Method Article

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Populatie- en familiegebaseerde genetische studies resulteren meestal in de identificatie van genetische varianten die statistisch geassocieerd zijn met een klinische ziekte of fenotype. Voor veel ziekten en eigenschappen zijn de meeste varianten niet-coderend en zullen waarschijnlijk werken door subtiele, relatief moeilijk te voorspellen mechanismen te beïnvloeden die de genexpressie controleren. Hier beschrijven we een algemene strategische aanpak om niet-coderende varianten te prioriteren en ze te screenen op hun functie. Deze aanpak omvat computationele prioritering met behulp van functionele genomische databases, gevolgd door experimentele analyse van differentiële binding van transcriptiefactoren (TFs) aan risico- en niet-risico-allelen. Zowel voor elektroforese-mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) als voor DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genetische varianten, wordt een synthetisch DNA-oligonucleotide (oligo) gebruikt om factoren in het nucleaire lysate van ziekte- of fenotype-relevante cellen te identificeren. Voor EMSA worden de oligonucleotiden met of zonder gebonden nucleaire factoren (vaak TFs) geanalyseerd door niet-denaturerende elektroforese op een tris-boraat-EDTA (TBE) polyacrylamidegel. Voor DAPA worden de oligonucleotiden gebonden aan een magnetische kolom en de nucleaire factoren die specifiek de DNA-sequentie binden, worden geëlueerd en geanalyseerd door massaspectrometrie of met een reducerende natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door Western blot-analyse. Deze algemene aanpak kan breed worden gebruikt om de functie van niet-coderende genetische varianten te bestuderen die geassocieerd zijn met elke ziekte, eigenschap of fenotype.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sequencing en genotypering op basis van studies, met inbegrip van Genome-Wide Association Studies (GWAS), kandidaat locus studies, en diep-sequencing studies, hebben veel genetische varianten die statistisch worden geassocieerd met een ziekte, trek, of fenotype geïdentificeerd. Anders dan vroege voorspellingen meeste van deze varianten (85-93%) zijn in niet-coderende gebieden en niet de aminozuursequentie van eiwitten 1,2 niet veranderen. De functie van deze niet-coderende varianten interpreteren en die de biologische mechanismen ze op de geassocieerde ziekte heeft eigenschap of fenotype bewezen uitdagende 3-6. genexpressie - We hebben een algemene strategie om de moleculaire mechanismen die varianten verwijzen naar een belangrijk tussenproduct fenotype te identificeren ontwikkeld. Deze leiding is speciaal ontworpen om modulatie van TF binding door genetische varianten te identificeren. Deze strategie combineert computationele benaderingen en moleculair biologische technieken om te voorspellenbiologische effecten van kandidaat-varianten in silico en controleer deze voorspellingen empirisch (figuur 1).

figure-introduction-1
Figuur 1:.. Strategische aanpak voor de analyse van niet-coderende genetische varianten stappen die niet zijn opgenomen in de gedetailleerde protocol in verband met dit manuscript zijn grijs Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In veel gevallen is het belangrijk om te beginnen uitbreiding van de lijst van varianten die allemaal in hoge linkage-onevenwicht (LD) met elkaar verbonden statistisch variant omvatten. LD is een maat voor niet-willekeurige associatie van allelen op twee verschillende chromosomale posities, die kan worden gemeten door de r 2 7 statistiek. r 2 is een maat voor de linKage onevenwichtigheid tussen twee varianten, met een r 2 = 1 aangeeft perfecte verbinding tussen twee varianten. Allelen hoge LD blijken co-segregeren op het chromosoom in voorouderlijke populaties. Huidige genotypering arrays niet alle bekende varianten in het menselijk genoom. In plaats daarvan gebruik maken van de LD in het menselijk genoom en omvatten een subset van de bekende varianten die als proxies voor andere varianten binnen een bepaalde regio van LD 8. Aldus kan een variant zonder biologische gevolg worden geassocieerd met een bepaalde ziekte omdat het in LD met de causale variant-de variant met een zinvolle biologisch effect. Procedureel, is het raadzaam om te zetten van de nieuwste versie van de 1000 genomen projecteren 9 variant call-bestanden (VCF) in binaire bestanden compatibel zijn met Plink 10,11, een open-source tool voor het gehele genoom vereniging analyse. Vervolgens worden alle andere genetische varianten met LD r 2> 0,8 bij elke ingang genetische variant kunnen worden geïdentificeerd als kandidaten. Het is belangrijk om de overeenkomstige referentiegroep voor dit stap- bijvoorbeeld als een variant geïdentificeerd bij personen van Europese afkomst, de data van onderwerpen van soortgelijke afkomst moeten worden gebruikt voor LD expansie.

