Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Abstract

Het bestuderen van de heterogeniteit van enkele cellen is cruciaal voor veel biologische vragen, maar is technisch moeilijk. Daarom is er behoefte aan een eenvoudige, maar toch snel doorvoerende, methode om experimenten met enkele celkweek uit te voeren. Hier rapporteren we een microfluïdische chip-gebaseerde strategie voor hoog-efficiënte enkele celisolatie (~77%) en demonstreren we de mogelijkheid om langdurige enkele celkweek (tot 7 dagen) en cellulaire heterogeniteit analyse uit te voeren met behulp van een klonogene assay. Deze toepassingen werden gedemonstreerd met KT98 muis neurale stamcellen, en A549 en MDA-MB-435 menselijke kankercellen. Hoge enkele celisolatie-efficiëntie en lange termijn kweekmogelijkheden worden bereikt door verschillende maten microwells te gebruiken aan de boven- en onderkant van het microfluïdische kanaal. De kleine microwell array is ontworpen voor precieze isolatie van enkele cellen, en de grote microwell array wordt gebruikt voor enkele cel klonale kweek in de microfluïdische chip. Dit microfluïdische platform vormt een aantrekkelijke aanpak voor enkele celkweek toepassingen, vanwege zijn flexibiliteit van instelbare celkweekruimtes voor verschillende kweekstrategieën, zonder vermindering van isolatie-efficiëntie.

Introduction

Momenteel plaatsen enkele cellen afzonderlijk in een kweekruimte wordt gewoonlijk bereikt door beperkende verdunning of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Voor veel laboratoria beperkende verdunning een geschikte methode, aangezien het slechts vereist een pipet en weefselkweek platen, die gemakkelijk beschikbaar zijn. In dit geval wordt een celsuspensie serieel verdund tot een geschikte celdichtheid, en vervolgens in cultuur putjes geplaatst met een manuele pipet. Deze compartimenten enkele cellen worden vervolgens gebruikt voor cellulaire analyse, zoals genetische heterogeniteit screenen ¹ en ² kolonievorming. Deze methode is low-throughput en arbeidsintensief, zonder gebruikmaking van een robotarm om bijstand omdat de Poisson verdeling aard van de beperkende verdunningsmethode beperkt eencellige events een maximale waarschijnlijkheid van 37% ^3. FACS machines met een geïntegreerde robotarm kan de beperking van de Poisson-verdeling overwonnen door nauwkeurig placing een single-cell in een cultuur goed in een tijd ^4. De hoge schuifspanning mechanische (dus verminderde cellevensvatbaarheid) ⁵ en machine aankoop en bedrijfskosten hebben het gebruik ervan beperkt in veel laboratoria.

Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, zijn microschaal apparaten zijn ontwikkeld om zeer efficiënt enkele cellen in microwells ⁶ laden. Echter, de microputjes niet voldoende ruimte voor het beladen cellen prolifereren, vanwege de noodzaak om de grootte van elk microputje dicht bij die van een enkele cel om de eencellige loading waarschijnlijkheid maximaliseren. Aangezien cultuur assays vereist in veel cellen gebaseerde toepassingen (bijvoorbeeld klonogene assay ^7), grotere microputjes (90-650 pm in diameter of lengte) zijn ook gebruikt om langere celculturen. Echter, zoals de beperkende verdunning methode, ze bezitten ook low single cell laden efficiëntie, variërend van 10 -. 30% ⁸, 9

Eerder hebben we een high-throughput microfluïdische platform ontwikkeld om enkele cellen te isoleren in afzonderlijke microwells en tonen de toepassing ervan in klonogene assay van de geïsoleerde cellen. ¹⁰ De inrichting werd gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS) en omvat twee stellen microputje arrays microwell met verschillende afmetingen, die grotendeels de efficiëntie van het laden van een enkele cel in een microtiterplaat waarvan de grootte kan verbeteren is aanzienlijk groter dan de cel. Met name de "dual-well" concept maakt de grootte van de kweek gebied flexibel worden aangepast zonder dat de eencellige capture efficiency, waardoor het eenvoudig om de vormgeving van de inrichting aan te passen aan verschillende celtypen en toepassingen. Deze high-efficiency methode moet nuttig zijn voor de lange termijn celkweek experimenten voor mobiele heterogeniteit studies en monoklonale cellijn vestiging.

