Een muismodel van retinale ischemie-reperfusie letsel door misbruik van intra-oculaire druk

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het induceren van retinale ischemie-reperfusieschade door verhoogde intraoculaire druk bij muizen. Retinale ischemie-reperfusieschade door verhoogde intraoculaire druk dient om menselijke pathologieën gekenmerkt door gecompromitteerd zuurstof en van voedingsstoffen in het netvlies model, waardoor onderzoekers potentiële cellulaire mechanismen en therapieën voor menselijke ziekten van het netvlies neurovasculaire eenheid onderzocht.

Samenvatting

Retinale ischemie-reperfusie (I / R) een pathofysiologische proces bijdraagt ​​tot celbeschadiging in meerdere oogaandoeningen, zoals glaucoom, diabetische retinopathie en retinale vasculaire occlusies. Knaagdiermodellen van I / R schade bieden belangrijke inzichten in de mechanismen en behandelingsstrategieën voor menselijke I / R schade, vooral met betrekking tot neurodegeneratieve schade in de retina neurovasculaire unit. Hier gepresenteerd is een protocol voor het induceren van het netvlies I / R schade bij muizen door middel van verhoging van de intra-oculaire druk (IOP). In dit protocol wordt de oculaire voorste kamer van een canule met een naald, waardoor het infuus van een verhoogde zoutoplossing reservoir stroomt. Met behulp van deze drip om IOP te verhogen tot boven de systolische arteriële bloeddruk, een beoefenaar tijdelijk stopt innerlijke netvlies bloedstroom (ischemie). Wanneer verkeer wordt hersteld (reperfusie) door verwijdering van de canule, ernstige celbeschadiging optreedt, resulteert uiteindelijk in het netvlies neurodegeneratie. recente studies tonen ontsteking, vasculaire permeabiliteit en capillaire degeneratie als bijkomende elementen van dit model. Vergeleken met andere retinale I / R methodologieën, zoals retinale arteriële ligatie, retinale I / R schade door verhoogde IOP biedt voordelen in de anatomische specificiteit, experimentele traceerbaarheid en technische toegankelijkheid, presenteert zich als een waardevol instrument voor de behandeling van neuronale pathogenese en therapie de retinale neurovasculaire unit.

Inleiding

Retinale ischemie-reperfusie (I / R) karakteriseert veel menselijke retinale pathologieën, waaronder glaucoom, diabetische retinopathie en retinale vasculaire occlusies ^1. Retinadegeneratie I / R verminderde bloedstroom (ischemie) in de retinale vasculatuur creëert een toestand van overgevoeligheid voor retinale zuurstof en andere voedingsstoffen, precipiteren ernstige oxidatieve en inflammatoire schade bij verkeer vervolgens wordt hersteld (reperfusie) ^2. Het neurale netvlies wordt bijzonder kwetsbaar voor deze ontwikkelingen en retinale neurodegeneratie wordt misschien het meest opvallende kenmerk van I / R-geïnduceerde schade. Hier gepresenteerd is een protocol voor het modelleren van het netvlies I / R schade in de muis. Deze techniek kunnen onderzoekers mogelijke mechanismen en behandelingsstrategieën voor menselijke ziekten van het netvlies neurovasculaire eenheid onderzocht.

Pionierde in 1952 door chirurgen proberen de neurodegeneratieve gevolgen van chirurgische bloedarmoede ³ begrijpen, rodent retinale I / R van verhoogde intraoculaire druk (IOP) werd hersteld in 1991 met het oog op standaardisatie neurodegeneratieve eindpunten na ischemisch insult ^4. Met behulp van het infuus van een zoutoplossing reservoir aan IOP boven systolische bloeddruk verhogen, deze studies toonden aan dat onder druk oculaire infusen was voldoende om de retinale circulatie op te schorten en daardoor initiëren neuronale degeneratie. Meer recente inspanningen via retinal I / R door verhoogde IOP begonnen om de onderliggende mechanismen I / R-geïnduceerde retinale neurodegeneratie ^5-12 werken. Meerdere groepen hebben bijkomende pathologische veranderingen waaronder ontsteking ^{13,14, 15,16} vasculaire permeabiliteit en capillaire degeneratie ^14,17 gerapporteerd. Tezamen hebben deze studies retina I / R schade door verhoogde IOP algemeen gevestigd als een model voor retinale neurovasculaire ziekten.