LD expansie resulteert vaak in tientallen kandidaat varianten, en het is waarschijnlijk dat slechts een klein deel daarvan bijdragen aan ziektemechanisme. Vaak is onhaalbaar experimenteel onderzoeken elk van deze varianten afzonderlijk. Daarom is het nuttig om de duizenden publiekelijk beschikbare functionele genomische datasets te benutten als een filter om voorrang te geven aan de varianten. Zo heeft de ENCODE consortium 12 duizenden ChIP-seq experimenten waarin de binding van TF en co-factoren en histon markeringen uitgevoerd in diverse contexten, samen met chromatine bereikbaarheidsgegevens van technologieën zoals DNase-seq 13, ATAC -seq 14 en FAIRE-seq 15. databases en webservers zoals de UCSC Genome Browser 16, Roadmap Epigenomics 17, Blueprint Epigenome 18, Cistrome 19 en Remap 20 bieden gratis toegang tot de gegevens die door deze en andere experimentele technieken in een breed scala van celtypen en voorwaarden. Wanneer er te veel varianten experimentele onderzoeken, kunnen deze gegevens worden gebruikt om prioriteit die zich binnen waarschijnlijk regulerende gebieden desbetreffende cel- en weefseltypen. Verder wanneer een variant binnen een ChIP-seq piek voor een specifiek eiwit, deze gegevens kunnen potentiële leads geven over de specifieke TF (s) of co-factoren waarvan de binding zou kunnen beïnvloeden.

Vervolgens worden de resulterende prioriteit varianten experimenteel gescreend om voorspelde genotype-afhankelijke eiwit binding te valideren met behulp van EMSA 21,22. EMSA meet de verandering in de migratie van de oligo op een niet-reducerende TBE gel. Fluorescent gemerkte oligo wordt geïncubeerd met denucleaire lysaat en binding van nucleaire factoren de beweging van de oligo vertragen op de gel. Op deze wijze oligo dat meer kernfactoren is gebonden zal een sterker fluorescentiesignaal op scantoepassingen. Met name EMSA geen voorspellingen over de specifieke eiwitten waarvan de binding zal worden beïnvloed vereisen.

Zodra varianten zijn geïdentificeerd die zich binnen het voorspelde regelende gebieden en kunnen verschillend binding kernfactoren zijn computationele werkwijzen toegepast om de specifieke TF (n) waarvoor bindende ze invloed kunnen voorspellen. Wij geven de voorkeur aan CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, UniProbe 26 en JASPAR 27 gebruiken. Zodra de kandidaat-TF's worden geïdentificeerd, kunnen deze voorspellingen specifiek worden getest met behulp van antilichamen tegen deze TF's (EMSA-supershifts en DAPA-Westerns). Een EMSA-supershift bij de bereiding een TF-antilichamen voor de nucleaire lysaat en oligo. Een positief resultaat in een EMSA-supershift is represented een verdere verschuiving in de EMSA band, of een verlies van de band (besproken in referentie 28). In de complementaire DAPA, een 5'-gebiotinyleerde oligo duplex die de variant en 20 basenparen flankerende nucleotiden zijn geïncubeerd met nucleaire lysaat uit relevante type (s) cel nucleaire factoren die specifiek binden de oligo vangen. De duplex-oligo nucleaire factor complex geïmmobiliseerd op streptavidine microkralen in een magnetische kolom. De gebonden nucleaire factoren worden rechtstreeks verzameld via elutie 29,48. Bindende voorspellingen kunnen dan worden beoordeeld door een Western blot met gebruik van antilichamen specifiek voor het eiwit. In gevallen waarin er geen duidelijke voorspellingen, of te veel voorspellingen, de eluties van variant pull-downs van de DAPA experimenten kan een proteomics kern worden gestuurd om de kandidaat-TF's te identificeren met behulp van massaspectrometrie, die vervolgens kunnen worden gevalideerd met behulp van deze eerder beschreven werkwijzen.

