Beoordeling van Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Samenvatting

Dit document beschrijft een protocol dat de veranderingen in de myofilament Ca²⁺ gevoeligheid tijdens contractie in geïsoleerde hartspiercellen van rattenhart beoordeelt. Samen met cardiale elektrofysiologie, systolische/diastolische cytosol Ca²⁺ niveaus en contractie/relaxatie, is deze meting onmisbaar voor het onderbouwen van de mechanismen die de excitatie-contractiekoppeling in gezonde en zieke harten mediëren.

Samenvatting

Hartfalen en hartritmestoornissen zijn de belangrijkste oorzaken van sterfte en ziekte wereldwijd. Toch blijft het mechanisme van de pathogenese en myocardiale storing in het zieke hart volledig worden opgehelderd. Recente overtuigend bewijs toont aan dat veranderingen in de myofilament Ca2 ⁺ gevoelige invloed intracellulair Ca2 ⁺ homeostase en ionkanaal activiteiten in cardiomyocyten, essentiële mechanismen verantwoordelijk voor de cardiale actiepotentiaal en inkrimping van gezonde en zieke harten. Sterker nog, de activiteiten van ionkanalen en transporteurs onderliggende cardiale actiepotentialen (bijvoorbeeld Na ^+, Ca ²⁺ en K ⁺ kanalen en de Na ⁺ -Ca ²⁺ wisselaar) en intracellulaire Ca ²⁺ hanteren eiwitten (bijv., Ryanodinereceptor en Ca ²⁺ -ATPase in sarcoplasmatisch reticulum (SERCA2a) of fosfolamban en de fosforylatie) worden gewoonlijk gemeten evaluat de fundamentele mechanismen van cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling. Zowel elektrische activiteiten in de membraan en intracellulaire Ca2 ⁺ veranderingen de triggersignalen van EC koppeling, terwijl myofilament de functionele eenheid van samentrekking en ontspanning en myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid noodzakelijk is in de uitvoering van myofibril prestaties. Niettemin weinig studies nemen myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid in de functionele analyse van het myocardium tenzij het ​​het focus van de studie. We beschrijven een protocol dat sarcomeer verkorting / re-verlenging en het intracellulaire Ca2 ⁺ level behulp Fura-02:00 (ratiometrische detectie) en de veranderingen van myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid van cardiale myocyten van ratteharten evalueren meet. Het belangrijkste doel is om te benadrukken dat myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid moet in de EG-koppeling in aanmerking worden genomen voor mechanistische analyse. Uitgebreid onderzoek van de iop de kanalen, ion transporters, intracellulaire Ca ²⁺ handling en myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid die myocyte contractiliteit in gezonde en zieke harten ten grondslag liggen zal waardevolle informatie voor het ontwerpen van meer effectieve strategieën van translationeel en therapeutische waarde.

Inleiding

Cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling de grondschema voor de analyse mechanische eigenschappen van het myocardium, dwz de contractiele functie van het hart ^1,2. EG koppeling wordt geïnitieerd door membraandepolarisatie secundair aan de activiteiten van sarcolemmale ionkanalen (bijvoorbeeld het spanningsgevoelige Na ⁺ kanaal, welke kan worden gemeten met patch-clamp techniek). Daaropvolgende activering van spanningsafhankelijke L-type Ca ²⁺ kanalen (LTCCs) en Ca ²⁺ influx via LTCCs leiden tot het grootste deel van Ca ²⁺ vrijkomen door middel van ryanodinereceptor (RyRs), het verhogen van de cytosolische Ca ²⁺ concentratie van het nanomolair (nM ) naar micromolair (uM) niveau. Een dergelijke verhoging van cytosolisch Ca2 ⁺ bevordert Ca2 ⁺ binding aan troponine C (TnC) in dunne filamenten en wekt conformatieveranderingen van het filament complex aan de actine-myosine interactie vergemakkelijken en bereikt myocardial contractie ^3. Omgekeerd, het cytosolische Ca2 ⁺ weer wordt uptaken terug in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) via Ca2 ⁺ -ATPase in SR (SERCA2a) of buiten de myocyten geëxtrudeerd via de Na ⁺ / Ca2 ⁺ uitwisselaar en plasmalemmal Ca2 ⁺ ATPase ^1,2. Bijgevolg is de daling van cytosolische Ca2 ⁺ aanzet conformatieveranderingen van dunne filamenten terug naar de oorspronkelijke toestand, waardoor de dissociatie van actine-myosine en myocyt ontspanning ^1-3. In dit schema wordt de activiteit van SERCA2a algemeen beschouwd als de snelheid van myocardiale relaxatie bepalen omdat het goed is voor 70-90% van cytosolische Ca ² verwijderd in de meeste zoogdiercellen hartcellen ^1. Als zodanig abnormale Ca ²⁺ behandeling door LTCC, RyR en SERCA2a, etc. werd beschouwd als de belangrijkste mechanismen voor de verminderde contractiliteit en ontspanning in het zieke hart ^1-4.

