde naald in de houder totdat u weerstand van de rubberen houder kan worden gevoeld, en draai tot vinger vast.
5. Stel de naald hoek ongeveer 45 °.
6. Gebruik micromanipulator controles om de naald te passen zodat het uiteinde in het midden van het gezichtsveld. In- ~ 40x vergroting en focus op de punt van de naald, die niet moet aanrakenonderstaande glas.
7. Zachtjes breken de punt van de naald door vast te pakken met een tang horlogemaker. Idealiter niet loodrecht breken, maar op een ~ 60 °. Vakantie nabij de punt (niet meer dan 2-3 forceps breedte van het uiteinde, figuur 2).

Figuur 2. Ongebroken en gebroken microinjectie naalden. De bovenste naald ongebroken en het uiteinde van de onderste naald is gebroken met een pincet (pijl). Naalden zijn gevuld met een oplossing die 0,05% fenolrood. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Druk op de injectie voetpedaal enkele malen om te testen of de naald is gebroken. Na een paar tikjes, moeten kleine rode druppeltjes beginnen uit t te komenHij beëindigen. Zo niet, probeer het breken van de naald iets hoger.
9. Als de naald heeft een luchtbel, verhoging van de tegendruk unit en druk op de pedaal enkele keren snel naar de bel uit te werken.
10. Stel de tegendruk:
    1. Gebruik de wegwerp overdracht pipet om een ​​paar druppels stekelbaars water te plaatsen op de glasplaat.
    2. Voorzichtig lager de naald in het water.
    3. Verhoog de tegendruk tot een zwakke stroom van roze vloeistof komt uit de naald (met vermelding van positieve druk).
       Opmerking: Als er niet genoeg druk terug, zal de naald het opstellen van het cytoplasma door capillaire werking. Als er te veel tegendruk kan het injectievolume per ongeluk te groot.
    4. Trek de naald zo ver mogelijk zodat het niet zal worden beschadigd wanneer het de embryo's (zie hieronder).
11. Alternatief pas de tegendruk naar een hogere ingestelde druk, zodat een constante sterke stroom vloeistof verlaat de naald wduivin wordt ondergedompeld in water. Dan, het indrukken van het voetpedaal te injecteren overbodig; echter, moet de injectie snel uitgevoerd te hoge injecteren voorkomen.
    Opmerking: Probeer deze techniek bij de eerste leren om te injecteren.

4. Micro-injectie

1. Ongeveer 25 minuten na de bevruchting, gebruik maken van twee 10 pi pipet tips om 5-10 embryo's uit de koppeling en overdracht aan de glasplaat te verwijderen.
2. Met hetzelfde pipet tips voorzichtig scheiden de embryo's in afzonderlijke uitsparingen van het zaagblad. Wees voorzichtig niet om embryo's te doorboren.
3. Met behulp van een overdracht pipet met eind afgesneden zodat stekelbaars embryo's zal passen binnen, voeg genoeg stekelbaars water om de embryo's te dekken, laat op het water voor 3-5 seconden, verwijder dan het overtollige water met de pipet, waardoor een kleine hoeveelheid water coating elk embryo.
   Er zijn te veel water zal de chorions uitharden en breek de naald, maar een kleine hoeveelheid water nodig om de ch heffenOrion weg van de cel en dooier (figuur 3A - B).
4. Te beginnen met de embryo verst verwijderd, schuift u de glasplaat en opnieuw in zodat de eerste embryo ongeveer 25% van het gezichtsveld vult.
5. Laat de naald in het gezichtsveld, gebruik dan de 10 pi pipet tip om voorzichtig te draaien het embryo naar de blastomere, een korrelige, lichtgeel verhoogd bult van cytoplasma op de top van de dooier (figuur 3B) te identificeren, en draai zodat het blastomeer direct loodrecht op het einde van de naald (terwijl het embryo in de inkeping van het zaagblad, Figuur 3C).
   Let op: de dooier druppeltjes kunnen bewegen als het embryo wordt gedraaid, zodat ze niet te gebruiken als een referentiekader voor de locatie van de blastomere.
6. Laat de naald in het cytoplasma, maar niet duwen door de onderliggende dooier. Oefen druk langzaam en gelijkmatig bij het doorprikken van de chorion om te voorkomen dat het breken van de naald. Indien denaald bochten zwaar, trekken en probeer het opnieuw in een iets andere locatie.
7. Trap het voetpedaal 3-4 keer zo injecteren een rode bolus met enigszins diffuse randen vult ongeveer ~ 1/8 van de diameter van het cytoplasma (zie figuur 3D).
   1. Vermijd het verkrijgen van een rode bolus met scherpe randen die niet beginnen te verspreiden, die injectie geeft aan in de dooier onder het cytoplasma (figuur 3E).
   2. Als er een helder roze-rode vlek snel verspreidt, steek de naald verder naar het blastomere doorboren.
   3. Als de injectie bolus geel wordt direct, draai het embryo naar de blastomere is gericht weer te garanderen en te injecteren (figuur 3F).