In de rest van de article, is de gedetailleerde protocol voor het EMSA en DAPA analyse van genetische varianten voorzien.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van oplossingen en reagentia

  1. Bestel aangepaste DNA oligonucleotide probes voor gebruik in EMSA en DAPA.
    1. Om niet-specifieke eiwit binding te verminderen, het ontwerpen van korte oligo (tussen 35-45 basenparen (bp) in de lengte) 30, en plaats de variant van belang direct in het centrum geflankeerd door de 17 bp endogene genoomsequentie. Voor EMSA oligo's, voeg een 5 'fluorofoor. Voor DAPA oligo's, voeg een 5 'biotine tag.
    2. Bestel zowel de sense streng en de omgekeerde complement streng. Als alternatief orde duplex (pre-gegloeid) oligo's. Bij het benoemen van de oligo's, baseren de nomenclatuur op een gevestigde verwijzing genoom.
      Let op: "Risk" en "non-risk" aanwijzing kan zijn ziekte en projectspecifieke, terwijl de "referentie" en "non-reference" zijn meer universeel relevant.
    3. Bij aankomst van de oligos kort spin down de inhoud en resuspendeer in nuclease-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 100 μ; M. Store gesuspendeerd voorraad bij -20 ° C. Bescherm oligo gelabeld met een fluorofoor van licht door het wikkelen met aluminiumfolie.
Naam Volgorde
rs76562819_REF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG Een GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REV GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FOR GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REV GAAGTGAGAAGATGACTAAC C CTCTCTCATTAAGGCATTAC

Tabel 1: Voorbeeld EMSA / DAPA oligonucleotide ontwerp om een SNP testen differentiële binding. "REF" staat voor de referentieallel, terwijl "NONREF" staat voor de niet-referentieallel. "FOR" staat voor de voorwaartse streng, terwijl "REV" geeft aan zijn complement. De SNP wordt gezien in rood.

  1. Bereid cytoplasmatische extractie (CE) buffer met een eindconcentratie van 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl en 0,1 mM EDTA in gedeïoniseerd water.
  2. Bereid nucleaire extractie (NE) buffer met een eindconcentratie van 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl en 1 mM EDTA in gedeïoniseerd water.
  3. Bereid annealing buffer met een eindconcentratie van 10 mM Tris (pH 7,5-8,0), 50 mM NaCl en 1 mM EDTA in gedeïoniseerd water.

2. Voorbereiding van nucleair lysaat van gekweekte cellen

Opmerking: Dit experimentele protocol werd geoptimaliseerd met behulp B-lymfoblastoïde cellijnen, maar is getest in verscheidene ongerelateerde hechtende / ophanging cellijnen en werkt universeel.

  1. Culture B-lymfoblastoïde cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum en 1 x antibioticum-antimycoticum bevattende 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 250 ng / ml amfotericine B.
    1. Zaad op een afstand van 200,000-500,000 levensvatbare cellen / ml en incubeer kolven bij 37 ° C met 5% kooldioxide in een rechtopstaande positie ontlucht of losse doppen.
      Opmerking: De groei van B-lymfoblastoïde cellen vertraagt ​​wanneer ze meer dan 1.000.000 cellen / ml te bereiken. Breken cel ontploffing door en neer te pipetteren meerdere malen en cellen opnieuw 200,000-500,000 cellen / ml in een snelle groei te handhaven.
  2. Was gekweekte cellen tweemaal met 10 ml ijs- koude met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), het afsluiten bij 4 ° C, 300 g gedurende 5 minuten en verwijder PBS via aspiratie.
  3. Aantal cellen met een hemocytometer en resuspendeer pellet met 1 ml ijskoude PBS per 10 7 cellen.
    Opmerking: Als bijvoorbeeld lyseren van 2 x 10 7 </ Sup> cellen, hersuspenderen in 2 ml PBS.
  4. Aliquot 1 ml tot 1,5 ml microcentrifugebuizen zodat elke buis bevat 10 7 cellen in PBS. Centrifugeer bij 3300 xg gedurende 2 min 4 ° C en zuig af PBS.
  5. Voor gebruik, voeg 1 mM dithiothreitol (DTT), 1x fosfataseremmer en 1x proteaseremmer een werkvoorraad van CE buffer. Resuspendeer celpellet met 400 gl CE buffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
  6. Voeg 25 ul van 10% Nonidet P-40 en meng door pipetteren. Centrifugeer bij 4 ° C, maximale snelheid gedurende 3 minuten. Giet en gooi de supernatant.
  7. Voor gebruik, voeg 1 mM DTT, 1x fosfataseremmer en 1x proteaseremmer een werkvoorraad van NE buffer. Resuspendeer celpellet met 30 ul van NE buffer en meng door vortexen.
  8. Incubeer bij 4 ° C in een buis rotator of op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer 3300 xg gedurende 2 min 4 ° C.
  9. Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof (nucleair lysaat) en hoeveelheid voordat u bij -806, C meerdere vries-dooicycli dat het eiwit kan verminderen voorkomen. Laat een 10 ul monster te eiwitconcentratie te meten met behulp van de bichoninic acid test (BCA) 31.