In werkelijkheid, vrije cytosolische Ca ²⁺ die fungeert als de boodschapper in EC koppeling is goed voor ongeveer 1% van de totale intracellulaire Ca ²⁺ en de meerderheid van Ca ²⁺ is gebonden aan de intracellulaire Ca ²⁺ buffers ^5,6. Dit komt door het feit dat verschillende Ca2 ⁺ buffers zijn overvloedig in cardiomyocyten, bijvoorbeeld membraanfosfolipiden, ATP, creatinefosfaat, calmoduline, parvalbumine, myofibril TnC, myosine, SERCA2a en calsequestrin de SR. ^5,6,7. Onder hen, SERCA2a en TnC de overheersende Ca2 ⁺ buffers ^5,6,7. Bovendien Ca2 ⁺ binding aan de buffers is een dynamisch proces in zenuwtrekking (bijvoorbeeld, 30-50% Ca2 ⁺ bindt aan TnC en losmaken van het tijdens Ca2 ⁺ transiënten ⁷⁾ en de verandering in Ca2 ⁺ binding veroorzaken aanvullende "vrijgeven" van vrij Ca2 ⁺ het cytosol, leidt tot veranderingen van de intracellulaire Ca2 ⁺ concentration. Derhalve verstoring van de intracellulaire Ca2 ⁺ niveau induceert myofilament abnormale bewegingen, die de voorlopers van contractiele dysfunctie en hartritmestoornissen ^8,9 zijn. Vele factoren (zowel fysiologische en pathologische) kunnen de bronnen van post-transcriptionele modificaties van myofilament eiwitten, die myofilament Ca ²⁺ buffering en myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid ^8-10 beïnvloeden. Onlangs werd gerapporteerd dat mutaties in myofilament eiwitten verhogen Ca2 ⁺ bindingsaffiniteit en intracellulaire Ca2 ⁺ handling, triggering pauze-afhankelijke versterking Ca2 ⁺ transiënten, abnormale Ca2 ⁺ afgifte, en hartritmestoornissen ^8. In overeenstemming met dit concept, hebben we ook aangetoond dat myofilament Ca2 ⁺ desensibilisatie bij hypertensieve ratten harten secundair aan de up-regulatie van neuronale stikstofoxidesynthase is geassocieerd met verhoogde diastolische en systolische Ca2 ⁺ niveaus^11, die op zijn beurt, verhoogt de kwetsbaarheid van de LTCC om Ca2 ⁺ -afhankelijke ¹² inactivering. Daarom myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid is een "actieve" regelaar van intracellulair Ca2 ⁺ homeostase en myocyt contractiele functie. Het is noodzakelijk geworden om interacties tussen myofilament en Ca ²⁺ analyseren de behandeling van eiwitten voor grondig onderzoek van myocyten EG koppeling en hartfunctie.

We beschrijven een protocol dat de veranderingen van myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid geïsoleerde cardiomyocyten beoordeelt. Uitgebreide analyse van de intracellulaire Ca ²⁺ profiel, zal myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid en krimp nieuwe mechanismen ontgraven onderliggende myocard mechanica.

Protocol

Het protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health van de VN (NIH publicatie nr 85-23, herzien 1996). Het werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Seoul National University (IACUC goedkeuring nr .: SNU-101213-1).

1. Buffer Voorbereiding (tabel materialen en apparatuur)

1. Bereid 300 ml verse isolatieoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; _MgCl2, 3,5; glucose, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4, taurine, 20; pH 7,4 met NaOH).
2. Bereid 100 ml vers opslagoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl 120, KCl 5,4; _MgSO4 5, _CaCl2 0,2, natrium- pyruvaat 5, glucose 5,5, taurine 20, HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 met NaOH).
3. Bereid 1 liter perfusie-oplossing (in mM: NaCl, 141,4, KCl, 4; NaH _{2PO 4,} 0,33; MGCl _2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; _CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 met NaOH).
4. Bereid 30 ml collagenase oplossing 1 door toevoeging van collagenase (1 mg / ml), protease (0,1 mg / ml), runderserumalbumine (BSA, 1.67mg / ml) en Ca2 ⁺ (0,05 mM) tot 25 ml isolatie oplossing.
5. Bereid 20 ml collagenase oplossing 2 door toevoeging van collagenase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) en Ca2 ⁺ (0,05 mM) 16,7 ml isolatieoplossing.
6. Bereid 40 ml van BSA door toevoeging 0,4 g BSA aan 40 ml isolatieoplossing. Aparte 10 ml en 30 ml in twee bekers. Voeg Ca2 ⁺ aan 30 ml BSA oplossing zodat de uiteindelijke Ca2 ⁺ -concentratie in de BSA oplossing 1 mM.

2. Voorbereiding van de Isolatie van de linker ventriculaire (LV) Myocytes

1. Transfer 8-12 weken oude, mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten in schoon vervoer kooien van de dieren mogelijkheid om de voorbereiding en de isolatiekamer.
2. Heet twee waterbaden tot 37 ^o C.
   Opmerking: Gebruik een waterbad voor het water - een mantel reservoir en de perfusie buizen van de Langendorff perfusie-systeem. Gebruik de andere waterbad hartspierweefsel trunks schudden om het ene myocyten te scheiden.
3. Voeg 5 ml en 3,3 ml van de BSA-oplossing (zonder Ca ²⁺⁾ tot 25 ml collagenase oplossing 1 en 16,7 ml collagenase oplossing 2 om het volume op 30 ml en 20 ml.
4. Voeg isolatieoplossing (100 ml) en collagenase oplossing 1 (30 ml) naar kolom 1 (Kol 1) en 2 kolom (Kol 2) in het Langendorff perfusie systeem, respectievelijk (Figuur 1A).
5. Zuurstof de isolatie-oplossing en collagenase oplossing 1 in Col. 1 en Col.2 via de zuurstof verbindingsbuis in het Langendorff perfusie-systeem (Figuur 1A). Evenzo oxygenaat collagenase oplossing 2 en de BSA oplossing in de schudwaterbad met 100% O ₂ via dezuurstof verbindingsbuis.

3. Isolatie van LV myocyten

1. Verdoven een SD rat via intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (30 mg / kg) en bevestig de narcose status via teen knijpen en het ontbreken van terugtrekking reflectie.
2. Verplaats de rat naar een dissectie lade. In rugligging, zet de vier poten aan de zijden van het lichaam met tape.
3. Solliciteer thoracale mid-axiale insnijdingen met chirurgische schaar om de kist te openen, zodat het hart niet te beschadigen. Met een paar schone schaar om het hart ontleden van de verbindende vaten (bv superior en inferior vena cava, longvaten en aorta) en pericardiale membraan ^13.
4. Laat een deel van de aorta van een voldoende lengte (5-8 mm), klem de aorta met fijne pincet en de canule van het Langendorff perfusie systeem snel te monteren binnen 1 min (Figuur 1A). Bind hechtdraad 4/0 strak over de aorta.
5. Zet de klep aan Col. 1 en perfuseren het geïsoleerde hart met voorverwarmd en geoxygeneerde isolatieoplossing voor 10 min (perfusiesnelheid: 12-14 ml / min). Schakel de klep aan Col. 1, zet de kraan op Col. 2 en perfuseren het hart met collagenase oplossing 1 voor 8-10 min.
6. Demonteer de verteerde hart door het snijden van de aorta en over te dragen door het vasthouden van de aorta met een tang in de kolf met vers isolatie-oplossing (figuur 1Bi). Gebruik fijne schaar en forceps meeste van de LV vrije wand (inclusief het septum) in kleinere stukjes (~ 22 mm, figuur 1Bii).
7. Breng de stukken in een kolf die voorverwarmd en zuurstofrijk vers collagenase oplossing 2 (figuur 1Biii). Schud gedurende 10 minuten. Blijven leveren zuurstof aan de myocyten bevattende collagenase oplossing 2.
8. Verplaats de myocyten - vering met een 10 ml centrifugebuis met behulp van druppelaars met een zuigingsbol en voeg Ca ²⁺ - bevattende BSA-oplossing (1: 1 in volume). Centrifugeer bij 30 g gedurende 2 minuten en gooi de supernatant. Re-schorten de myocyt pellet in 5 ml van de BSA-oplossing. Centrifuge en gooi de supernatant.
9. Verspreiden de myocyten pellets en houden myocyten in 10 ml pre-geoxygeneerde opslagoplossing bij kamertemperatuur (Figuur 1Biv-vi).
10. Herhaal de procedures (stappen 3,7-3,9) met de resterende LV weefsel in de kolf.
    Opmerking: Houd herhalen procedures (stappen 3,7-3,9) totdat het meeste LV weefsel verdwijnt om een ​​goede opbrengst van myocyten te verkrijgen.
11. Houd de myocyten in opslagoplossing voor 6-8 uur bij KT tot eind experimenten.

4. gelijktijdige metingen van intracellulaire Ca ^{2 +} transiënten en Myocyte Contractie

1. Load LV myocyten met acetoxymethyl ester Fura-02:00 (2 uM).
   Opmerking: Voer alle laad- procedures en experimenten met geladen myocyten in een donkere buis (figuur 1Bvii).
   1. centrifuge de myocyten suspensie (1 ml) bij 2000 xg gedurende 10 sec. Verwijder het supernatant en resuspendeer de myocyt pellet in 1 ml Tyrode oplossing met een lage Ca ²⁺ concentratie (250 uM, Tafel materialen en apparatuur).
   2. Add Fura-02:00 en poloxameer 407 (2 pl) voorzichtig dispergeren myocyten suspensie en het mengsel bij kamertemperatuur houden (20-24 ^° C) gedurende 15 min (Fig 1Bvii).
   3. Centrifugeer het mengsel gedurende 5 sec Verwijder de bovenstaande vloeistof en de verspreiding van de myocyt pellet in 1 ml perfusie oplossing die 500 uM Ca2 ^+. Na 10 min centrifugeren van het mengsel gedurende 5 sec Verwijder de bovenstaande vloeistof.
   4. Voeg frisse perfusievloeistof (500 uM Ca2 ^+, 1 ml) en houd de Fura-02:00 - loaded myocyte pellet in deze oplossing voor opnames.
2. Meting van myocyten LV contractie en intracellulair Ca2 ⁺
   1. Voordat u gaat opnemen, vul de perfusie buis die door middel van een looptwater jas met de Tyrode oplossing, die is voorverwarmd tot 36 ^o C.
   2. Plaats een paar druppels van de Fura 02:00 - geladen LV myocyten schorsing, op de kamer van een omgekeerde fluorescentie microscoop voor 5-8 min. perfuseren langzaam de Tyrode-oplossing (2,2 ml / min).
   3. Druk op de knop "start" op het frontpaneel van de digitale stimulator om het veld stimulatie (2 Hz) te starten.
      Opmerking: De uitgangsspanning (10 V, 5 msec) wordt toegepast op de myocyten in de kamer via platinadraden aan weerszijden van de kamer.
      1. Selecteer myocyten dat contract stabiel (niet die het weergeven van hyper- of hypo-contractie) voor de opname.
   4. Stel de myocyte keuze in de horizontale stand van de videogebaseerd sarcomeer detectiesysteem en de focus van de microscoop te passen om optimale beelden te verkrijgen sarcomeren. Plaats de paarse rechthoekige doos op het gebied waarin duidelijke sarcomeres duidelijk worden waargenomen tot het gemiddeldevan sarcomeer lengtes (rood piek) toont een enkelvoudige scherpe piek (Figuur 2A, lager afbeelding).
   5. Noteer de veranderingen van sarcomeerlengte reactie op veldstimulatie (figuur 2A en B).
      Opmerking: Gebruik de geladen myocyten binnen 1 - 2 uur.
   6. Stel het diafragma van de camera, zodat het veld in de videogebaseerd sarcomeer detectiesysteem is de grootte van de myocyten (Figuur 2A). Stimuleren van de myocyten met excitatie bij 360 nm / 380 nm en emissie bij 510 nm (overname frequentie 1000 Hz). Neem sarcomeer verkorten en de fura2 AM verhouding met veldstimulatie (figuur 2B).