Protocol

Opmerking: De fotomasker ontwerpen voor onze microfluïdische apparaat fabricage werden getekend door het gebruik van een computer-aided design (CAD) software. De ontwerpen werden vervolgens gebruikt om chroom fotomaskers met behulp van een commerciële dienst te fabriceren. De PDMS-apparaten werden gemaakt met behulp van zachte lithografie technieken. ¹¹

1. Fabricage van Master Molds door Lithography

1. Voordat het fotolithografieproces ¹² Gebruik de 4-inch silicium wafers als een substraat en drogen van de wafels in een conventionele oven bij 120 ° C gedurende 10 minuten.
2. Reinig de gedehydrateerde silicium wafers met zuurstofplasma behandeling bij 100 watt gedurende 30 seconden in een plasma schoner.
3. Verwarm twee kookplaten bij 65 ° C en 95 ° C respectievelijk, de volgende bakproces.
4. Coat 5 g negatieve fotoresist (PR) op de gereinigde silicium wafers door een spin coater; centrifugeren op 1200 rpm (SU-8 50) gedurende 30 seconden op het microkanaal laag produceren.
5. Plaats de PRgecoate wafer op een voorverwarmde verwarmingsplaat bij 65 ° C gedurende 12 minuten en overgebracht naar een voorverwarmde verwarmingsplaat bij 95 ° C gedurende 33 min (bij 100 urn dik patronen) om een ​​zacht bakproces voeren.
6. Na het bakken, plaatst u de PR gecoat silicium wafer op de houder van een semi-automatische masker aligner en lijn het een 25.400 dpi resolutie transparantie fotomasker.
7. Blootstellen PR beklede siliciumwafel aan UV-licht (365 nm) bij een dosis van 500 mJ / ^cm2 aan de PR patroon op de siliciumwafel te maken.
8. Verwijder de wafer uit de aligner en plaats deze op een kookplaat voor post-bakken bij 95 ° C gedurende 12 min.
9. Week de wafers in SU-8 ontwikkelaaroplossing (propyleenglycolmonomethyletheracetaat, PGMEA) te wassen verknoopte PR 12 min en voorzichtig droog met stikstofgas om de uitlijnmerktekens bloot.
10. Nogmaals, jas 5 g van de negatieve fotolak op de wafers door een spin coater; centrifugeren op 700 rpm (SU-8 100) voor 30 sec en 1200 rpm (SU-8 10) gedurende 30 seconden voor 300 &# 181; m dik patroon en 27 micrometer dik patroon respectievelijk de microwell laag te maken.
11. Plaats de PR beklede wafer op een verwarmingsplaat bij 65 ° C gedurende 4 minuten en bij 95 ° C gedurende 8 minuten (bij 27 urn deep capture-gat laag); en bij 65 ° C gedurende 40 min en bij 95 ° C gedurende 110 min (bij 300 um diepe kweek-gat laag).
12. Na afkoeling zet de PR beklede siliciumwafel op de mask aligner met UV licht.
13. Blootstellen PR beklede siliciumwafel het UV-licht (365 nm) bij een dosis van 250 mJ / ^cm2 (bij 27 pm dik patroon) en 700 mJ / ^cm2 (bij 300 urn dik patroon).
14. Bak de plakken bij 95 ° C gedurende 5 min (27 urn dik patroon) en 30 min (300 urn dik patroon), respectievelijk.
15. Wegwassen verknoopte PR door de PGMEA gedurende 6 min (27 urn dik patroon) en 25 min (300 urn dik patroon), respectievelijk, en vervolgens drogen met stikstofgas.
16. Meet de hoogte van het patroon is voorzien opde wafer met een aftastende laser profilometer door het plaatsen van de wafer op het xy-fase van een scanning laser profilometer.
    1. Pas de focal plane om duidelijk te laten zien het patroon is voorzien op de wafer met behulp van de "camera view" observatie mode onder een 20X objectief.
    2. Schakel de observatie-modus van "camera view" naar "laser view", en stel de bovenste en onderste posities van de functies.
    3. Stel de meetmodus, ruimte, kwaliteit en z-pitch tot transparante (top), 1 lijn (1024 x 1), hoge nauwkeurigheid en 0,5 urn, respectievelijk, en druk vervolgens op de start bodem om de meting te beginnen.