3. Elektroforetische Mobility Shift Assay (EMSA)

  1. Bereid Oligo Working Stock en EMSA Gel.
    1. Als oligo's werden besteld in duplex, ontdooien van de 100 uM voorraad en verdund 1: 2000 in gloeien buffer om een ​​50 nm werkvoorraad te bereiken.
    2. Als oligo enkelstrengs werden besteld, dooi de 100 pm voorraden en verdund 1:10 in gloeien buffer tot 100 nm werkvoorraden te realiseren. Combineer 100 pi van 100 nM complement streng oplossing met elkaar in een microcentrifugebuis.
      1. Plaats in een verwarmingsblok bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Zet de verwarmingsblok en laat de oligo langzaam afkoelen tot kamertemperatuur gedurende ten minste één uur voor gebruik.
    3. Pre-run de EMSA Gel.
      1. Verwijder de schuif uit een prefab 6% TBE gel en spoel onder gedemineraliseerd water meerdere malen aan een buffer van de putten te verwijderen. Bereid 1 L 0,5X TBE buffer door het toevoegen van 50 ml 10x TBE tot 950 ml gedeïoniseerd water.
      2. Monteer de gel-elektroforese apparatuur en controleer op lekken door het vullen van de binnenkamer met 0.5x TBE buffer. Als er geen buffer lekt in de buitenste kamer, vul de buitenste kamer ruwweg tweederde van de weg.
      3. Pre-run de gel bij 100 V gedurende 60 min.
      4. Spoel elk putje met 200 pi 0,5x TBE buffer.
  2. Bereid Binding Buffer Master Mix.
    1. Bereid 10x bindingsbuffer met een eindconcentratie van 100 mM Tris, 500 mM KCI, 10 mM DTT; pH 7,5 in gedemineraliseerd water.
    2. In een microcentrifugebuis, maakt een master mix bestaande uit reagentia voor alle reacties (10 pl 10x bindingsbuffer, 10 pl DTT / polysorbaat, 5 pl poly d (IC) en 2,5 ul zalmsperma DNA; Tabel 2). Bereid een additionele 10%om rekening te houden volume verlies als gevolg van pipetteren.
Reagens Eindconc. Rxn # 1 Rxn # 2 Rxn # 3 Rxn # 4
ultrapuur water 20 pl vol. 13,5 pl 11.98 pi 13.5μl 11.98 pi
10x Binding Buffer 1x 2 gl 2 gl 2 gl 2 gl
DTT / TW-20 1x 2 gl 2 gl 2 gl 2 gl
Zalmsperma DNA 500 ng / gl 0,5 pl 0,5 pl 0,5 pl 0,5 pl
1 ug / ul Poly d (IC) 1 ug 1 pi 1 pi 1 pi 1 pi
Nuclear Extract (5,26 ug / ul) 8 ug - 1,52 pl - 1,52 pl
NE Buffer 1,52 pl - 1,52 pl -
Referentieallel oligo 50 fmol 1 pi 1 pi - -
Niet-referentieallel oligo 50 fmol - - 1 pi 1 pi

Tabel 2: Voorbeeld EMSA reactie Setup. De tabel toont een voorbeeld EMSA testen van de hypothese dat er genotype-afhankelijke binding van TF aan een specifiek SNP.