5. Beoordeling van Myofilament Ca ²⁺ Gevoeligheid

1. Middel de sarcomeer lengte en Ca2 ⁺ transiënten in steady state (10 - 20 sporen) en stel de fase-vlak lus van de Fura-2 verhouding vs. sarcomeerlengte dezelfde myocyten (beide met meetwaardes en delta veranderingen; figuur 2C).
2. In elk perceel, definiëren Fura -2-ratio op 50% ontspanning (EC _50, figuur 2C). Vergelijk zowel de lus en EC ₅₀ van elke interventie.

Resultaten

LV myocyten zijn geïsoleerd van normale en hypertensieve rat harten. Staafvormige myocyten met duidelijke strepen (die sarcomeren) en stabiele samentrekt ingevolge veldstimulatie worden beschouwd als de optimale myocyten zijn en zijn gekozen voor opname (Figuur 2A). In de in F igure 2A bijvoorbeeld een Fura 02:00-geladen LV myocyten is horizontaal geplaatst en het diafragma van de camera wordt ingesteld dat de myocyten neemt het grootste deel van het vel...

Discussie

Hier beschrijven we de protocollen om veranderingen van myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid in enkele geïsoleerde hartspiercel beoordelen en benadrukken het belang van het meten van deze parameter naast elektrofysiologische eigenschappen, intracellulaire Ca ²⁺ transiënten en myofilament dynamiek. Dit komt omdat de opname van een of twee van de parameters niet de onderliggende mechanismen cardiale contractie en ontspanning kan expliciteren. In tegenstelling tot conventionele werkwijzen die myocyten contr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weken
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Verzekeringscode:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Software Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisitie en analyse van EC koppelingsgegevens in Myocyten
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitati Lichtbron	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Research
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corporation	S-98 Multimode
Samenstelling van experimentele oplossingen
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentratie (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentratie (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentratie (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentratie (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentratie (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentratie (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentratie (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentratie (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentratie (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentratie (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentratie (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentratie (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentratie (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentratie (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentratie (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentratie (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentratie (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentratie (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentratie (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentratie (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentratie (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentratie (mmol) 1.8      Voor Fura 2AM loading, CaCl2 concentraties zijn 0.25 mM en 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentratie (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentratie (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA oplossing 5 ml)			Concentratie (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentratie (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentratie (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentratie (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)