Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van de patiënt afgeleid fibroblast-achtige synoviocyten, met behulp van een lentivirale systeem zonder feeder-cellen.

Samenvatting

Volwassen somatische cellen kan worden teruggedraaid in een pluripotente stamcel-achtige toestand met behulp van een gedefinieerde set van herprogrammering factoren. Talrijke studies hebben geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit diverse somatische celtypen gegenereerd door transduceren vier Yamanaka transcriptiefactoren: Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc. De studie van iPSCs blijft op het snijvlak van biologisch en klinisch onderzoek. In het bijzonder kunnen patiëntspecifieke iPSC worden gebruikt als baanbrekend instrument voor de studie van ziekten pathobiology aangezien iPSC kan worden geïnduceerd door het weefsel van een individu. Reumatoïde artritis (RA) is een chronische ontstekingsziekte, geclassificeerd door de vernietiging van kraakbeen en botten in het gewricht. Synoviale hyperplasie is een van de belangrijkste redenen of symptomen die leiden tot deze resultaten in RA. Fibroblast-achtige synoviocyten (FLSS) zijn de belangrijkste component cellen in de hyperplastische synovium. FLSS in de joint onbeperkt vermenigvuldigen, uiteindelijk invasie van de aangrenzende cartilleeftijd en bot. Momenteel kan de hyperplastische synovium alleen worden verwijderd door een chirurgische ingreep. De verwijderde synovium wordt gebruikt voor RA onderzoek als een materiaal dat de ontsteking van het gewricht weerspiegelt. Als een belangrijke speler in de pathogenese van RA, kan FLSS worden gebruikt als materiaal voor het genereren en onderzoeken van de iPSCs van RA-patiënten. In deze studie gebruikten we de FLSS van een RA patiënt iPSCs te genereren. Met behulp van een lentivirale systeem, ontdekten we dat FLSS RA patiënt-specifieke iPSC kan genereren. De iPSCs gegenereerd FLSS kan verder worden gebruikt als een instrument om de pathofysiologie van RA bestuderen in de toekomst.

Inleiding

Pluripotente stamcellen zijn de volgende generatie platform in verschillende klinische en biologisch gebied. Ze zijn een veelbelovend hulpmiddel dat kan worden gebruikt in ziektemodel, drug screening en regeneratieve medische therapie. Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) werden voornamelijk gebruikt om te studeren en te begrijpen pluripotente cellen. Echter geïsoleerd door de vernietiging van de menselijke blastocyst, hESCs worden geassocieerd met verschillende ethische overwegingen. In 2007, Dr. Shinya Yamanaka en zijn team een ommekeer in de cel programmering en stamcellen ontwikkeld op basis van humane volwassen lichaamscellen ^1,2. Anders dan bij hESCs, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen uit volwassen lichaamscellen, het vermijden van de ethische obstakels.

Gewoonlijk worden iPSCs gegenereerd door levering van vier exogene genen: Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc. Deze Yamanaka factoren zijn oorspronkelijk geleverd met behulp van lentivirale en retrovirale systemen. De eerste iPSCs werden afgeleid uit muizen somatische cells ^3. Daarna werd de techniek toegepast op humane dermale fibroblasten ^1,2. Daaropvolgende studies met succes gegenereerd iPSCs uit verschillende bronnen, zoals urine ^4, bloed ^{5,6, 7} keratinocyten, en verschillende andere celtypen. Er zijn echter een aantal somatische cellen die niet zijn gebruikt herprogrammering en screening van de herprogrammering capaciteiten van verschillende celtypen van specifieke weefsels in ziektetoestand, nog steeds vereist.

Reumatoïde artritis (RA) is een ziekte die alle verbindingen kan vallen; leiden tot auto-immuunziekten in andere organen. RA treft ongeveer 1% van de volwassenen in de ontwikkelde wereld. Het is een vrij veel voorkomende ziekte en de incidentie neemt jaarlijks ^8. Echter, RA is moeilijk te identificeren in de vroege stadia en oncebone vernietiging treedt er geen behandeling die de schade kan herstellen. Bovendien werkzaamheid van het geneesmiddel verschilt van patiënt tot patiënt, en het is moeilijk om de dokter voorspellenine die nodig is. Daarom is de ontwikkeling van een geneesmiddel-screeningsmethode nodig, en celmateriaal dat de voorwaarden van RA kan weerspiegelen vereist.

Fibroblast-achtige synoviocyten (FLSS) een actieve mobiele deelnemer in de pathogenese van RA ^9,10. FLSS bestaan ​​in de synoviale intimale voering tussen het gewrichtskapsel en holte, die ook wordt aangeduid als het synovium. Door ondersteuning van de gezamenlijke structuur en verschaffen voedingsstoffen naar de omringende kraakbeen, FLSS meestal spelen een cruciale rol in gewrichtsfunctie en onderhoud. Echter, FLSS in RA een invasief fenotype. RA FLSS hebben een kanker-achtige fenotype, uiteindelijk vernietigen van de omliggende bot door oneindige proliferatie ^10. Met deze unieke eigenschap kan FLSS worden gebruikt als een veelbelovend materiaal dat pathobiologie van RA kan reflecteren. Toch zijn deze cellen zelden geproduceerd, en de cel fenotypes veranderen als de cellen gaan door middel van een aantal passages in in vitro voorwaarden. Daarom kan het ingewikkeld om RA FLSS gebruiken als middel dat de toestand van de patiënt kan vertegenwoordigen.

Theoretisch kan RA-patiënten afkomstig iPSCs (RA-iPSCs) een ideaal hulpmiddel voor drug discovery en verder onderzoek. Gegenereerde iPSCs hebben zelfvernieuwing capaciteit en kan worden gehandhaafd en uitgebreid in vitro. Met pluripotentie, kunnen deze cellen worden onderscheiden in volwassen chondrocyten en osteocyt geslachten, die celmateriaal kan een bijdrage leveren voor specifiek onderzoek in RA en andere bot-gerelateerde ziekten ^11.

In deze studie laten we zien hoe te isoleren en uit te breiden FLSS vanuit een operatief verwijderd synovium, en hoe RA-iPSCs genereren uit FLSS gebruik lentivirussen bevatten Yamanaka factoren.

Protocol

Ethiek Verklaring: Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861).

1. synoviocyt Isolatie en uitbreiding

1. synoviocyt Isolation
   1. Steriliseren twee paar chirurgische schaar en een pincet.
   2. Breng de synoviale weefsel een 100 mm schaal en was met 5 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% penicilline / streptomycine.
   3. Snijd de gelige vetweefsel en bot residuen. Breng de bijgesneden weefsel een putje van een 6-well plaat en voeg 5 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 20% foetaal runderserum (FBS).
   4. Hak de weefsels met de schaar tot stukken klein genoeg om een ​​wegwerp pipet penetreren.
   5. Breng de weefsel-bevattende media met een 50 ml conische buis. Oogst de resterende materiaal door toevoeging van 5 ml DMEM met 20% FBS aan de 6-well plaat en breng aan de buis.
   6. Dooi collagenase op ijs. collagenase aan een eindconcentratie van 0,01% en sluit de buis met parafilm. Incubeer in een waterbad bij 37 ° C onder schudden gedurende 4 uur.
   7. Na incubatie, vul de buis met DMEM met 20% FBS, totdat het totale volume 50 ml en centrifugeer bij 300 xg, kamertemperatuur 10 min.
   8. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 40 ml van media om de pellet te resuspenderen.
   9. Herhaal stap 1.1.10-1.1.11.
   10. Resuspendeer de pellet in 25 ml DMEM met 20% FBS en wacht op de grote brokken weefsel zinken naar de bodem.
   11. Breng de bovenstaande een 100 mm schaal en incubeer bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende 14 dagen.
2. Synoviocyt onderhoud en uitbreiding
   1. Gooi de inhoud van de plaat en was de cellen met 5 ml PBS.
   2. Voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA en incubeer bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende 2 min.
   3. Tik op de schotel voorzichtig en transfer de cellen om een ​​15 ml conische buis. Centrifugeer de cellen bij 250 xg, kamertemperatuur 2 min.
   4. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 30 ml DMEM met 20% FBS.
   5. Breng de cellen tot 3 x 100 mm gerechten, zonder dat er zichtbaar restmateriaal.
   6. Vervang de media met verse media elke 3 d. Splits de cellen bij 80% confluentie onder toepassing van 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Handhaven tot passage 3 voor gebruik. Verdeel elk gerecht van de cellen in 3 gerechten in elke fractie.
      LET OP: Na het bereiken van passage 3, kunnen cellen die niet zullen onmiddellijk worden gebruikt, worden bevroren.