  1. Add nuclease-vrij water aan elke microcentrifugebuis zodat het uiteindelijke volume na toevoeging van alle reagentia wordt 20 pl.
  2. Voeg de juiste hoeveelheid (5,5 pl) van master mix aan elke microcentrifugebuis.
  3. Voeg 8 ug nucleaire lysaat op de juiste microcentrifugebuizen. Omvat buizen met de oligo zonder nucleair extract als negatieve controles (bv Tabel 2, RXN # 1 en # 3 rxn).
    Opmerking: De optimale hoeveelheid lysaat per reactie moet proefondervindelijk worden bepaald door titratie. In het algemeen titreren verschillende 2-10 ug lysaat volstaat.
  4. Voeg 50 fmol van oligo om de juiste microcentrifugebuizen. Flick te mengen en kort draaien de inhoud naar de bodem van de buis. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Als attempting een supershift Incubeer het lysaat mengsel antilichaam gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur vóór de toevoeging van oligos. Het wordt aanbevolen om 1 ug van een chip-grade antilichaam voor het beste resultaat.
  5. Voeg 2 pl 10x Orange geladen kleurstof aan elke microcentrifugebuis. Pipet op en neer om te mengen.
  6. Laad de monsters in de pre-run 6% TBE gel door pipetteren op en neer om te mengen en dan het verdrijven van elk monster in een aparte goed. Voer de gel bij 80 V tot de oranje kleurstof 2/3 heeft gemigreerd naar 3/4 van de weg naar beneden de gel. Dit moet ongeveer 60-75 minuten duren.
  7. Verwijder de gel uit de plastic cassette door nieuwsgierige hem open met een gel mes en plaats de gel in een container met 0,5% TBE buffer om te voorkomen dat het uitdroogt.
  8. Plaats de gel op het oppervlak van een infrarood chemiluminescentie en beeldvormingssysteem, waarbij u eventuele luchtbellen of verontreinigingen die het beeld verstoren elimineren.
  9. Met behulp van het scansysteem software, klikt u op het tabblad "Acquire"en selecteer "tekenen Nieuwe" naar een doos om het gebied dat aangeeft waar de gel op het oppervlak van de scanner.
  10. In de sectie "Channels" van het tabblad "Acquire", selecteert u het kanaal dat overeenkomt met de golflengte van de fluorofoor tag op de oligo. In de sectie "Scanner", klikt u op "voorbeeld" naar een lage kwaliteit preview-scan te krijgen. Pas de scan gebied door de blauwe doos de verworven voorvertoning omlaag naar het gedeelte van de gel rond te slepen af ​​te beelden.
    Opmerking: Bijvoorbeeld, bij gebruik van oligo gelabeld met een 700 nm fluorofoor, zorg ervoor dat de "700 nm" kanaal is geselecteerd voor het scannen.
  11. In de sectie "Scan Controls", selecteer de "84 uM" resolutie optie en de "Medium" kwaliteit optie. Stel de scherpstelling offset halve dikte van de gel. Opmerking: Bijvoorbeeld, een 1 mm gel een 0,5 mm nadruk afwijking gebruikt.
  12. In de sectie "Scanner", klikt u op "Start" naar bEgin de scan.
    Opmerking: Tijdens het scannen, de helderheid, contrast en kleuren kunnen vaak handmatig afhankelijk van de fabrikant van het scansysteem aangepast.
  13. Nadat de scan is voltooid, selecteert u het tabblad "Beeld" en klik op "Draaien of spiegelen" in het hoofdstuk "Create" om de richting te corrigeren. Sla het image-bestand door te klikken op "Export" in het hoofdmenu en selecteer dan "Single afbeelding te bekijken."

