Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Summary

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Abstract

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Introduction

Momenteel plaatsen enkele cellen afzonderlijk in een kweekruimte wordt gewoonlijk bereikt door beperkende verdunning of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Voor veel laboratoria beperkende verdunning een geschikte methode, aangezien het slechts vereist een pipet en weefselkweek platen, die gemakkelijk beschikbaar zijn. In dit geval wordt een celsuspensie serieel verdund tot een geschikte celdichtheid, en vervolgens in cultuur putjes geplaatst met een manuele pipet. Deze compartimenten enkele cellen worden vervolgens gebruikt voor cellulaire analyse, zoals genetische heterogeniteit screenen ¹ en ² kolonievorming. Deze methode is low-t....

Protocol

Opmerking: De fotomasker ontwerpen voor onze microfluïdische apparaat fabricage werden getekend door het gebruik van een computer-aided design (CAD) software. De ontwerpen werden vervolgens gebruikt om chroom fotomaskers met behulp van een commerciële dienst te fabriceren. De PDMS-apparaten werden gemaakt met behulp van zachte lithografie technieken. ¹¹

1. Fabricage van Master Molds door Lithography

1. Voordat het fotolithografieproces ¹² Gebruik de 4-inch silicium wafers als een substraat en drogen van de wafels in een conventionele oven bij 120 ° C gedurende 10 minuten.
2. Reinig de gedehydrateerde s....

Results

De microfluïdische platform eencellige het kweken omvat een microkanaal (200 urn hoog) met twee sets microwell arrays (Figuur 2A). De twee stellen microwell arrays worden genoemd als capture-well (25 urn in diameter en 27 urn in diepte) en cultuur putjes (285 urn in diameter en 300 urn diepte) van eencellige isolatie en kweek, respectievelijk, en elk capture goed gepositioneerd in het midden van een kweek-well gezien vanuit het bovenaanzicht (figuur 2B)........

Discussion

-Microwell-apparaat systemen ^6,14 werden gebruikt voor single-cell bewerking en analyse, zoals grootschalige eencellige trapping ⁶ en één hematopoietische stamcel proliferatie ^15. Hoewel goed grootte, aantal en vorm kan worden aangepast voor specifieke toepassingen, de eencellige isoleerrendement altijd gevaar wanneer de grootte van de put toeneemt. ^9,15

Om deze beperking te overwinnen, Park et al. Rapporteerde een microfluïdische chip met.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm