Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sequencing en genotypering op basis van studies, met inbegrip van Genome-Wide Association Studies (GWAS), kandidaat locus studies, en diep-sequencing studies, hebben veel genetische varianten die statistisch worden geassocieerd met een ziekte, trek, of fenotype geïdentificeerd. Anders dan vroege voorspellingen meeste van deze varianten (85-93%) zijn in niet-coderende gebieden en niet de aminozuursequentie van eiwitten ^1,2 niet veranderen. De functie van deze niet-coderende varianten interpreteren en die de biologische mechanismen ze op de geassocieerde ziekte heeft eigenschap of fenotype bewezen uitdagende ^3-6. genexpressie - We hebben een algem....

Protocol

1. Bereiding van oplossingen en reagentia

1. Bestel aangepaste DNA oligonucleotide probes voor gebruik in EMSA en DAPA.
   1. Om niet-specifieke eiwit binding te verminderen, het ontwerpen van korte oligo (tussen 35-45 basenparen (bp) in de lengte) ^30, en plaats de variant van belang direct in het centrum geflankeerd door de 17 bp endogene genoomsequentie. Voor EMSA oligo's, voeg een 5 'fluorofoor. Voor DAPA oligo's, voeg een 5 'biotine tag.
   2. Bestel zowel de sense streng en de omgekeerde complement streng. Als alternatief orde duplex (pre-gegloeid) oligo's. Bij het benoemen van de oligo's, baseren de nomenclatuur....

Results

In dit hoofdstuk worden representatieve resultaten van wat te verwachten op voorwaarde bij het uitvoeren van een EMSA of DAPA, en de variabiliteit met betrekking tot de kwaliteit van het lysaat wordt gekenmerkt. Bijvoorbeeld is gesuggereerd dat invriezen en ontdooien eiwitmonsters meerdere keren kan leiden tot denaturatie. Om de reproduceerbaarheid van EMSA analyse verkennen in de context van deze "bevriezen-ontdooien" cycli, twee 35 bp oligo verschillen op een genetische varia.......

Discussion

Hoewel vooruitgang in sequencing en genotypering technologieën zijn sterk verbeterd ons vermogen om genetische varianten geassocieerd met de ziekte te identificeren, is ons vermogen om de functionele mechanismen beïnvloed door deze varianten begrijpen achter. Een belangrijke bron van het probleem is dat veel ziekte-geassocieerde varianten liggen in n on-coderende gebieden van het genoom, die waarschijnlijk van invloed moeilijker te voorspellen mechanismen die genexpressie. Hier presenteren we een protocol gebaseer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1 M)	Sigma	646563	Reducing agent
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	87786	Prevents catabolism of TFs
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10x)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/ml of penicillin, 10,000 µg/ml of streptomycin, and 25 µg/ml of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25 mM HEPES