4. DNA Affinity Purification Assay (DAPA)

  1. Voorbereiding van 5 uM Oligo werken Stock.
    1. Als oligo's werden besteld in duplex, ontdooien van de 100 uM voorraad en verdund 1:20 in gloeien buffer tot een 5 uM werkvoorraad te bereiken.
    2. Als oligo enkelstrengs werden besteld, dooi de 100 pm voorraden en verdund 1:10 in gloeien buffer tot 10 urn werkvoorraden te realiseren. Combineer 10 pi van 10 uM complementaire strengen met elkaar. Plaats in een verwarmingsblok bij 95 ° C5 minuten. Zet de verwarmingsblok en laat de oligo langzaam afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
  2. Voordat Verwarm de bindingsbuffer lage stringentie wasbuffer, hoge stringentie wasbuffer en elutiebuffer tot kamertemperatuur.
    Opmerking: Een eindconcentratie van 50 ng / ml Poly kan d (IC) aan de bindingsbuffer, lage stringentie wasbuffer en hoge stringentie wasbuffer toegevoegd om mogelijke niet-specifieke binding van eiwitten aan het oligo verminderen.
  3. Bereid de binding mengsels voor elke variant.
    1. Meng 1 deel nucleaire lysaat met 2 volumes bindingsbuffer.
      Opmerking: De benodigde hoeveelheid lysaat moet proefondervindelijk worden bepaald door variabele overvloed aan TF. Met behulp van tussen de 100-250 ug nucleaire lysaat per kolom volstaat in de meeste gevallen.
    2. Voeg 1x fosfatase inhibitor, 1x proteaseremmer, en 1x binden versterker (optioneel) en meng door flicking de buis meerdere malen.
      Opmerking: 100X bindingenhancer bestaat uit 750 mM MgCl2 en 300 mM ZnCl2. Voeg binding enhancer indien de binding van TF aan DNA afhankelijk cofactoren of reductiemiddelen. Als deze informatie niet bekend is, voegt de binding versterker.
    3. Voeg 10 gl 5 uM gebiotinyleerd capture DNA (50 pmol) aan elke respectieve binding mengsel. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Incubatietijd en kan variëren afhankelijk van het TF. De optimale waarden moeten experimenteel worden bepaald.
  4. Voeg 100 ul streptavidine microkralen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voor elke oligo probe getest, plaats een bindende kolom in de magnetische scheider. Plaats een microcentrifugebuis recht onder elke kolom binden en 100 gl bindingsbuffer toepassing op de kolom te spoelen.
  6. Pipetteer de inhoud van elke bindende mengsel in afzonderlijke kolommen en de vloeistof volledig stromen door de kolom in de microcentrifugebuis alvorens verder te gaan. Zorg ervoor dat de kolommen label met de variant oligo dat werd gebruikt in de binding mengsel. Label het doorstroomkanaal samples en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen de lage stringentie-wassingen verzamelen.
  7. Breng 100 ul van lage stringentie wasbuffer aan de kolom; wachten tot de kolom reservoir leeg is. Herhaal wassen 4x. Label de low-wassing monsters en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen om de hoge stringentie wasbeurten verzamelen.
  8. Breng 100 pi van hoge stringentie wasbuffer aan de kolom; wachten tot de kolom reservoir leeg is. Herhaal wassen 4x. Label de hoge stringentie monsters en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen de pre-elutie verzamelen.
  9. Voeg 30 ul van natief elutiebuffer aan de kolom en laat gedurende 5 minuten. Label de pre-elutie monsters en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen de elutie verzamelen.
    Opmerking: Dit is niet het gebonden eiwit te elueren; het wast de andere high-stringentebuffer uit de kolom en vervangt deze door elutiebuffer de doeltreffendheid van de elutie maximaliseren.
  10. Voeg een extra 50 pi inheemse elutiebuffer om de gebonden TF elueren. Voor een hogere opbrengst maar minder geconcentreerde eluaat, voeg nog eens 50 pl elutiebuffer natieve en laat het doorstroomkanaal.
    Opmerking: Analyseer elutie monsters met massaspectrometrie om de identiteit van de gebonden TF 32 bepalen. Daarna controleren de proteomische resultaten door natrium dodecyl sulfiet polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door een Western blot 33. Als massaspectrometrie niet beschikbaar is, voert een zilverkleuring behulp standaardtechniek plaats van een Western blot om de grootte van het eiwit (en) waarop genotype-afhankelijke binding te bepalen. Gebruik deze informatie om een ​​beperking van de lijst van de voorspelde TF's uit de computationele aanpak beschreven in de inleiding.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit hoofdstuk worden representatieve resultaten van wat te verwachten op voorwaarde bij het uitvoeren van een EMSA of DAPA, en de variabiliteit met betrekking tot de kwaliteit van het lysaat wordt gekenmerkt. Bijvoorbeeld is gesuggereerd dat invriezen en ontdooien eiwitmonsters meerdere keren kan leiden tot denaturatie. Om de reproduceerbaarheid van EMSA analyse verkennen in de context van deze "bevriezen-ontdooien" cycli, twee 35 bp oligo verschillen op een genetische varia...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel vooruitgang in sequencing en genotypering technologieën zijn sterk verbeterd ons vermogen om genetische varianten geassocieerd met de ziekte te identificeren, is ons vermogen om de functionele mechanismen beïnvloed door deze varianten begrijpen achter. Een belangrijke bron van het probleem is dat veel ziekte-geassocieerde varianten liggen in n on-coderende gebieden van het genoom, die waarschijnlijk van invloed moeilijker te voorspellen mechanismen die genexpressie. Hier presenteren we een protocol gebaseer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Erin Zoller, Jessica Bene en Lindsey Hays voor hun input en leiding bij de ontwikkeling van het protocol. MTW werd gedeeltelijk ondersteund door NIH R21 HG008186 en een Trustee Award-subsidie van de Cincinnati Children's Hospital Research Foundation. ZHP werd gedeeltelijk ondersteund door T32 GM063483-13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Custom DNA OligonucleotidesIntegrated DNA Technologieshttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-500KCl, voor CE buffer
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Voor CE en NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0Life TechnologiesR1021Voor CE, NE en annealing buffer
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1NaCl, voor NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0InvitrogenBP1756-100Voor annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, voor celwassing
DL-Dithiothreitol oplossing (1 M)Sigma646563Reducerend middel
Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific87786Voorkomt katabolisme van TFs
Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Scientific78420Voorkomt defosforylering van TFs
Nonidet P-40 VervangerIBI ScientificIB01140NP-40, voor nucleaire extractie
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Voor het meten van eiwitconcentratie
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910Bevat alle benodigde EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 WellsInvitrogenEC6265BOXVoor EMSA
TBE Buffer (10x)Thermo ScientificB52Voor EMSA
FactorFinder Starting KitMiltenyi Biotec130-092-318Bevat alle benodigde DAPA buffers
Licor Odyssey CLxLicorAanbevolen scanner voor DAPA/EMSA
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062Bevat 10.000 eenheden/ml penicilline, 10.000 µg/ml streptomycine en 25 µg/ml Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine SerumGibco26140-079FBS, voor kweekmedium
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Bevat L-glutamine en 25 mM HEPES

