Methodenartikel

Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

10.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

19 juni 2016

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In dit artikel

Samenvatting

Axon-geleidingsmoleculen reguleren neuronale migratie en gerichte groei-kegel navigatie. We presenteren een krachtige methode, de stripe assay, om het vermogen van geleidingsmoleculen om neuronen aan te trekken of af te stoten te beoordelen. In dit protocol demonstreren we de stripe assay door de capaciteit van FLRT2 te laten zien om gekweekte hippocampale neuronen af te stoten.

Samenvatting

Groeiende axonen ontwikkelen een zeer mobiele structuur aan hun punt, de zogenaamde groeikogel. De groeikogel maakt contact met extracellulaire omgevingssignalen om de axonale groei te navigeren. Netrin, slit, semaforine en efrinen zijn bekende geleidingsmoleculen die axonen kunnen aantrekken of afstoten bij binding aan receptoren en co-receptoren op het axon. De geactiveerde receptoren initiëren verschillende signaalmoleculen in de groeikogel die de structuur en beweging van de neuron veranderen. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol voor een streepjesassay om het vermogen van een geleidingsmolecuul om neuronen aan te trekken of af te stoten te beoordelen. In deze methode worden gedissocieerde hippocampale neuronen van E15,5 muizen gekweekt op laminine-gecoate schalen, verwerkt met afwisselende strepen van het ectodomein van fibronectine en leucinerijk transmembraan-eiwit-2 (FLRT2) en controle immunoglobuline G (IgG) fragment kristalliseerbare regio (Fc) eiwit. Zowel axonen als cellichamen werden sterk afgestoten van de FLRT2-gecoate streepgebieden na 24 uur van cultuur. Immunokleuring met tau1 toonde aan dat ~90% van de neuronen verdeeld was op de Fc-gecoate strepen vergeleken met de FLRT2-Fc-gecoate strepen (~10%). Dit resultaat geeft aan dat FLRT2 een sterk afstotend effect heeft op deze neuronen. Deze krachtige methode is niet alleen toepasbaar voor primair gekweekte neuronen, maar ook voor een verscheidenheid aan andere cellen, zoals neuroblasten.

Inleiding

Axon begeleiding is het proces waarbij nieuw gevormde neuronen sturen hun axonen Tijdens het ontwikkelen van het zenuwstelsel 1,2. Het ontwikkelen van axonen dragen een zeer beweeglijke structuur op hun tip genaamd de groei kegel. De groei kegel zintuigen extracellulaire signalen naar het pad van de axon te navigeren. Navigatie moleculen, zoals spleet semaphorines en ephrines kunnen aantrekken of afstoten axons afhankelijk van hun wisselwerking met geschikte receptoren en co-receptoren op het axon 1,3,4. De geactiveerde receptoren dragen signalen naar de groeikegel dat de organisatie van het cytoskelet en van axon groei-cone bewegingen beïnvloeden.

Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om de werking van aantrekkende en afstotende moleculen evalueren. Chemo-aantrekkende en insectenwerende middelen kunnen worden toegediend in de groei / cultuurmedium met een gradiënt concentratie (bv., Dunn's kamer of μ-dia) 5,6, in een zeer geconcentreerde spot door micro-pipette (bijv., draaien bepaling) 7 of op een homogene concentratie bad toepassing (bv., groeikegel ineenstorting test) 8,9.

Andere werkwijzen omvatten een streep assay of microcontactprinten (μCP), waarin een chemo-aantrekkende of afstotende wordt gecoat op het oppervlak van een plaat als substraat 10-12. Thestripe test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Bonhoeffer en collega's in 1987 tot topografische kaart brengen in het kuiken retino-tectal systeem 13 te analyseren. De oorspronkelijke methode vereist een vacuüm systeem om manteleiwitten op polycarbonaat nucleopore membranen met behulp van gestreepte en fijnmazige matrices. In latere versies werden de recombinante eiwitten direct gedrukt op het oppervlak van een kweekplaat in een gestreept patroon via smalle spleet silicium matrices 14,15. Onlangs hebben verschillende onderzoeksgroepen succes toegepast deze streep test om de analyse van axon begeleiding moleculen activiteiten 16-21.

Hier presenteren we het gedetailleerd protocol voor een streep test die de aantrekking of afstoting van axon begeleiding moleculen voor gedissocieerde hippocampus neuronen meet. Met name kan deze werkwijze worden toegepast bij minimaal uitgerust laboratorium instellingen. Voor deze test zijn afwisselende strepen van een fluorescent gelabeld substraat en een controle-eiwit gegenereerd op een plastic schaaltje met een siliconen matrix met 90-um spleten en gecoat met laminine. In onze demonstratie, los hippocampus neuronen uit E15.5 muizen werden gekweekt op afwisselende strepen van recombinante ectodomein van fibronectine en leucine-rijke transmembraaneiwit-2 (FLRT2) en de controle Fc proteïne 21. Na 24 uur kweken werden zowel de axonen en cellichamen van de neuronen sterk afgestoten van de FLRT2 strepen. Kleuring met anti-Tau1 antilichaam bleek dat ~ 90% van de neuronen werden verspreid op-Fc beklede gebieden, tegenover ~ 10% op de FLRT2-Fc, wat aangeeft dat FLRT2 een sterke afstotendefunctie hippocampale neuronen 21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd Hamamatsu University School of Medicine.