Karakteriseren van de mechanismen van I / R schade essentieel is voor de studie van vascular ziekte. Retinale I / R schade door verhoogde IOP is één van vele hypoxie geïnduceerd letsel modellen, zoals I / R letsel bij long ^{18, 19} hart, hersenen ^{20, 21} lever, nieren ²² en ²³ darm. Deze modellen hebben het grootste belang in het bevorderen van ons begrip van vasculaire ziekte en de klinische remedies geweest. Door de uitbreiding van het onderzoek van I / R processen om oculaire weefsels, retinale I / R schade door verhoogde IOP helpt om een ​​meer volledig beeld van deze aandoeningen te schilderen.

Overeenkomstige nauw met klinische neurodegeneratieve omstandigheden retina, retinale I / R schade door verhoogde IOP presenteert een waardevol instrument voor onderzoekers geïnteresseerd in het verkennen ischemische pathogenese. De hierin beschreven protocol is gericht, handelbaar en toegankelijk. Het is goed aangevuld met eindpunten in neuronale degeneratie, zoals kwantificering van retinale neuronen, meting van retinadikte en elektrofysiologische ropnametechnieken van retinale neuron functie. Dit model heeft bewezen zijn nut in het bevorderen van neurovasculaire onderzoek, en het toont belofte in het verdienen status als een fundamentele protocol in de visuele geneeskunde onderzoek.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de Johns Hopkins University Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen.

Opmerking: Muizen gebruikt tijdens film zijn C57BL / 6 muizen uit Jackson, hoewel andere knaagdieren stammen of soorten ook kunnen worden gebruikt. Bij het gebruik van andere stammen of soorten, zich ervan bewust dat de verdoving doseringen en letsel tijdlijn kunnen variëren. Het is belangrijk om I / R meetomstandigheden om spanning, species en experimentele variaties tegemoet.

1. Bereid de Anesthesie Cocktail

1. Combineer 1,25 ml ketamine, xylazine 0,625 ml, 0,375 ml Acepromazine en 22,75 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing in een 50 ml centrifugebuis.
   OPMERKING: Voor de rest van het manuscript Deze oplossing wordt aangeduid als de cocktail.
2. Filtreer de cocktail in een nieuwe steriele 50 ml centrifugebuis met een 60 ml spuit en een 0,20 pm filter. Label en datum dat dit nieuwe tuworden.
3. Volledig wikkel de cocktail buis in aluminiumfolie om licht geïnduceerde afbraak van de verdoving te voorkomen.
   NB: De cocktail kan worden bewaard bij kamertemperatuur en hergebruikt tot de vervaldatum van zijn vroegste-aflopende ingrediënt.

2. Bereid de Anesthesie Booster

1. In een 50 ml centrifugebuis, combineren 4 ml Ketamine en 16 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing.
   NB: Deze oplossing zal voortaan als de booster worden aangeduid.
2. Filtreer de booster in een nieuwe steriele 50 ml centrifugebuis met een 60 ml spuit en een 0,20 pm filter. Label en datum dat dit nieuwe buis.
   NB: De booster kan worden bewaard bij kamertemperatuur en hergebruikt tot de vervaldatum van zijn vroegste-aflopende ingrediënt.

3. Bereid de chirurgische Suite

1. Stel de temperatuur tussen 18 ° C en 21 ° C.
2. Zet op de operatie tafel, en stel het oppervlak warmte af aan de highest temperatuur.
3. Bestrijken alle werkbladen met chirurgische onderleggers.
4. Schik een lege kooi of een andere container op de chirurgische tafel om op te warmen.
5. Schik een schaal en een oor tagger op het werkblad.

4. Bereid de Balanced Salt Solution met Heparine Sodium

1. Voeg 0,5 ml natriumheparine aan een 500 ml fles IV gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
2. Steek het scherpe einde van de primaire set prepierced Y-terrein slang in de fles van 0,1% heparine natrium.

5. Stel de IV Pole

1. Hang de fles van 0,1% heparine natrium uit de IV pole-extensie, en snap opent het luchtfilter dop op de primaire set prepierced Y-terrein buizen.
2. Verhoog de 0,1% heparinenatrium fles 163 cm (120 mm Hg). Meet de hoogte van het tafelblad naar de top van de natrium heparine infuus.
3. Verwijder eventuele luchtbellen in de IV buis door met de hand te vegen de primaire set prepierced Y-terrein buizen.