2. Herprogrammering FLSS behulp Lentivirussen-coderend Yamanaka Factors

1. Transductie (D0)
   1. Zaad 3 x 10 ⁴ cellen per putje van een 6-wells plaat in groeimedia (500 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine). Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C in 5% CO2.
   2. De volgende dag, verwijder dan één flacon lentivirus met 4 Yamanaka factoren: Oct4, Klf4, Sox2 en c-Myc uit de vriezer en ontdooien bij 4 ° C. Opmerking: Lentivirus werd geproduceerd door het in onze vorige studie ¹¹ beschreven procedure.
   3. Terwijl thawing virus, afdrukmateriaal met FLS groeimedium (20% FBS plus antibiotica in DMEM) dat 10 ug / ml hexadimethrinebromide en 50 ug / ml ascorbinezuur.
   4. Nadat de media, voeg 30 ul van lentivirus de cellen en meng voorzichtig. Om besmetting te verbeteren, centrifuge de plaat bij 680 xg, 35 ° C gedurende 30 minuten.
   5. Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in _5% CO2.
2. Onderhoud Tot herprogrammeren is Visible
   1. Voor 3 dagen de media vervangen daags met FLS groeimedium bevattende 0,1 mM natriumbutyraat en 50 ug / ml ascorbinezuur.
   2. De volgende dag, de media vervangen met een mengsel van FLS groeimedia eniPSC media (1: 1 verhouding) met 0,1 mM natriumbutyraat en 50 ug / ml ascorbinezuur.
      Opmerking: De componenten van de iPSC media in de lijst materialen / apparatuur.
3. Splitting Cellen voor Colony Formation
   1. Bereid een vitronectine beklede 6-well plaat.
      1. Voeg 60 ul vitronectine aan 6 ml PBS zonder Ca2 ⁺ en Mg2 ^+. Zet 2 ml mengsel in elk putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. Opmerking: De werkende concentratie van vitronectine is 5 ug / ml.
   2. Op D5, was de cellen met PBS.
   3. Voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los en incubeer bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende 2 min.
   4. Oogst de cellen en centrifugeer bij 250 xg, kamertemperatuur 2 min.
   5. Splits de cellen bij 3 verschillende verhoudingen (1: 3, 1: 6 en 1: 9) om verschillende confluencies bereiken. Voeg 900 ul van media om de celpellet en resuspendeer. Voeg 300, 150, en 100 pl van het celmengsel per putje van een 6-3, 1: 6 en 1: putjesplaat een verhouding van 1 bereiken 9 resp.
   6. Vervang de media dagelijks met iPSC media tot kolonies verschijnen. Kolonies zal verschijnen na ongeveer D18. Opmerking: In dit stadium iPSC kolonies bestaan ​​naast de niet-FLSS geherprogrammeerd.
4. kolonie picking
   1. Bereid een 48-well-vitronectine beklede plaat door toevoeging van 500 pi vitronectine aan de putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
   2. Plaats de microscoop op een schone bank, en verwijder de 6-well plaat uit de incubator.
   3. Verwijder de vitronectine oplossing uit de 48-well plaat en voeg 500 ul iPSC medium aangevuld met 10 mM Rho-geassocieerde, coiled-coil met proteïne kinase (ROCK) remmer.
   4. Met behulp van een 10p pipetpunt, snijd rond de kolonie. Transfer het opgenomen kolonie één putje van de 48-well plaat.
   5. Na het plukken verscheidene kolonies Incubeer de cellen bij 37 ° C, _5% CO2.
   6. Handhaving van de cellen tot de kolonies zijn grote enough voor de overdracht. Let op: We meestal gemorst de cellen wanneer de kolonie komt uit het zichtbare gebied van de microscoop, wanneer bekeken bij 100X vergroting.

