Dissection en Flat-montage van de driedoornige stekelbaars branchial Skeleton

Summary

Het branchiale skelet, inclusief kieuwbogen, keeltanden en branchiale botten, dient als de primaire plaats voor voedselverwerking bij de meeste vissen. Hier beschrijven we een protocol om dit interne skelet in drie-stekelige stekelbaarzen te dissecteren en plat te monteren. Deze methode is ook toepasbaar op een verscheidenheid aan andere vissoorten.

Abstract

De achterste faryngeale segmenten van het kopgedeelte van gewervelde dieren geven aanleiding tot het branchiale skelet, de primaire plaats voor voedselverwerking bij vissen. De morfologie van het branchiale skelet van vissen is aangepast aan het dieet van een soort. Driedoornige stekelbaarsvissen (Gasterosteus aculeatus) zijn uitgekomen als een modelsysteem om de genetische en ontwikkelingsbasis van geëvolueerde verschillen in een verscheidenheid aan eigenschappen te bestuderen. Mariene populaties van stekelbaarzen hebben herhaaldelijk talloze nieuwe zoetwatermeren en beken gekoloniseerd. Aanpassing aan het nieuwe dieet in deze zoetwateromgevingen ligt waarschijnlijk ten grondslag aan een reeks craniofaciale veranderingen die herhaaldelijk zijn geëvolueerd in onafhankelijk afgeleide zoetwaterpopulaties. Deze omvatten drie belangrijke patroneringsveranderingen aan het branchiale skelet: verminderingen in het aantal en de lengte van kieuwrasterbeenderen, toenames in het aantal faryngeale tanden en verhoogde lengte van branchiale botten. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om het interne branchiale skelet in driedoornige stekelbaarsvissen te dissecteren en plat te monteren. Dissecto van het volledige driedimensionale branchiale skelet en het plat monteren in een grotendeels tweedimensionale voorbereiding, maakt het gemakkelijk om de morfologie van het branchiale skelet te visualiseren en te kwantificeren. Deze dissectiemethode is goedkoop, snel, relatief eenvoudig en toepasbaar op een grote verscheidenheid aan vissoorten. Bij stekelbaarzen maakt deze efficiënte methode de kwantificering van skeletmorfologie mogelijk in genetische kruisingen om genomische regio's te kaarten die craniofaciale patronering controleren.

Introduction

Een ongelooflijke hoeveelheid diversiteit bestaat in het hoofd skelet onder de gewervelde dieren, vooral bij vissen. In veel gevallen faciliteert deze diversiteit verschillende voerstrategieën ^1-4, en kan grote veranderingen voor zowel externe als interne craniofaciale patronen te betrekken. De branchial skelet wordt intern in de keel van een vis en omringt de meeste van de mondholte. De branchial skelet bestaat uit 5 serie homologe segmenten, de voorste vier waarvan ondersteunen de kieuwen. Samen vormen deze vijf segmenten fungeren als een interface tussen vissen en hun eten ^5. Variatie in een veelheid van eigenschappen, waaronder kieuw rakers, keelholte tanden en botten branchial bijdragen aan efficiënte foerageren op verschillende soorten voedsel.

Stekelbaarsjes hebben een adaptieve radiatie na voorouderlijke oceanische vormen gekoloniseerd zoetwatermeren en kreken in het hele noordelijk halfrond ondergaan. De verschuiving in het dieetvan kleine zoöplankton in de oceaan om grotere prooi in zoet water heeft geleid tot een dramatische trofische variatie in verscheidene craniofaciale ⁶ trekken. Hoewel veel studies hebben zich gericht op externe craniofaciale verschillen in stekelbaars ^7-13, belangrijk craniofaciale veranderingen evolueren herhaaldelijk in de interne branchial skelet. De mogelijkheid om vruchtbare hybriden te creëren tussen morfologisch verschillende stekelbaars populatie biedt een uitstekende gelegenheid om de genetische basis van geëvolueerd wijzigingen in de branchial skelet in kaart.