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  3. Ward, L. D., Kellis, M. Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease. Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).
  4. Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges. Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).
  5. Zhang, F., Lupski, J. R. Non-coding genetic variants in human disease. Hum Mol Genet. , (2015).
  6. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  7. Slatkin, M. Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future. Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).
  8. Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822(2012).
  9. 1000 Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).
  10. Chang, C. C., et al. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4, 7(2015).
  11. Purcell, S., et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).
  12. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  13. Crawford, G. E., et al. Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS). Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).
  14. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  15. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  16. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
  17. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  18. Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes. Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).
  19. Liu, T., et al. Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies. Genome Biol. 12 (8), R83(2011).
  20. Griffon, A., et al. Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape. Nucleic Acids Res. 43 (4), e27(2015).
  21. Staudt, L. M., et al. A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes. Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).
  22. Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes. Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).
  23. Weirauch, M. T., et al. Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).
  24. Ward, L. D., Kellis, M. HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).
  25. Boyle, A. P., et al. Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB. Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).
  26. Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).
  27. Mathelier, A., et al. JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).
  28. Smith, M. F. Jr, Delbary-Gossart, S. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).
  29. Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay. Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).
  30. LI-COR. Odyssey Infrared EMSA Kit: Instruction Manual. , Available from: http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910 (2014).
  31. Thermo Fisher Scientific, Inc. BCA Protein Assay Kit: User Guide. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2014).
  32. Wijeratne, A. B., et al. Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. J. Vis. Exp. (84), (2014).
  34. Lu, X., et al. Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression. Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).
  35. Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. Complex roles of Stat1 in regulating gene expression. Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).
  36. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230(2014).
  37. Heng, T. S., Painter, M. W. Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells. Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).
  38. Wu, C., et al. BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources. Genome Biol. 10 (11), R130(2009).
  39. Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).
  40. Wang, J., et al. Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).
  41. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
  42. Miltenyi Biotec, Inc. µMACS FactorFinder Kit: Data sheet. , Available from: http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx (2014).
  43. Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis. Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).
  44. Yang, T. -P., et al. Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies. Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).
  45. Fort, A., et al. A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster. Blood. 117 (1), 276-282 (2011).
  46. Solberg, N., Krauss, S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).
  47. Rahman, M., et al. A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A. Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).
  48. Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles