Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications

Samenvatting

Het ontwerpen en ontwikkelen van een aptameer-gouden nanodeeltjes colorimetrische assay voor de detectie van kleine moleculen in-het-veld toepassingen onderzocht. Bovendien, een smart-inrichting colorimetrische applicatie (app) werd gevalideerd en langdurige opslag van de test werd voor gebruik in het veld.

Samenvatting

Het ontwerp en de ontwikkeling van een aptameer-gouden nanodeeltjes (AuNP) colorimetrische test voor de detectie van kleine moleculen voor in-het-veld toepassingen onderzocht. Target selectieve AuNP gebaseerd kleur testen zijn ontwikkeld in gecontroleerde laboratorium instellingen proof-of-concept. Echter, deze regelingen niet zijn uitgeoefend om een ​​point of failure om hun praktisch gebruik buiten het laboratorium instellingen bepalen. Dit werk beschrijft een generieke aanpak voor het ontwerpen, ontwikkelen, en het oplossen van een aptameer-AuNP colorimetrische assay voor kleine moleculen te analyseren stoffen en het gebruik van de test voor in-het-veld instellingen. De test is voordelig omdat geadsorbeerd aptameren passiveren de nanodeeltjes oppervlakken en een middel te verminderen en te elimineren vals positieve reacties op niet-doelanalyten. Overstappen dit systeem om praktische toepassingen vereist het definiëren van niet alleen de houdbaarheid van de aptameer-AuNP assay, maar vaststelling van methoden en procedures voor de uitbreiding van de opslag op lange termijn capabilteiten. Ook een van de erkende problemen met colorimetrische uitlezing is de belasting van analisten vaak subtiele veranderingen in kleur nauwkeurig te identificeren. De verantwoordelijkheid analisten in het veld te verminderen, werd een kleuranalyse protocol ontworpen om de kleuridentificatie taak zonder de noodzaak van het uitvoeren van deze taak laboratoriumkwaliteit apparatuur. De werkwijze voor het maken en testen van de gegevensanalyse protocol wordt beschreven. Echter begrijpen of de opzet van geadsorbeerde aptameer assays, de interacties geassocieerd met de aptameer, doel en AuNPs verder bestudeerd. De opgedane kennis kan leiden tot op maat aptameren voor een verbeterde functionaliteit.

Inleiding

Colorimetrie is een van de oudste technieken van analytische chemie. Voor deze techniek wordt een kwalitatieve of kwantitatieve bepaling van de analyt gemaakt op basis van de productie van een gekleurde verbinding ^1. Gewoonlijk kleur assays reagentia die een kleurverschuiving in aanwezigheid van het analyt species, waardoor een waarneembare of waarneembare kleurverandering in het zichtbare lichtspectrum ervaren. Colorimetrie is gebruikt bij de detectie van targets variërend van atomen, ionen en kleine moleculen tot complexe biologische moleculen zoals deoxyribonucleïnezuren (DNA), peptiden en eiwitten ^2-4. In de afgelopen twee decennia nanomaterialen de detectiehoek assays revolutie, met name kleur gebaseerde testen ^5-6. Het combineren van de unieke chemische en fysische eigenschappen van nanomaterialen met een element doelwit selectieve herkenning, zoals antilichamen, aptameren oligonucleotide of peptide aptameren, heeft geleid tot de opleving in het ontwerpen en ontwikkelen van colorimetrische detectie assays ^7.

Metaal nanodeeltjes een grootte aangetoond afhankelijke kleurverandering eigenschap, die benut is bij het ontwerpen van talrijke colorimetrische assays. Gouden nanodeeltjes (AuNPs) zijn van bijzonder belang als gevolg van een distinctief rood naar blauw kleurverschuiving, wanneer de gedispergeerde oplossing deeltjes geïnduceerd om te aggregeren ^8, kenmerkend door nauwkeurige toevoeging van zout. De mogelijkheid om de overgang van de verspreide (rood) controleren om de geaggregeerde (blauw) staten heeft geleid tot de oprichting van colorimetrische sensoren voor ionische, kleine moleculaire, peptide, eiwit en cellulaire doelwitten ^2-4,9. Veel van deze sensoren gebruiken aptameren als motief beeldherkenning.

Aptameren zijn DNA of ribonucleïnezuur (RNA) moleculen gekozen uit een willekeurige verzameling van 10 ¹² -10 ¹⁵ verschillende sequenties ^10-11. Het selectieproces identificeert doel recognitie elementen bindingsaffiniteiten in het lage nanomolaire regime, en de systematische ontwikkeling van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) is de meest bekende werkwijze ^12-13. Voordelen van de oligonucleotide gebaseerd aptameren voor sensing toepassingen zijn onder meer het gemak van de synthese, controleerbare chemische modificatie, en chemische stabiliteit ^14-15.

Een benadering voor het creëren van een colorimetrische assay combineert met nanomaterialen herkenningselementen, bestaat uit deze twee soorten combineren door fysische adsorptie van DNA-moleculen aan aptameer AuNP oppervlakken. Door target-bindende aptameer, de aptameer ervaart een structurele verandering ^16-18 dat de interactie van de aptameer met de AuNP oppervlak, wat leidt tot een induceerbare rood naar blauw kleurrespons ¹⁹ met de toevoeging van zout verandert. Deze verbazingwekkende eigenschap van AuNPs biedt een waarneembare colorimetrische reactiemechanisme voor aptameergebaseerde apparaten die kunnen worden gebruikt om even teteken colorimetrische assays voor verschillende analyten.

Kleur assays ontworpen met behulp van niet-covalente, fysisch geadsorbeerd DNA aptameren op AuNP oppervlakken hebben het stigma van een zwakke sensor platform te wijten aan problemen met robuustheid, een neiging voor het niet buiten de gecontroleerde laboratorium instellingen, en het gebrek aan informatie beschikbaar voor gebruik in de praktijk instellingen. Echter, de aptameer-AuNP gebaseerde colorimetrische bepaling was in de belangstelling vanwege de eenvoud van bediening en waarneembare kleur reactie. Het doel van dit werk is om een ​​protocol voor het ontwerp, de ontwikkeling, de exploitatie, de vermindering van de oppervlakte gerelateerde vals positieve reactie, en langdurige opslag van DNA-AuNP gebaseerde colorimetrische assays het gebruik van cocaïne als de vertegenwoordiger te analyseren. Verder stelden we deze geadsorbeerde aptameer assay benadering (figuur 1) als voordelig vanwege eenvoud en gebruiksgemak die resulteerde in minder stappen dan de conventionele benadering voor deze aptameer-AuNP assegen. Voor deze test werd de aptameer eerst toegevoegd aan de AuNPs, die mochten adsorberen aan het oppervlak voor langere tijd. Een bijkomend voordeel van deze aanpak is de verlaging van de respons op niet-doelanalyt moleculen soortgelijk aan AuNP oppervlakte interacties. De vermindering van vals positieve reactie ten koste van assaygevoeligheid. Dus een evenwicht tussen oppervlaktebescherming en analyt toegankelijkheid moet goede test blijft werken. Bovendien is een belangrijk gebrek analyseren kleur assays met andere middelen dan met instrumentatie die de resultaten vaak subjectief en voor interpretatie van analist tot analist, vooral wanneer het proberen om subtiele verschillen in kleur onderscheiden. Omgekeerd zijn er een aantal problemen met het maken van laboratorium op basis van instrumentatie bruikbaar buiten het laboratorium, zoals de beschikbaarheid van de macht, zakelijkheid met draagbaarheid, enz. In dit werk werd een kleuranalyse protocol ontwikkeld voor more draagbaarheid en om een deel van het giswerk vaak geassocieerd met kleur gebaseerde test interpretatie ^20-21 te elimineren. In vergelijking met eerdere benaderingen die inspanning naar gestreefd om deze assays bewegen hun grenzen voor toepassingen buiten het laboratorium instellingen.

Protocol

1. Synthese via Citrate Vermindering van Gold nanodeeltjes (AuNP) en karakterisering

1. Reinig een erlenmeyer (500 ml) en grote roerstaaf met 5 ml geconcentreerd salpeterzuur en 15 ml geconcentreerd zoutzuur in chemische beschermkap.
   1. Bevochtig het gehele oppervlak van de kolf met het zuur wassen, spoel de kolf met nuclease gratis water, en laat de kolf te drogen.
2. Voeg 100 ml van 1 mM goud (III) chloride; Gebruik een vel aluminiumfolie om de top van het zuur gereinigde Erlenmeyer kolf nog onder voortdurend roeren betrekking op een hete plaat tot koken.
3. Voeg 10 ml 38,8 mM natriumcitraat. De kleur verandert van helder / grijs, donkerblauw / zwart, en tenslotte donker rood over enkele minuten. Blijf roeren met de hitte af voor 10 min.
4. Laat de AuNP suspensie afkoelen tot kamertemperatuur en voeg 110 pl diethylpyrocarbonaat (DEPC) onder voortdurend roeren.
5. Bedek de hele fles metaluminiumfolie en laat de DEPC behandeling 's nachts broeden. Bewaar alle AuNPs in het donker, in amber opslagcontainers of bedekt met aluminiumfolie.
6. Autoclaaf de AuNP schorsing, afkoelen tot kamertemperatuur, en filteren door middel van een 0,22 pm porie celluloseacetaat membraan. Bewaar de gefiltreerde, geautoclaveerde AuNP voorraadoplossing in het donker bij 4 ° C.
   OPMERKING: Behandeling met DEPC, sterilisatie via autoclaaf en opslag bij 4 ° C wordt de houdbaarheid van de aptameer-AuNP assay verbeteren. Opslag op deze manier zal de test functioneel blijven langer dan 2 maanden.
7. Bereken de AuNP concentratie door het verkrijgen van Ultra Violet-Visible absorptie bij 520 nm, en het gebruik van de extinctiecoëfficiënt (Ɛ) 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^-1 met de wet van Beer door het berekenen van de concentratie (c). De concentratie werd bepaald 10 nM met een grootte van 15 nm bepaald met dynamische lichtverstrooiing zijn.
   LET OP: De concentraties zullen variëren frOM batch-to-batch. Verdun de AuNP aandelen met nuclease gratis water als nodig is om het gewenste 10 nM AuNP suspensie te houden.

2. DNA-aptameer, Buffer, Solution, en Assay Voorbereiding

1. Aanschaffen of synthetiseren de volgende cocaïne bindende aptameer sequenties met behulp van standaard fosforamidiet chemie ^22:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Zuiver het aptameren met standaard ontzouting ^23. Reconstitueer oligonucleotiden in nuclease-vrij water op ofwel 100 pm of 1 mM voorraad oplossingen. Aliquot en bewaar bij -20 ° C gedurende enkele maanden.
3. Aankoop of bereiden voorraden steriele 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) pH 7,4, 100 mM magnesiumchloride _(MgCl2) en 1 M natriumchloride (NaCl).
4. Bereid 50 ml van buffer in nuclease-vrij water with concentraties van 20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH 7,4 en bewaar bij kamertemperatuur gedurende maanden.
5. Incubeer het DNA met de voorraad AuNP oplossing (10 nM) gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht. Variëren van het volume van AuNPs wens om genoeg monster voor de uit te voeren testen (2,5-7,5 ml).
   1. Hier, gebruik beladingsdichtheid van 90, 120, 150, en 180 DNA-moleculen / AuNP in dit werk. Variëren van het volume en de concentraties van DNA dienovereenkomstig. Stem de DNA dekking onbedoelde AuNP oppervlakte gerelateerde kleur reacties van non-target analyten te verminderen.
      OPMERKING: verhogen van het DNA dekking zal de assay gevoeligheid verminderen. De beladingsdichtheid worden berekend uit kennis van de concentratie van de AuNP voorraad en berekening van het totale aantal AuNPs in de gewenste voor gebruik in experimenten volume. Als de werkelijke dekking dichtheden gewenst, protocollen bestaan ​​deze waarden ⁷ te verkrijgen. De dekking DNA werd bepaald onder toepassing van een 50 kDa molecular gewicht cutoff spin-kolom aan de AuNP gebonden DNA te scheiden van de vrije DNA. De AuNPs zijn te groot om door de spin kolom te passeren, terwijl de vrije DNA gemakkelijk zal passeren. De volgende stap is het vrije DNA verzameld met absorptiemetingen of enkelstrengs DNA fluorescerende kleurstof kwantificeren.
6. Voeg een gelijk volume van 20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH 7,4 buffer en plaats het monster bij 4 ° C in het donker overnacht. Het aptameer-AuNP assay was in een 10 mM HEPES, 1 mM _MgCl2, pH 7,4 (bepalingsbuffer).

3. Zout Titratie en Assay Setup

1. Bepaal de initiële zoutconcentratie die nodig is om de test kleur reactie van zout titratie met de assayblanco induceren. Voeg 20 pl methanol (blanco) voor 180 gl aliquots van aptameer-AuNP assay in een 96-wells plaat. Titreer de monsters met toenemende volumes voorraad NaCl-oplossing (1 M of 2 M) en bepaal de gelijkwaardigheid punt (figuur 2 ).
   OPMERKING: De test kan worden geschaald tot kleinere volumes door het houden van de verhouding van methanol plano (of opgelost analyt) voor aptameer-AuNP assay hetzelfde.
   1. Hier, bepalen de NaCl volume nodig is om de geringste kleurverandering door visuele waarneming veroorzaken. De beginconcentratie van het assay was 75 mM en 130 mM voor MN4 en MN6, respectievelijk een 60 DNA-molecuul / AuNP dekking dichtheid.
      OPMERKING: Voor een kwantitatieve bepaling van de initiële zoutconcentratie, het middelpunt van de titratie curve vormt een goed uitgangspunt. Ook zal gebruikte concentraties variëren, afhankelijk van het aptameer DNA dekking dichtheden van dag tot dag prestaties en batch-to-batch.
2. Het optimaliseren van het assay reactie, voeg 20 gl analysemonstermoleculen verdund in methanol om 180 gl aliquots van aptameer-AuNP assay in een 96-puts plaat bij kamertemperatuur. voeg geeft de NaCl-concentratie in het voorgaande stap om de analyse kleurrespons initiëren.
   NEETE: Maak gebruik van een multichannel pipet om meerdere experimenten tegelijk uit te voeren.
3. Het verkrijgen van de grootste kleurverandering mogelijk door het verhogen of verlagen van de NaCl concentratie en het vergelijken van de beoogde reactie op de blanco reactie. Gebruik de NaCl concentratie die de grootste respons verschil biedt.
4. Let op of het meten van de test respons 150 sec na NaCl toevoeging. Analyseer de absorptie bij 650 nm en 530 nm met een spectrometer of een digitale camera foto van de assay respons (zie hoofdstuk 4 van de foto analyseprotocol) te verkrijgen.
   OPMERKING: een microplaat reader werd gebruikt bij het verkrijgen van de metingen voor dit werk.
5. Zet de resultaten als de verhouding van de absorptie verkregen bij 650 nm en 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ als functie van de analytconcentratie. Normaliseren van de assay reactie op het blanco signaal zoals bij dit werk.

4. Foto en Digital Image Color Analysis Protocol Analyse

1. prepare de test monsters zoals beschreven (delen 3,2-3,3). Plaats de 96-well plaat op een transilluminator.
   OPMERKING: Een standaard laboratorium transilluminator is meestal te licht om bruikbare digitale beelden voor deze analyse te verkrijgen. Deze transilluminators veroorzaken regelmatige afstand "donkere lijnen" weergegeven in het digitale beeld door de intensiteit van de lichtbron. Het maken van een transilluminator van een licht-emitterende diode (LED) op basis van lichte doos en een stuk van ondoorzichtige plastic werkt goed.
2. Verkrijgen's van de 96-well plaat bij 150 sec na NaCl Bovendien importeert de afbeeldingen in beeldanalysesoftware en bereken het gemiddelde rode, groene en blauwe (RGB) waarden middels een incrementele gemiddelde techniek, zoals weergegeven in formule 1 ^24:
   (1)
3. Converteren de RGB-waarden van standaard RGB (sRGB) kleurruimte aan de kleursoort diagram (CIExyY) kleurruimte, met behulp van de volgende vergelijkingen ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Zetten de exponentiële RGB waarden lineaire RGB-waarden met vergelijking 2. De matrix aangegeven in formule 3 wordt gebruikt om de X-, Y- en Z-waarden van de CIE kleurruimte ²⁴ berekenen.
5. Bereken de x- en y kleurkwaliteit waarden met formule 4 die de gemiddelde kleur van de pixels in het gebied geselecteerd voor analyse ^24.
6. Voer de analyse in elke put en plot de chromaticiteitswaarden een ijkgrafiek (Figuur 4) te genereren. Haal de standaardfout door analyse van de kleur van de verschillende gebieden van dezelfde put.

5. Invriezen Aptamer-AuNP Test voor langdurige opslag

1. Bereid de aptameer-AuNP assay componenten zoals beschreven in de paragrafen 2.4 en 2.5. Voeg afzonderlijke oplossingen die 1 g / ml trehalose en 1 g / ml sucrose in nuclease-vrij water aan de cryogene oplossing.
   OPMERKING: Hoge concentraties van trehalose en sucrose werden gebruikt om de verdunningsfactor verminderen bij de voorbereiding van de test voor bevriezing. Verwarm de suikeroplossingen op een hete plaat in een beker water om de suikers zorgvuldig te lossen voor gebruik.
2. Voeg een oplossing die 19,2 mg / ml trehalose en 4,8 mg / ml sucrose met 60 MN4-DNA / AuNP assay in een eindvolume van 200 ul in 1,5 ml microcentrifugebuizen bevat. Uiteindelijke cryogene oplossingsconcentraties varieert met DNA dekking.
   Opmerking: De monsters worden bevroren mag niet meer dan 300 pl. Grotere volumes mogelijk niet goed bevriezen.
3. Flash bevriezen de monsters met een -146 ° C vriezer of in vloeibare stikstof. Bewaar de ingevroren tot gebruik samples. Opslag kan in een -80 ° C of -20 ° C eenmaal Snelkoeling voltooid.
4. Voor dit werk, laat de monsters in de -146 ° C vriezer bovennacht en vervolgens overbrengen naar een -20 ° C vriezer voor langdurige opslag.
   OPMERKING: Flash bevriezing kan het aptameer-AuNPs te aggregeren. Test de integriteit van het vriesproces het volgen van de absorptieprofiel en te vergelijken met een bevroren monster. Als aggregatie wordt waargenomen, vergroot de hoeveelheid cryogeen ter compensatie voor dit probleem.
5. Ontdooi de monsters bij kamertemperatuur en alleen genoeg monsters nodig voor experimenten. Het verkrijgen van de absorptie spectra van ontdooide monsters en te vergelijken met de basislijn spectra van een bevroren cryogeen oplossing behandelde monster. Meet de absorptie van 400 nm tot 700 nm.
6. Voer het zout titratie (paragraaf 3.1), het testen van de assay (paragraaf 3.2), en de plot van de resultaten (paragrafen 3.3 en 3.4), zoals eerder beschreven.

Resultaten

Het primaire doel van dit werk was het ontwikkelen en onderzoeken van de stabiliteit en robuustheid van aptameergebaseerde AuNP colorimetrische assays voor gebruik in het veld. Zoals in een voorgaande publicatie werden twee verschillende strategieën voor het creëren van de test onderzocht ^7. De testen werden genoemd het vrije aptameer Assay en de geabsorbeerde aptameer Assay. De geadsorbeerde Aptameer assay was meer aantrekkelijk met het oog op een fieldable detectietest...

Discussie

In het afgelopen decennium, hebben nanodeeltjes gebaseerde colorimetrische assays ontwikkeld voor de detectie van doelen omvatten kleine moleculen, DNA, eiwitten en cellen ^2-4. Testen die DNA-aptameren te gebruiken met nanodeeltjes hebben gewonnen belang. Meestal worden deze colorimetrische assays uitgevoerd door het mengen van de DNA-aptameer met analysemonstermoleculen gevolgd door toevoeging aan AuNPs ^9-10. Echter, deze tests zijn gebruikt in proof-of-concept demonstraties met een gecontroleerde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% zuiverheid is belangrijk en oplossingen werden elke keer vers gemaakt
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	We hebben gevonden dat de fabrikant AuNP-assays sterk beïnvloedt, en oplossingen werden elke keer vers gemaakt
Synergy	Bio-TEK	HT	Elke absorptiometer werkt, maar een platereader biedt analyse van meerdere monsters
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M gesteriliseerd	Amresco	J848	Elk gesteriliseerd merk werkt
Corning, 250 ml Filtersysteem, 0.22 µm celluloseacetaat	Fisher	430767	Andere membranen zijn gevonden die de AuNP's verwijderen
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Elke absorptiometer werkt
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	>98% elk merk werkt
DNA	IDT	Custom	DNA werd gezuiverd met een ontzoutingskolom, hogere zuiveringstechnieken kunnen worden gebruikt
Procaine Hydrochloride	ACROS	AC20731-1000	99% voorraden van 1 mg/ml in methanol werden bereid
Hydrochloric Acid	Fisher	A144S-500	36,5-38,0% w/w andere merken werken
Cocaine Hydrochloride	Lipomed	COC-156-HC-1LM	We hebben gevonden dat de fabrikant AuNP-assays sterk beïnvloedt
Nitric Acid	Fisher	A509-SK212	65% w/w andere merken werken
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade	Sigma	S5150-1L	Steriele oplossingen gemaakt uit vaste stof werken
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758-25 mL	>97% elk merk werkt
Ecgoninemethylester Hydrochloride	Lipomed	COC-205-HC-1LM	We hebben de EME-controle verkregen van dezelfde fabrikant als de cocaïne-doel
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, niet-steriel, 1,7 ml	VWR	10011-722	We hebben gevonden dat de fabrikant AuNP-assays sterk beïnvloedt, en de buisjes werden in huis geautoclaveerd
nuclease vrij water
methanol