6. Stel de Sodium Heparine Drip

1. Sluit de primaire set prepierced Y-terrein slang aan op de vijf-klepverdeelstuk.
2. Sluit de 30-gauge ½ inch naalden aan de vijf-poort spruitstuk met behulp van Luer man op man pijpen Luer.
3. Steek elk van de 30-gauge ½ inch naalden in zijn eigen 10-inch segment van 30-gauge buizen.
4. Met behulp van hemostats, breek de naald tips van nieuwe 30-gauge ½ inch naalden en steek hun stompe uiteinden in de 30-meter slang. Steriliteit of desinfectie van de naald tips die nodig zijn voor Step 8.3 zijn.
5. Met tape, regelen de 30-gauge buizen met naalden zodanig dat de buizen aan de binnenzijde poorten boven op de buizen verbonden met de buitenste poorten. Deze regeling zal verstrengeling van buizen tijdens voorste oogkamer infusen te voorkomen.
6. Schakel de 0,1% heparinenatrium stroom naar de vijf klepverdeelstuk en elke individuele haven.
   1. Zorg ervoor dat de 0,1%heparine natrium wordt sterk stroomt voor elke poort. Als een haven zwak stroomt, vervangt de haven in of uit het met lucht uit een steriele spuit.
   2. Laat de 0,1% heparine natrium stroomt voor 2-3 minuten om luchtbellen uit de 30-gauge buizen en 5-klepspruitstuk verwijderen.
7. Schakel alle poorten op de 5-klepverdeelstuk.

7. Bereid de muizen voor Heelkunde

1. Breng de muizen op de chirurgische suite. Watervoorziening flessen voor elke kooi om dierlijke uitdroging te voorkomen tijdens de operatie.
2. Noteer het gewicht van elke muis.
3. Injecteer elke muis intraperitoneaal met 0,02 ml cocktail per gram lichaamsgewicht.
4. Label en het aantal van elke muis te nemen.
5. Plaats alle muizen in de lege container op de operatie tafel. Laat 5-10 min voor alle muizen te diepe verdoving te bereiken zoals bevestigd door de afwezigheid van het pedaal terugtrekking reactie op teen knijpen.
6. Voor elke muis, bestuurt een druppelTropicamide in elk oog voor pupilverwijding en korte termijn smering.
7. Voor elke muis, beheren één druppel proparacaïne in elk oog voor plaatselijke verdoving en korte termijn smering.
8. Regelen van de muizen in de orde van verdoving zodat de eerste muis verdoofd de eerste muis te worden canule.
9. Rekening met ongeveer 2 min voor de oogdruppels door te voeren.
10. Bereid recht 4-inch stukjes tape door strak te trekken op de band. Zet opzij een stuk tape voor elke muis.
    Opmerking: Het niet strak op de band te trekken zal leiden tot krullen van de band.

8. canule de voorste kamer

1. Schik de eerste muis onder de chirurgische microscoop, en de focus van de microscoop op de gewenste hoornvlies.
   OPMERKING: Canulatie kan worden uitgevoerd op beide ogen. Rechter dominant chirurgen kan ik vindt makkelijkst om het linkeroog canule, terwijl de linker dominante chirurgen het recht kan verkiezen.
2. Zet de eerste 0,1% heparinenatrium poort van de vijf-klepverdeelstuk.
3. Onder de chirurgische microscoop, gebruik dan een pincet om voorzichtig proptose het oog. Plaats de 30-gauge naald canule in de voorste kamer ongeveer halverwege tussen de zonula ciliaris vezels en de apex van de cornea.
   1. Wees voorzichtig om te voorkomen dat krassen of aanprikken van de iris, lens, of innerlijke hoornvlies.
   2. Vermijd het penetreren van de cornea een tweede keer.
   3. Met behulp van een zachte draaiende beweging om de wrijving tussen de canule en het hoornvlies te overwinnen, plaatst u de canule diep in de voorste oogkamer.
4. Gebruik een strook van tape om de 30-gauge slang vast aan de tafel. Om de beweging van de ingebrachte canule te minimaliseren, drukt u op de 30-meter slang tegen het tafelblad, terwijl het bereiken van de tape.
5. Noteer de starttijd van de operatie.
6. Met behulp van de microscoop, verify dat geen lekkage is duidelijk. Als lekkage aanwezig is, zal de beweging van de vloeistof zichtbaar is in de buurt van het oog.
7. Bevestig visueel oculaire distentie de opmerking dat de I / R oog is groter dan het contralaterale oog. Tezamen vormen de afwezigheid van lekkage en de aanwezigheid van oculaire zwelling vertonen een succesvolle verhoging van de intraoculaire druk.
8. Solliciteer hypromellose aan beide ogen. Hypromellose dient om het hoornvlies en de afdichting microleaks smeren. Reapply hypromellose behoefte (ongeveer elke 30 min) voor langdurige smering.
9. Herhaal stap 8 totdat alle dieren zijn canule.

9. Monitor Anesthesie

1. Gebruik de teen knijpen, visuele waarneming van de snorharen, of visuele waarneming van de staart om te verifiëren dat elke muis verdoofd blijft. Moet een muis aan te tonen een pedaal terugtrekking reactie, snorhaar spiertrekkingen, of de staart beweging, gaat u direct naar stap 9.2.
2. Als een muis begint te ontwaken tijdens de operatie, liftde staart naar intraperitoneaal injecteren 0,05 ml booster in de onderbuik van achter de muis. Laat 1-2 min voor de booster door te voeren.
3. Mocht een muis vereisen extra sedatie, herhaalt u stap 9 als dat nodig is.

10. Verwijder de canule uit de voorste kamer

1. Voor elk dier, na 90 minuten zijn verstreken, trek de canule uit de voorste kamer.
2. Untape de muis van de operatietafel, verzorgen de canuleslang van naburige dieren niet te verstoren.
3. Smeer beide ogen met glijmiddel.
4. Aangezien de daaropvolgende canules worden verwijderd, regelen van de muizen in de lege container op de chirurgische tafel om te herstellen van een operatie. Niet zet het vuur van de chirurgische tafel.
5. Laat ten minste 2-3 uur voor herstel op de verwarmde chirurgische tafel. Houd u aan de muizen vaak tot ze volledig hersteld zijn van de narcose.

11. Maak de Equipment

1. Ontsmet de canules het gebruik van alcohol doekjes.
   OPMERKING: Andere werkwijzen voor het desinfecteren of steriliseren, bijvoorbeeld een autoclaaf, kunnen worden vervangen.
2. Verdrijven 0,1% natrium heparine uit de 5-klepverdeelstuk, 30-gauge naalden, 30-gauge buizen en canules met een 60 ml injectiespuit gevuld met lucht.
3. Spoel de 5-klepverdeelstuk, 30-gauge naalden, 30-gauge slangen en canules met behulp van een 60 ml injectiespuit gevuld met gedestilleerd water.
4. Verdrijven gedestilleerd water uit de 5-poort spruitstuk, 30-gauge naalden, 30-gauge buizen en canules met een 60 ml injectiespuit gevuld met lucht.
5. Na het desinfecteren van de canules en het spoelen van de leidingen apparaat, bewaar deze apparatuur voor hergebruik.
6. Store, weggooien, of schakel alle andere apparatuur. Laat de hitte van de chirurgische tabel op.

12. Return alle muizen naar hun kooien

1. Nadat de muizen te wekken van een operatie (na 2-3 uur), terug te keren elk dier naar zijn kooi. Zorg voor gel voedsel voor elke kooi. Terug alle kooien om hun aangewezen kamers.
2. Draai het vuur uit van de chirurgische tafel. Gooi al het afval, en veeg de chirurgische suite.

13. Voer het netvlies Assessment

1. In voorkomend geval, het verzamelen van netvliezen voor histologische analyse of donkere passen muizen voor electroretinogram opname.

Resultaten

Het neurodegeneratieve effect van retinale I / R door verhoogde IOP worden gewoonlijk het gebruik van twee standaard methoden. NeuN immunokleuring van neuronale kernen blijkt significant neuronaal celverlies na I / R insult (figuur 1). In het kort ontkernde ogen 7 dagen na I / R werden gefixeerd in paraformaldehyde, voorzien van de neuronale cel marker Neun en geheel gemonteerd. Beelden werden vastgelegd met behulp van confocale microscopie en cellen gelabeld met NeuN we...

Discussie

Retinale I / R schade door verhoogde IOP heeft zijn nut bij het modelleren cellulaire schade en dysfunctie, vooral neurodegeneratie, in het knaagdier retinale neurovasculaire unit bewezen. Deze procedure voorziet in een robuuste controle weefsel en is gemakkelijk te bereiken in termen van technische verfijning. Er wordt opgemerkt in deze en andere I / R schade modellen verhogen van de druk en de duur van ischemie letselernst ²⁴ kan verhogen. Om deze reden hebben sommige beoefenaars gekozen om ischemische druk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579