3. immunofluorescentiekleuring

1. celbereiding
   1. Plaats een steriele 18 mm dekglas in een 12-wells plaat.
   2. Voeg 1 ml PBS afkoelen en het dekglas.
   3. Vervangen door 1 ml van een 10 ug / ml vitronectine oplossing.
   4. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
   5. Gooi de vitronectine oplossing en plaat iPSCs in de vitronectine gecoate 12-well plaat en kweek gedurende 7 dagen bij 37 ° C, _5% CO2, het veranderen van de media dagelijks.
2. cel kleuring
   1. Gooi het kweekmedium en was de cellen eenmaal met PBS.
   2. Fixeer de cellen in 0,4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Permeabilize de cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Verwijder de permeabilisatieoplossing en blokkeren met PBS met 2% runderserumalbumine (BSA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Verdun de antilichamen in PBS met 2% BSA volgens tabel 1. Incubeer de cellen met de primaire antilichamen gedurende 2 uur bij KT.
   6. Voeg het secundaire antilichaam (verdund 1: 200) en incuberen van de cellen gedurende 1 uur bij KT, het vermijden licht.
   7. Behandel de cellen met 1 ul / ml DAPI gedurende 10 min.
   8. Plaats het deksel glas bovenop het objectglaasje met antifade reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, het vermijden van licht.
   9. Expressie te verifiëren met een fluorescentiemicroscoop.

4. Real-time PCR (RT-PCR)

1. Uittreksel mRNA uit de celpellet met de guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode ^11.
2. CDNA amplificeren van 2 ug totaal mRNA middels reverse transcriptie ^11.
3. Meng de voor de PCR waarbij gebruik wordt 2 pi cDNA templaat ^11.
4. Voer RT-PCR en controleer de resultaten door gelelektroforese ^11.

5. alkalisch fosfatase (AP) kleuring

1. IPSCs kweek gedurende 5-7 dagen bij 37 ° C, 5% CO ₂ voor de kleurreactie.
2. Aspireren de media en zet de cellen met 4% PFA gedurende 1 minuut.
3. Gooi het fixeermiddel en spoel de cellen met 1X spoelbuffer.
4. Bereid de reagentia voor AP kleuring. Meng de reagentia in de volgende verhouding: Fast Red Violet: naftol AS-BI-oplossing: water = 2: 1: 1.
5. Incubeer de cellen met de kleuroplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 min, het vermijden licht.
6. Gooi de kleuroplossing en spoel de cellen met spoeling buffer.
7. Bedek de cellen met PBS om uitdroging te voorkomen en expressie te verifiëren met behulp van een helder-veld microscoop.

Resultaten

In deze studie beschrijven we een protocol om iPSCs van FLSS genereren met behulp van een lentivirale systeem. Figuur 1A toont een eenvoudige schema van de FLS isolatie protocol. Na chirurgische verwijdering van het synovium, werd het weefsel in kleine stukjes gesneden met behulp chirurgische schaar. Collagenase werd toegevoegd om de cellen te isoleren van de klompjes weefsel. De cellen werden gedurende 14 dagen voor verdere verwerking. Figuur 1B...

Discussie

Vóór de ontdekking van iPSCs, wetenschappers vooral gebruikt SER om stamcel biologie en andere cellijnen te bestuderen door differentiatie. Echter, SER afkomstig uit de binnenste massa van een blastocyst, dat een vroeg stadium embryo. Om SER isoleren, vernietiging van de blastocyst is onvermijdelijk, het verhogen van ethische kwesties die niet te overwinnen zijn. Ofschoon SER hebben stemness kenmerken en pluripotentie, ze kunnen niet worden verkregen uit individuen en soms niet een ideaal instrument voor gepersonaliseer...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004