1. Bereiding van Matrices

  1. Kook 4-8 ​​silicone matrices in de magnetron of op een hete plaat gedurende 5 minuten en laat ze goed drogen gedurende 1 uur onder laminaire stroming (gestreept kant naar boven).
    Opmerking: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming.
  2. Blaas perslucht of gebruik plakband om stof uit de gestreepte kant van de matrices te verwijderen. Houd de gestreepte kant schoon, dus het kan vast houden aan het plaatoppervlak.
  3. Plaats voorzichtig de matrices op 6-cm plastic schaaltjes door te drukken met een vinger (één matrix per gerecht; streep naar beneden). Zorg dat er geen luchtbellen tussen de matrix en het gerecht. Markeer de locatie van de strepen aan de onderzijde van de kweekschaal.
  4. Als de matrix niet te bevestigen, herhaal stap 1.2.

2. Stripe Generation en Laminin Coating voor Neuron Cultuur

  1. Bereid fluorescent gelabeld recombinant eiwit (25 pl elk voor injectie [stap 2,2] of 100 pl elk voor de plaatsingsmethode [stap 2.2.1]) door mengen van het Fc-gemerkt eiwit (10-50 ug / ml) en een fluorescente kleurstof- geconjugeerd anti-humaan Fc antilichaam (1-3 ratio: 30-150 gg / ml) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vervolgens incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Met behulp van een 22-G spuit injecteren 25 ul van het recombinante eiwit bereid in de vorige stap (2,1) door de kleine opening aan de zijde van de matrix (pijl in figuur 1A, 1C en 1E).
    1. Of hang 100 gl van het recombinante eiwit in de bovenste gleuf van de matrix en zuig ongeveer de helft van de oplossing uit het kleine gat (pijlen in Figuur 1A, 1C en 1E), zodat het recombinante eiwit blijft de gestreepte gebieden.
  3. Incubeer de schotel voor 30 min bij 37 ° C in een celkweek incubator.
  4. Plaats 300 pl PBS in de bovenste gleuf (Figuur 1B) en zuig de kleine opening aan de zijkant van de matrix (pijl in figuur 1 A, C en E) voor losse recombinante eiwitten te verwijderen. Laat de PBS niet volledig te zuigen, omdat de eiwitten zal drogen. Herhaal deze stap twee keer. (3 keer in totaal)
  5. Verwijder voorzichtig de matrix en onmiddellijk plaats ~ 100 ul van controle-eiwit (10-50 ug / ml; Fc) om de hele gestreepte gebied bestrijken, het creëren van een alternatieve coating. Vervolgens incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de celkweek incubator.
  6. Na wassen van de schaaloppervlak driemaal met PBS, laag met ~ 100 ul van 20 ug / ml laminine in PBS.
    Opmerking: laminine moet worden op ijs ontdooid om stolling te voorkomen.
  7. Incubeer de schotel voor 1 uur bij 37 ° C in de celkweek incubator.
  8. Was de schaal oppervlak drie keer met PBS en voeg cultuur medium. Plaats de gecoate schaal kweekmedium in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C tot gebruik.

3. Het kweken hippocampus neuronen van E15.5 muizenembryo's

  1. Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie en te isoleren drie E15.5 embryo's.
  2. Snijd de huid en de schedel sagittally op de middellijn van het hoofd met een schaar en verwijder de hersenen met behulp van een kleine lepel. Breng de hersenen voorzichtig een 60 mm petrischaal met 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
  3. Met behulp van een scalpel, knip de hemisferen waaronder cortex, hippocampus en striatum (Figuur 2A). Vervolgens ontleden de hippocampusgebied door voorzichtig verwijderen van de hersenvliezen, en breng de ontleed hippocampale weefsels in een 15 ml centrifugebuis met 2 ml HBSS oplossing, op ijs (figuur 2B-C). Verzamel 6 hippocampus van 3 embryo in de buis, die voldoende is voor het kweken van neuronen in 8 gerechten.
  4. Vervang de HBSS oplossing met trypsine / EDTA-oplossing (2 ml) en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 15 min in een waterbad.
    Opmerking: Zuig HBSS zonder centrifugeren en niet de HBSS oplossing decanteren door het kantelen van de buis.
  5. Neutraliseer de trypsine activiteit door toevoeging van 500 ul foetaal runderserum (FBS).
  6. Centrifugeer het mengsel bij 100 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en was de pellet met 2 ml kweekmedium. Herhaal deze stap nog een keer.
  7. Pipet de hippocampus op en neer 10 keer in kweekmedium met behulp van een 1000-ul tip met een groot gat (cut-tip) om het weefsel te scheiden.
  8. Ga verder met een gewone (ongesneden) 1000-ul tip en pipet het gedissocieerde weefsel op en neer om een ​​single-cell suspensie te verkrijgen.
  9. Scheid de afzonderlijke cellen door ze door een 80-100-um mesh cel zeef.
  10. Centrifugeer de gefilterde enkele celsuspensie bij 150 xg gedurende 5 minuten.
  11. Verwijder de bovenstaande vloeistof door opzuigen, en resuspendeer de Pellet (neuronen) in 2 ml kweekmedium.
  12. Tel de cellen met een hemocytometer met trypan blauw kleuring de dichtheid en levensvatbaarheid te bepalen. Dan plaat 10.000 neuronen in 150 ul kweekmedium voor elke set stripes.The schorsing zorgvuldig worden geplaatst om de hele streep regio te dekken.