Figuur 3. Uiterlijk van stekelbaars embryo's voor en na de injectie. Alle embryo's zijn afkomstig uit the perspectief van naar beneden te kijken door de microscoop (met uitzondering van de C en G). (A) Voor het toevoegen van water, bevruchte embryo een uniform uiterlijk met oliedruppeltjes die dichtbij de bovenkant van de dooier. (B) Na het toevoegen van water, het chorion zwelt, het onthullen van een blastomere dat uitsteekt uit de dooier en is zichtbaar in het profiel. (C) rotatie van het embryo, zodat de naald in loodrecht op het chorion en blastomere. (C) Zijaanzicht van een naald die het chorion is doorboord met de punt in het cytoplasma. (D) Injectie in het cytoplasma resulteert in een rode vlek met diffuse randen die vervagen na verloop van tijd. (E) Injectie in de dooier onderliggende het cytoplasma resulteert in een rode vlek met gedefinieerde randen. (F) Injectie in de dooier tegenover het cytoplasma resulteert in een pH-geïnduceerde kleurverschuiving van rood naar geel. (G) Lateraleweergave van de injectie resultaten, met Xs dan sub-ideaal injectie locaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Gebruik de micromanipulator controles om de naald terug te trekken, met behulp van de 10 pi pipet tip ingedrukt houden het embryo als het vasthoudt aan de naald.
9. Na het terugtrekken van de naald, schuif de glasplaat naar de volgende embryo met de naald af te stemmen.
10. Na het injecteren van alle embryo's, gebruik maken van de overdracht pipet om water naar de embryo's in de overdracht pipet en plaats toe te voegen, dan verzamelen ze in 150 mm petrischaal vol stekelbaars water.
11. Droog de glasplaat met een papieren handdoek om te voorkomen dat accumulatie van te veel water.
12. Verdeel verse embryo's op de zaag en herhaal de stappen 4.4 tot 4.10.
13. Houd ~ 10% van de geïnjecteerde embryo's om te garanderen dat niet-geïnjecteerde embryo's normaal ontwikkelen en te gebruiken als wildtype controles voor tHij moleculaire assays hieronder beschreven.

5. Plaats Injection Care

1. Incubeer embryo in petrischalen bij 18 ° C na injectie totdat ¹⁰ uitkomen. Naar aanleiding van het uitbroeden, achter larven in aquaria zoals beschreven ^10.
2. Giet af van de stekelbaars water een dag na injectie en te vervangen door vers water stekelbaars. Vervang met verse stekelbaars water ten minste om de andere dag na dat.
3. Controleren op dode of misvormde embryo's per dag. Verwijder dergelijke embryo's om te voorkomen dat het verval van besmetting van het water.