Een trofische kenmerk van ecologische betekenis is de patroonvorming van kieuw Rakers, periodieke huid botten die de voorste en achterste vlakken van de branchial botten lijn en worden gebruikt om prooidieren te filteren. Vis die meestal voeden met kleine prooien hebben de neiging om langer en dichter afstand kieuw Rakers in vergelijking met vissen die zich voeden met grotere prooi ^14,15 te hebben. Variatie in kieuw rakers is gemeld zowel within en tussen soorten ^14-19, en aspecten van kieuw raker patroonvorming bijdragen aan trofische niches en fitness ^16. Decennia van onderzoek hebben uitvoerig gedocumenteerd kieuw asfaltwerker aantal en de lengte variatie in threespine stekelbaars ^17-21; Echter, deze studies meestal richten zich op de eerste rij van de kieuw Rakers. Recent onderzoek heeft aangetoond modulariteit in de genetische controle van de kieuw asfaltwerker nummer over de branchial skelet ^22,23 en over een enkele rij in kieuw asfaltwerker spatiëring ²³ en de lengte ²⁴ nadruk op het belang van het bestuderen van meer dan één rij of een enkele kieuw asfaltwerker naar het begrijpen ontwikkelingsstoornissen genetische basis van kieuw asfaltwerker reductie.

Een tweede trofische eigenschap van zowel de ecologische en biomedische betekenis is de patroonvorming van de keelholte tanden. Tanden bij vissen kan worden in zowel de orale kaak en de branchial skelet, bekend als faryngeale tanden. Orale tanden worden voornamelijk gebruikt voor prey vast te leggen terwijl de keelholte tanden worden gebruikt voor het kauwen en prooi manipulatie ^25-27. Beide sets vormen via gedeelde ontwikkelingsstoornissen mechanismen en zijn ontwikkelingsgebied homoloog ²⁸ beschouwd. Interessante modulariteit voordoet waarbij sommige soorten, zoals de zebravis, gebrek mondelinge en dorsale keelholte tanden ^29, terwijl andere soorten hebben meerdere getande ceratobranchials, pharyngobranchials, en soms basihyal getande en hypobranchials ^30. In stekelbaarsjes zijn keelholte tanden ventraal op de vijfde ceratobranchial en dorsaal op de voorste en achterste gevonden pharyngobranchials ^31. Kinematica op stekelbaars voeden tonen de orale kaak wordt voornamelijk gebruikt voor hun prooi vangen en te vergemakkelijken zuigvoeding ⁹ verlaten van het kauwen op de keelholte kaak. In cichliden, lagere keelkaak morfologie varieert enorm ^32,33 en is aangetoond dat adaptieve en gecorreleerd met trofische niche ³⁴ te zijn. Multiple zoetwater stekelbaars populaties dramatische toename in ventrale keelholte tand nummer ^23,35,36 geëvolueerd. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de ontwikkelingsstoornis genetische basis van deze geëvolueerd tand winst is grotendeels onderscheiden in twee onafhankelijk afgeleid populaties van zoetwater stekelbaarsjes ^36. In tegenstelling tot zoogdieren tanden, vis regenereren hun tanden continu tijdens het volwassen leven ^37. Beide eerder beschreven hoge getande zoetwater bevolkingsgroepen hebben een versneld tand replacement rate geëvolueerd, waardoor een zeldzame gewervelde systeem om de genetische basis van de regeneratie ³⁶ te bestuderen.

Een derde trofische eigenschap die herhaaldelijk in zoet water stekelbaars is geëvolueerd is langer epibranchial en ceratobranchial botten, de branchial boog gesegmenteerde homologen van de boven- en onderkaak, respectievelijk ^38. Langere branchial botten verlenen een grotere mondholte en waarschijnlijk zijn adaptieve voor het toestaan ​​van grotere prooien naar c te zijnonsumed. Bovendien in andere vissen, epibranchial botten zijn belangrijk voor depressie van de dorsale faryngeale tandplaten ^25. Net als kieuw Rakers en keelholte tanden, de branchial botten zijn interne en dus moeilijk om gemakkelijk te visualiseren en te kwantificeren.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te ontleden en een flatscreen-monteer de branchial skelet, zodat u gemakkelijk visualisatie en kwantificering van een aantal belangrijke craniofaciale eigenschappen. Hoewel dit protocol beschrijft een stekelbaars dissectie, dezelfde methode werkt op een verscheidenheid van andere vissen.

Protocol

Alle vis werk werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of California-Berkeley (protocol nummer R330). Euthanasie werd uitgevoerd middels onderdompeling in 0,025% tricaïne-S gebufferd met 0,1% natriumbicarbonaat ^39. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

1. Voorbereiding

Opmerking: Voer de stappen 1,1-1,5 in conische buizen of scintillatieflesjes die goed kunnen dichten en horizontaal gelegd. Vis hoeven niet voortdurend worden geschud, maar proberen om de oplossing te mengen zoveel mogelijk door voorzichtig omkeren of schudden van het rek met buisjes of flesjes naar alle kanten van de vis blootstelt aan de kleuroplossing en laat vlek het weefsel gelijkmatig doordringen. Plaats geen grote partij van de vis op een platform shaker, zoals het zware gewicht van de vloeistof de shaker zal breken.

1. Fix ofwel vers gedood vis of vis opgeslagen in ethanol met 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) gedurende de nacht. U kunt ook gebruik maken van 4% Paraformaldehyde in 1 x PBS-oplossing in plaats van 10% NBF.
   Opmerking: als het extraheren van DNA, clip een klein deel van de staart of borstvinnen voorafgaand aan de fixatie en op te slaan in ethanol.
2. Gooi fix behoren in een chemische kap en vervang met leidingwater (dat wil zeggen ~ pH 7,0) gedurende 2 uur. Vermijd het gebruik van de-geïoniseerd water als het vaak zuur kan zijn en kan bot ontkalken.
3. Verwijder water en vlek vis met 0,008% alizarinerood S in 1% KOH in water gedurende 24 uur. Voor vis minder dan 20 mm standaard lengte, gebruiken 0,004% alizarinerood S. (Voeg een 100x (0,8%) stock oplossing van alizarinerood S, die vervolgens kunnen worden verdund).
4. Verwijder vlek (het opzetten van de juiste afvalcontainer in kap) en plaats vis in leidingwater voor een paar uur. Ververs het water indien nodig tot het water spoelen is meestal duidelijk.
5. Verwijder water en plaats vis in 50% glycerol, 0,25% KOH voor milde clearing en de daaropvolgende dissectie.
   Opmerking: Deze kleuring protocol wordt gewijzigd ten opzichte van eerder beschreven methoden ^40,41.

2. ontleding

Let op: Zie figuur 1 voor een overzicht van relevante hoofd van het skelet morfologie.

Figuur 1:. Stickleback hoofd skelet morfologie alizarinerood gekleurd driedoornige stekelbaars hoofd afgebeeld met fluorescentie onder een rhodamine B-filter set. Bruikbare morfologie is gelabeld: Op = opercle, Subop = subopercle, BSRS = branchiostegal stralen, Preop = preopercle, Infraorb 1-3 = infraorbitale 1-3 (ook wel circumorbitals of suborbitals), Dent = dentary, Premax = premaxilla, Max = bovenkaak , Nas = neus, Lat. ETHM = laterale ethmoid, Psph = parasphenoid, Fron = frontale bot. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van de stekelbaars hoofd skelet, zie Anker (1974) ^31. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.

1. Leg de vissen vlak (Figuur 2A) en plaats tang scherpe # 5 horlogemaker in de zijkant van het oog op een ~ 45 ° hoek ten opzichte van de membraan dat het oog te prikken.
2. Schil de membraan van het oog, vergelijkbaar met een peeling yoghurt deksel (figuur 2B).
3. Inbouw open pincet achter het oog, greep van de oogzenuw achter het oog te grijpen, en verwijder het oog (figuur 2C). Laat de ogen niet prikken als het melanine zal lekken. Als doorboord, melanine kan worden verwijderd tijdens de latere stappen gewassen.
4. Herhaal dit aan de andere kant.
5. Vanaf de achterste, plaats een kleine dissectie schaar mes onder de opercle flap, drag scissor blade dorsaal boven opercle en snijd zacht weefsel door de oogkas (figuur 2D). Snijd dorsale de opercle bot.
6. Snijd de frontale bot (dorsale aan de oogkas) (Figuur 2E).
7. Snijd de middellijn parasphenoid bot rondom thij midden van de oogkassen (figuur 2F).
8. Herhaal opercle bezuinigen op de tegenoverliggende kant.
9. Steek tang onder de opercle en schil langzaam het gezicht van het lichaam af, trimmen ander zacht weefsel nog steeds verbonden (figuur 2G - H). Let er dan op de eerste rij van de kieuw Rakers verstoren.
   1. Met een pincet, verwijder de ceratohyals aan beide zijden van de middellijn basihyal terwijl pellen en het verwijderen van de voorste craniofaciale skelet (het hele kaak inclusief de dentary, premaxilla en bovenkaak, het hele tongbeen skelet met inbegrip van de buitenkant van de huid opercle, preopercle, subopercle, en branchiostegal stralen en de onderliggende dorsale en ventrale endochondrale elementen, en het voorste deel van de schedel, inclusief de neus, laterale ethmoid en infraorbitale botten, zie figuren 1 en 2I).
   2. Bekken stekels kan worden uitgevouwen uit het lichaam, en kan als een handvat voor tang greep o grijpen dienenf indien aanwezig. Stekels vastklikken. Om te ontgrendelen, trek rug met een pincet direct uit de buurt van vis lichaam, dan buig naar achteren aan rug plat tegen vis op.
10. Steek gesloten tang posterior en ventrale naar de branchial skelet (net onder darm buis) en sleep tang naar voren, plagen elkaar de resterende spieren en ligamenten aan de branchial skelet (figuur 2J - K).
11. Met behulp van de tips van de gesloten tang, schraap de spieren het bevestigen van de dorsale branchial skelet aan de ventrale hersenpan in een posterior naar anterior richting (figuur 2L).
12. Herhaal 2.9 en 2.10 op de tegenoverliggende kant.
13. Pak de onderkant van de darm buis en trek naar voren om de branchial skelet en de darmen buis (figuur 2 M - N) te verwijderen.
14. Scheid de darm buis door een snede loodrecht op het achterste einde van de vijfde ceratobranchial (Figuur 2O ).
15. Na het verwijderen van alle resterende botfragmenten van de hersenpan aan de rugzijde van de branchial skelet, plaatst een schaar in de branchial korf een dorsale snede (cutting anterior naar posterior) tussen de bilaterale stellen dorsale tandplaten (Figuur 3A - D) te maken. Zorg ervoor dat gesneden is gecentreerd om te voorkomen dat schade aan de dorsale tand platen.
16. Maak twee ondiepe zijdelingse sneden in de rubberachtige darmlumen aan het achterste uiteinde van de branchial skelet (voorste uiteinde van buis darm) om te helpen bij het ​​openen van de branchial skelet (figuur 3E).
17. Plaats vis en alle weefselstukken in een pot en plaats de branchial skelet in een microcentrifuge buis met 50% glycerol, 0,25% KOH tot zachtjes clearing of 100% glycerol blijven indien geen verdere opheldering nodig. Label potjes en tubes met een unieke identifier, zodat ze kunnen worden gevolgd. De hoeveelheid clearing vereist is grotendeels een functie van de grootte van de vis, grote volwassen vissen (meer dan 40 mm in standaardlengte) vergen doorgaans extra clearing.

Figuur 2:. Stickleback branchial skelet dissectie alizarinerood gekleurd driedoornige stekelbaars vis klaar voor dissectie. Het oog wordt gepigmenteerd van het uitgebreide clearing. Blauwe pijlen geven de bewegingsrichting. (A) Zij mening van stekelbaars hoofd, anterior is aan de rechterkant. (B) verwijdering van membraan dat het oog. (C) Verwijdering van het oog. (D) Dorsale snijden boven de opercle. (E) Frontale bot cut. (F) Parasphenoid gesneden. (G - I) Verwijdering van het gezicht skelet. (J) Verwijdering van ventrale branchial skelet zacht weefsel verbindingen. (K - L) Verwijdering van dorsale branchial skelet verbindingen. ( M - N) Verwijdering van de branchial skelet. (O) Scheid de darm buis uit het branchial skelet. Zie stappen 2.1 tot 2.16 voor meer informatie. Schaal bar = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. branchial Skeleton Re-kleuring (indien nodig)

1. Om de branchial skelet donkerder of duidelijke weefsel meer vlekken, verwijderen 50% glycerol, 0,25% KOH-oplossing en was met 1% KOH twee keer (een vijf minuten wassen gevolgd door een tweede 24-uurs wassen terwijl horizontaal schudden op een platform shaker).
2. Verwijderen 1% KOH en re-vlek met 0,008% alizarinerood S in 1% KOH gedurende 24 uur.
3. Verwijderen vlek en vervangen door 1% KOH gedurende 24 uur.
4. Verwijder KOH-oplossing en te vervangen door 50% glycerol, 0,25% KOH.

4. Montage branchial Skeleton

1. Verwijder branchial skeletvan 50% glycerol, 0,25% KOH of 100% glycerol en plaats dichtbij de bodem van een 22 mm x 60 mm dekglaasje met de dorsale zijde naar boven (Figuur 3F). Voeg enkele druppels 50% glycerol, 0,25% KOH of 100% glycerol bovenop branchial skelet. Als de overgang van 50% glycerol, 0,25% KOH tot 100% glycerol, verandering oplossing in een microcentrifugebuis en schud> 5 min voorafgaand aan de montage van het weefsel in evenwicht.
2. Uitrol twee kleine balletjes van boetseerklei en plaats aan beide zijden van het deksel slip op te treden als afstandhouders.
3. Losjes plaats een tweede dekglaasje op de top met voldoende druk om de voorste branchial skelet (Figuur 3G) plat.
4. Schil open de linker dorsale flap inclusief dorsale tand platen, plat, en schuif tussen de dekglaasjes (Figuur 3H).
5. Herhaal de techniek met de juiste dorsale klep en duw hele branchial skelet uit de buurt van de rand van het dekglaasje (figuur 3I).
   1. Wijzigennative, houd beide dorsale flappen geopend met een pincet en zorgvuldig plaats het dekglaasje op, afvlakking van de branchial skelet in een vloeiende beweging.
   2. Als alternatief, zet de branchial skelet ondersteboven op een dekglas, wijd te spreiden elke dorsale zijde zijdelings zodat de zwaartekracht niet toestaan ​​dat de branchial skelet om een ​​back-up te sluiten. Bedek met een tweede 22 mm x 60 mm glazen afdekplaat slip en omkeren prep.
      Opmerking: Verschillende montage technieken hebben de neiging om beter of slechter voor elke individuele werken. Probeer elke en zien wat voelt zich het meest comfortabel.
6. Zachtjes druk op de top dekglaasje klei ballen genoeg om de branchial skelet te houden plat gemonteerde flatscreen, maar zorg het monster niet te verpletteren.
   1. Tijdens de montage-proces, kan ceratobranchials draaien en obscure een rij van Rakers. Verhelpen dit door te schuiven tang tussen de dekglaasjes en opnieuw oriënteren van de ceratobranchials of hele branchial skelet.
7. Store preps flat in slide trays op roOM temperatuur. Gemonteerd in 100% glycerol, kunnen bereidingen worden bewaard tussen overbrugd dekglaasjes minstens tien jaar. Schone pincet en een schaar met isopropanol of ethanol en dekking tips.

Figuur 3:. Vlak monteren van de branchial skelet Manipulatie en montage van de branchial skelet weergegeven. Blauwe pijlen geven de bewegingsrichting. (A) branchial skelet dorsale kant naar boven. (B - D) Rotatie en incisie tussen de dorsale tand platen. (E) lateraal gesneden in zacht weefsel aan de basis van de darm buis verder te openen. (F) branchial skelet geplaatst op de bodem van een dekglaasje klaar voor montage. (G) tweede dekglaasje geplaatst op de voorste helft van de branchial skelet (hierboven dorsale tandplaten). (H - I)Vlakke montage van de branchial skelet door het openen van dorsale tand plaat kleppen en schuiven tussen twee dekglaasjes. Zie stappen 4.1 tot 4.6 voor meer informatie. Schaal bar = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Dit protocol leidt tot een uitgesneden en vlak gemonteerd branchial skelet (figuur 4) waarbij een aantal verschillende belangrijke trofische eigenschappen kunnen worden gekwantificeerd. Vanuit een dorsale weergave kunt alle rijen van kieuw Rakers, alle keelholte tand platen, en bijna alle branchial beenderen gemakkelijk worden gevisualiseerd en gekwantificeerd ^{22 - 24,35,36,38,42.} Alizarine rood fluoresceert ook een rhodamine en der...

Discussion

Het branchiale skelet is een complexe set botten in de keel van een vis die voedselitems manipuleert, filtert en vermalen op hun weg naar de slokdarm. Veel interessante trofische eigenschappen, waaronder de patronen van kieuwbogen, faryngeale tanden en branchiale botten, variëren tussen en binnen soorten. Het merendeel van deze kenmerken is moeilijk tot bijna onmogelijk om nauwkeurig te meten met het branchiale skelet in situ (bijv.. lengte van de kieuwbogen, lengte van de branchiale botten). Dit protoc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kaliumhydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893-4L
10% Neutraal Gebufferd Formaline (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarine Rood S	EMD	AX0485-3
Microscoopdekglazen 22 mm x 60 mm	VWR	16004-350
100 mm x 10 mm glazen petrischaal	Kimble Chase	23064-10010	Om monsters te dissekeren op
Sylgard 184 Siliconen Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Kan in glazen of plastic petrischalen worden gegoten om dissectieplaten te maken
Modelleerklei	Sargent Art	22-4000	1 lb roomkleur
Scintillatiebuisjes (doos van 500)	Wheaton	986586	Borosilicaatglas met schroefdop
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars zijn een alternatief
Dissectie schaar	FST	15003-08	Alternatieve maten zijn beschikbaar, afhankelijk van de grootte van het monster
Dissectiemicroscoop	Leica	S6E met KL300 LED	Veel andere modellen werken ook goed, een platte basis helpt
Microcentrifugebuisjes 1,7 ml	Denville	C2170
Karton glijplaat	Fisher	12-587-10