2. Voorbereiding van de PDMS Inrichtingen voor het Single-cell Isolation

1. Voordat PDMS casting, silaniseren de meester mallen met trichloorsilaan tot een hydrofoob oppervlak, waardoor het makkelijker te pellen van de PDMS replica's van de master mallen maken.
   1. Plaats de master mallen en een weging boot met200 pl van trichloorsilaan in een exsiccator en vacuüm (-85 kPa) gelden voor 15 min.
   2. Stop de stofzuiger en laat de master mallen in de exsiccator tot de meester schimmels bij kamertemperatuur silaniseren gedurende tenminste 1 uur.
   3. Verwijder de master mallen uit de exsiccator en leg elke master schimmel in een 10 cm petrischaal.
2. Meng een totale hoeveelheid van 17,6 g PDMS polymeer kit met een base en een hardingsmiddel in een verhouding van 10: 1, en giet het PDMS op de master schimmel in de petrischaal.
3. Plaats de petrischaal in een exsiccator en vacuüm (-85 kPa) gelden voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen in het PDMS.
4. Verwijder de petrischaal uit de exsiccator en plaats deze in een conventionele oven op 65 ° C gedurende 3-6 uur naar het PDMS te genezen.
5. Verwijder de uitgeharde PDMS replica van de master mallen en punch twee gaten als een inlaat en een uitlaat aan beide uiteinden van het microkanaal op het capture-reeks van holtes PDMS replica van een perforatie met inwendige diameter van 0.75 mm voor de vloeibare kanaal (Figuur 2A).
6. Gebruik tape om het oppervlak van het PDMS replica's schoon te maken, en plaats dan de PDMS replica's in een plasma reiniger voor kort zuurstof plasma behandeling (100 watt voor 14 sec).
7. Verwijder de PDMS replica van het zuurstofplasma machine.
8. Lijn een top (met de capture microwells) en een bodem PDMS (met de cultuur microwells) replica met de hand onder een stereomicroscoop en brengen hen in contact.
9. Plaats de uitgelijnde PDMS replica in een oven bij 65 ° C gedurende 24 uur permanente hechting tussen de PDMS replica bereiken de uiteindelijke inrichting te vormen.
10. Week de PDMS apparaat in een gedeïoniseerd (DI) -water gevulde container en de container te plaatsen in een exsiccator onder vacuüm (-85 kPa) gedurende 15 min om lucht uit de microkanaal van de PDMS apparaat te verwijderen.
11. Plaats de DI-water gevulde PDMS inrichting in een weefselkweek kap en gebruik UV-licht (golflengte van licht: 254 nm) te steriliseren van de inrichting voor 30 min.
12. Vervang de DI water in het PDMS apparaat met een 5% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min ter voorkoming cellen plakken aan de PDMS oppervlak.
    Opmerking: De BSA coating is van cruciaal belang voor de overdracht efficiëntie van de geïsoleerde cellen uit het verbeteren van capture-well cultuur-goed.
13. Vervang de 5% BSA oplossing in de PDMS apparaat met gesteriliseerd 1x PBS oplossing.

3. Voorbereiding van de Single-cell Suspension

1. Cultuur neurale stamcel KT98 en humane carcinoma cellen A549 en MDA-MB-435 we petrischaal in conventionele celkweek incubator (37 ° C, 5% _CO2 en 95% luchtvochtigheid) om cellen te bereiden op het PDMS inrichting celexperiment .
2. Verwijder de verbruikte kweekmedium (DMEM basaal medium met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica meegeleverd) om de kweekschaal met cellen gekweekt tot 70-80% confluentie.
3. Voorzichtig te wassen van de cellen met gesteriliseerde PBS driemaal.
4. Verwijder de PBS en voeg 2 ml van een recombinant enzym mengsel met proteolytische, collagenolytisch en DNase activiteiten (zie de materialen lijst voor gedetailleerde informatie).
5. Incubeer de cultuur schotel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, en tik op de cultuur schotel naar cel onthechting te vergemakkelijken.
6. Voeg 4 ml gesteriliseerde PBS aan cellen te dispergeren en breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis.
7. Centrifugeer de buis bij 300 g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
8. Voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 1 ml gesteriliseerde PBS en tel de live aantal cellen met behulp van de standaard trypan Blue uitsluiting methode ^13.
   Opmerking: deze resuspensie stap is van cruciaal belang voor het bereiden van goed gescheiden single-cell schorsing tot de single-cell isolatie efficiëntie te verbeteren.

4. Single-cell Isolatie en Cultuur van klonen

1. Belasting 50 ui celsuspensie bij een concentratie van 2,2-2,5 x10 ^{6 cellen / ml in het microkanaal van de PDMS apparaat via het apparaat uitlaat gat met een handheld pipet.
   Opmerking: De celsuspensie laden pipet moet worden gestopt en gehouden op de eerste stop positie te voorkomen dat er luchtbellen in de microkanaal.}
2. Plaats een ander 50 pi celsuspensie door de inlaat opening gelijkmatig vullen de hele microkanaal met cellen.
3. Seal de uitlaat gat met een plug (3 mm lang, 1 mm diameter gesneden nylon vislijn) aan stroom veroorzaakt door de hydrostatische druk van de druppels op inlaat en uitlaat een gaatje te voorkomen.
   Opmerking: De pluggen werden UV gesteriliseerd in een weefselkweek kap voor gebruik.
4. Vul een 1 ml steriele spuit met kweekmedium, uitwerpen luchtbellen uit, en zet deze op een injectiepomp.
5. Sluit het medium geladen spuit naar de inlaat gat van de PDMS apparaat via een 23 G stompe naald en een poly-tetrafluoretheen (PTFE) slangen.
6. Haal de stekker uit het stopcontact gat en alleow een 2-min tijdsinterval om de cellen om zich te vestigen in de single-cell capture-putten door zwaartekracht.
7. Wegspoelen de ongevangen cellen met 300 pl cultuurmedium bij een stroomsnelheid van 600 pl / min aangedreven door de injectiepomp.
8. Wacht 2 minuten om het apparaat te stabiliseren, en sluit de inlaat en uitlaat gaten pluggen een gesloten kweeksysteem vormen.
9. Draai het apparaat met de hand om de gevangen single-cellen over te dragen aan de cultuur microwells.
10. Plaats het PDMS inrichting in een 100-mm weefselkweekplaat en voeg 10 ml gesteriliseerde PBS rondom het apparaat kweekmedium verdamping uit het microkanaal voorkomen.
11. Verplaats de kweekschaal met een conventionele celkweek incubator (37 ° C, 5% _CO2 en 95% vochtigheid) voor klonale kweek van de single-cellen.

5. Cultuur Medium Replenishment

1. Na 1 d van de cultuur, vervangt het kweekmedium in het PDMS apparaat met vers medium naar cel pr te verbeterenoliferation.
2. Plaats twee druppeltjes kweekmedium bovenop het PDMS apparaat nabij de inlaat- en uitlaatgaten gebieden te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal tijdens het uitvoeren van de volgende stap.
3. Punch twee gaten aan de bovenkant van het PDMS apparaat nabij de beide uiteinden van het microkanaal een inlaat en een uitlaat voor het microkanaal.
   Let op: niet punch via de hele twee lagen van het PDMS apparaat; in plaats daarvan slechts punch door de bovenste laag van het PDMS.
4. Sluit een 1 ml plastic spuit met vers medium aan de inlaat via een 23 G stompe naald en PTFE-buis.
5. Stroom 120 ul vers medium in de inrichting voor 5 minuten van het oude medium vervangen.
6. Plaats twee pluggen aan de inlaat en uitlaat af te dichten gaten, en de terugkeer van de inrichting aan de celkweek incubator.
7. Vernieuwen het kweekmedium elke 2 d gedurende de cultuur door het verwijderen van de afdichtpluggen, gevolgd door stap 5,4-5,5.

Results

De microfluïdische platform eencellige het kweken omvat een microkanaal (200 urn hoog) met twee sets microwell arrays (Figuur 2A). De twee stellen microwell arrays worden genoemd als capture-well (25 urn in diameter en 27 urn in diepte) en cultuur putjes (285 urn in diameter en 300 urn diepte) van eencellige isolatie en kweek, respectievelijk, en elk capture goed gepositioneerd in het midden van een kweek-well gezien vanuit het bovenaanzicht (figuur 2B)....

Discussion

-Microwell-apparaat systemen ^6,14 werden gebruikt voor single-cell bewerking en analyse, zoals grootschalige eencellige trapping ⁶ en één hematopoietische stamcel proliferatie ^15. Hoewel goed grootte, aantal en vorm kan worden aangepast voor specifieke toepassingen, de eencellige isoleerrendement altijd gevaar wanneer de grootte van de put toeneemt. ^9,15

Om deze beperking te overwinnen, Park et al. Rapporteerde een microfluïdische chip met...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Gevaarlijk. Corrosief voor de luchtwegen, reageert hevig met water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm witte basis
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	met 0,75 mm binnendiameter
Verwijderbaar plakband	3M Company	Scotch Verwijderbaar Plakband 811
Stereomicroscoop	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumine (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basaal medium	Gibco	12800-017
Foetaal bovien serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotica	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicilline-Streptomycine
Recombinant enzymmengsel	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) celmembraandye	BD Biosciences	354218	Wordt gebruikt als celtracker
Spuitpomp	Harvard Apparatus	703007
Kunststof spuit (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge stompe naalden	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoretheen (PTFE) buis	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	binnendiameter, 0,51 mm; buitendiameter, 0,82 mm