6. Analyse van injectie tot

1. Voor injectie van fluorescente reporters, monitoren embryo dag in een donkere kamer met een fluorescerende dissectie microscoop met een GFP of RFP filter (afhankelijk fluorescerende transgen). Record anatomische patronen van genexpressie met digitale foto's en / of schriftelijke beschrijvingen en tabellering van het aantal vissen met verschillende expressie domeinen (Figuren 4 en 5).
   Let op: Stekelbaarzen hebben autofluorescente, stellaatcellen pigmentcellen die zichtbaar zijn in het kader van GFP filters vanaf 4 dagen na de bevruchting (DPF).
   1. Om stabiele lijnen te genereren, sparen embryo's met detecteerbare fluorescentie en te groeien naar volwassenheid, zoals beschreven ^10.
   2. Outcross geïnjecteerd volwassen vissen om wild-type vis met behulp van de in vitro fertilisatie procedure in paragraaf 2.2 en het scherm nakomelingen voor fluorescentie beschreven zoals beschreven in stap 6.1 om te zoeken naar fluorescerende nakomelingen, wat aangeeft succesvolle transgene transmissie.
   3. Om fluorescentie in uitgekomen, vrij zwemmende larven te visualiseren, voeg 500 ul 0,8% tricaïne naar de 150 mm petrischaal te vissen verdoven en te wachten tot de vis stoppen met bewegen om de afbeelding. Onmiddellijk spoelen meerdere malen met vers water stekelbaars volgende waarneming en beeldvorming.
   4. Eventueel fluorescentie voor verdere beeldvorming behouden inslapen larven0,025% (250 mg / l) tricaïne gebufferd met 0,1% natriumbicarbonaat en vaststellen voor 4 uur in 4% paraformaldehyde in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C. Bewaren in 1x PBS gedurende maximaal twee weken.
      Let op: De achtergrond van auto-fluorescentie toeneemt in de tijd.
2. Diagnostische PCR / spijsvertering genotypering voor Mutation Inductie met CRISPRs of Talens - Best Speelde op 2 dagen na de bevruchting.
   1. Gebruik een transfer pipet tot 10 geïnjecteerde embryo's (2 DPF, nog steeds in chorions) te plaatsen in de eerste 10 putjes van een 12-wells PCR-strip buis. Plaats geïnjecteerde controlevissen in de laatste twee putten.
   2. Verwijder overtollig water stekelbaars.
   3. Voeg 50 ul lysisbuffer (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM _MgCl2, 0,3% Tween-20 en 0,3% NP-40) aan elk putje.
   4. Plaats caps op buizen en incubeer bij 95 ° C gedurende 20 min in een thermocycler.
      Opmerking: de dooier zal wit en rubberachtig zet na het koken stap.
   5. Verwijder deksels en gebruik een andere cluseen 1000 ui pipet tip om de embryo in elke buis verweken.
      Opmerking: White vuil verzamelt op de bodem van de buis.
   6. Voeg 2,5 gl 10 mg / ml proteïnase K aan elk putje.
   7. Vervang deksels en incubeer bij 55 ° C gedurende 1 uur om eiwitten te verteren, gevolgd door 95 ° C gedurende 20 min om proteinase K te inactiveren Store bij -20 ° C om schimmelgroei te voorkomen.
   8. PCR uitvoeren met behulp van een high-fidelity polymerase volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de embryo lysaat als DNA-template.
      Opmerking: Wees voorzichtig om vloeistof uit de top van de buis voor DNA-template te verwijderen, het vermijden van zichtbare chorion of eigeel puin op de bodem van de buis.
   9. Meng de PCR-product in gelijke volume met een restrictie-enzym master mix bestaande uit 1x enzyme-specifieke buffer en 0,25 ul enzym per monster. Bewaar altijd de helft van de ongesneden PCR product te testen op een gel te bevestigen PCR producten zijn de voorspelde grootte. Incubeer de PCR enzym gemengd met de geschikte omstandigheden voorhet restrictie-enzym.
      Opmerking: Sommige enzymen kunnen andere verhoudingen van enzymbuffer PCR product nodig; pas de bufferconcentratie als de niet-geïnjecteerde controles geen volledige digestie tonen.
   10. Na digestie werking gestelde producten op een 1% agarosegel naast een DNA maat ladder verwachte product afmetingen bevestigen.
       Opmerking: Uncut bands geïnjecteerde embryo's de aanwezigheid van moleculaire veranderingen (figuur 6) en niet-geïnjecteerde controles moeten volledig gedigereerd interpreteren.
   11. Om letsels te bevestigen, uitgesneden ongesneden bands uit agarosegels en zuiveren van DNA met een gel extractie kit. Gebruik Sanger sequentiebepaling, idealiter met een sequentie primer intern in de PCR-primers, laesies bevestigen. In F ₀ embryo geïnjecteerd, een mix van laesies die mogelijk aanwezig zijn, waardoor de kwaliteit van de Sanger gelezen te worden afgebroken bij de doelplaats.
   12. Om een ​​stabiele lijn te produceren, op te slaan alle geïnjecteerde embryo's uit de klauwen van die positieve screening voor moleculaire laesies. Groeien up vis, outcross, en vervolgens screenen een subset van F ₁ embryo's voor moleculaire laesies, zoals beschreven in de stappen 6.2.1 tot 6.2.11. Als heterozygote dragers worden geïdentificeerd, groeit de resterende F ₁ embryo's naar volwassenheid en identificeren van heterozygote individuen met behulp van DNA geëxtraheerd uit een staartvin clip.

Results

Voor reportergen transgenen die enhancer activiteit, zal succesvol injectie resulteren in specifieke cellulaire expressie van het transgen (Figuur 4A, 4C). Geïnjecteerd vis kan vervolgens worden outcrossed om stabiele lijnen (voorbeeld van een BAC stabiele lijn weergegeven in figuur 4B) te produceren. Het injecteren van DNA in stekelbaars embryo resulteert meestal in veel hogere sterfte dan RNA alleen. Typerend te zien tot 50% (soms meer...

Discussion

Het injecteren van een cel stekelbaars embryo's voor transgenese of genoom bewerken presenteert drie grote uitdagingen. In de eerste plaats ten opzichte van de zebravis embryo's, de stekelbaars embryonale chorion is taai en zal vaak breken naalden. Dit probleem kan gedeeltelijk worden ondervangen door dikker en sterker glazen micropipetten en injecteren loodrecht op het chorion (zie protocol figuur 2). Zorgen dat zo min mogelijk water wordt toegevoegd aan het embryo (net genoeg om de oorzaak cho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with transillumination	Leica	S6e/ KL300 LED
Manual micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33	Marzhauser M33 Micromanipulator
Pressure Injecion system	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Magnetic base holder	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic base
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Iron plate (magnetic base)	Narishige	IP
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Disposable transfer pipettes	Fisher	13-711-7M
0.5% phenol red in DPBS	Sigma	P0290	injection tracer
#5 forceps, biologie dumoxel	Fine Science Tools	11252-30	for needle breaking
Micropipette Storage Jar	World Precision Instruments	E210	holds needles
6", 6 teeth per inch plaster drywall saw	Lenox	20571 (S636RP)	hold eggs for injection
13 cm x 13 cm glass plate	any hardware store	-
Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100-F4	*harder glass than zebrafish injection capillaries
150 x 15mm Petri dish	Fisher	FB0875714	raise stickleback embryos
35 mm x 10 mm Petri dish	Fisher	08-757-100A	store eggs pre-injection
Instant Ocean Salt	Instant Ocean	SS15-10
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Tricaine methanesulfonate/MS-222	Western Chemical Inc	MS222	fish anaesthesia/euthanasia
Sp6 transcription kit	Ambion	AM1340	For transcription of TALENs and transposase mRNA
RNeasy cleanup kit	Qiagen	74104	purify transposase or TALEN RNA
QiaQuick PCR cleanup kit	Qiagen	28104	clean up plasmids for injection
Proteinase K 20 mg/ml	Ambion	AM2546	for DNA preparation
Nucleobond BAC 100 kit	Clontech	740579	for BAC DNA preparation
NotI	NEB	R0189L
Phusion polymerase	Fisher	F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit	Qiagen	12943	contains endotoxin rinse buffer
QIAQuick Gel Extraction	Qiagen	28704	for sequencing induced mutations
Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol	Sigma	P2069-100ML
Sodium acetate	Sigma	S2889-250G
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma	E7023-500ML
Agarose	Sigma	A9539
50x Tris-acetate-EDTA buffer	ThermoFisher	B49
0.5-10 Kb RNA ladder	ThermoFisher	15623-200
Nanodrop  Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Paraformaldehyde	Sigma	158127-500G
10x PBS	ThermoFisher	70011-044
1 kb Plus DNA Ladder	ThermoFisher	10787-018
Potassium Chloride	Sigma	P9541-500G
Magnesium Chloride	Sigma	M8266-100G
NP-40	ThermoFisher	28324
Tween 20	Sigma	P1379-500ML
Tris pH 8.3	Teknova	T1083
12-strip PCR tube	Thermo Scientific	AB-1113