4. Visualisatie van cellichamen en axonen door immunofluorescentiekleuring gebruik van een anti-Tau1 Antibody

  1. Na 24 uur cultuur, zuig het medium zonder de hechtende cellen, en bevestig de neuronen met voorverwarmde 4% paraformaldehyde (PFA) / 4% sucrose / PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
  2. Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Indien gewenst, gebruik maken van een waterafstotende pen om een ​​cirkel rond de gestreepte regio te vestigen op de hoeveelheid antilichaam die nodig is te verminderen.
  3. Permeabilize de neuronen met 0,3% Triton X-100 / PBS gedurende 5 minuten.
  4. Incubeer de neuronen met blokkeeroplossing die 3% donkey serum en 0,1% Triton X-100 voor30 min gevolgd door incubatie met een anti-Tau1 antilichaam (1: 200) in 1% donkey serum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N bij 4 ° C.
  5. Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Incubeer de neuronen met een fluorofoor geconjugeerd anti-muis IgG antilichaam in 1% runderserumalbumine (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS gedurende 30 min.
  6. Was het plaatoppervlak 3 maal met PBS. Bedek de gestreepte gebied met een 18 mm x 18 mm dekglas met behulp van 50 pi antifade oplossing. vermijd luchtbellen die interfereren met de beeldvorming.
  7. Verkrijgen fluorescerende beelden met een fluorescentiemicroscoop met de juiste systeem, bijvoorbeeld x10 objectieflens filter sets voor GFP en RFP en 1000 msec blootstellingstijd (figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gedissocieerde hippocampale neuronen van E15.5 muizen werden uitgeplaat en gedurende 24 uur op strepen van fluorescent gelabelde controle Fc (figuur 3A-C) of FLRT2-Fc (Figuur 3D-F) afwisselen met ongemerkte controle Fc. In beide gevallen, de neuronen werden samengevoegd en uitgebreid hun axonen als bundels. Op het controle Fc / Fc strepen, de neuronen werden gelijkmatig verdeeld over de fluorescent gelabelde en ongelabelde strepen en breidden ze hun axon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een streep test die recombinant eiwit en gedissocieerde neuronen maakt gebruik van het E15.5 muis hippocampus. Deze test maakt het mogelijk efficiënte observatie van afstotelijk, aantrekkelijk, of neutraal reacties van neuronen om een ​​recombinant eiwit van interesse in een gestreept patroon. Een groot voordeel van dit protocol is de eenvoudige methode voor het genereren van de stroken, waarbij het ​​eiwit direct gedrukt op het oppervlak van een plastic schaaltje, in vergelijking met de traditio...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van de Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 en 26670090 aan S.Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ml centrifuge tubeViolamo 1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibodyThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibodyThermo ScientificA-21203Verdunning 1/500
Anti-Tau1 antibodyChemiconMAB3420Verdunning 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481Alternatief montagemedium kan worden gebruikt
B27 supplementThermo Scientific17504-044Verdunning 1/50
Bovine serum albuminSigma01-2030-2
Cell strainer 100 umBD Falcon352360
Centrifugation machineKubota2410
Cover glass 18mmx18mmMatsunami18x18 mm No. 1
DAKO penDAKOS2002Alternatieve waterafstotende pen kan worden gebruikt
Disposable scalpelFeather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Fluorecent microscopeNikonE600
Forceps No. 5Fine Science Tools11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Verdunning 1/100
Hamilton SyringeHamilton805N22 gauge, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
Human IgG, Fc FragmentJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
Normal Donkey SerumJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicillin-StreptomycinThermo Scientific15070-063Verdunning 1/100
Plastic culture dish, 60 mmThermo Scientific150288
Silicone MatricesBeschikbaar en koopbaar bij Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo MicroscopeOlympusSZ61
Tip, 1000 uLWatson125-1000S
Transparent sticky tapeTesa57315Alternatieve kleefband kan worden gebruikt
Triton X-100SigmaT8787
Trypan blue, 0.4%Bio-Rad145-0013
Trypsin/EDTAThermo Scientific25300-054
Culture mediumNeurobasal aangevuld met B27, GlutaMAX en Penicillin-Streptomycin.

Referenties

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AxonbegeleidingEiwitrepulsieFLRT2 eiwitGedissocieerde NeuronenLamininecoatingImmunokleuring Tau1CelkweekEiwitbinding

Gerelateerde artikelen