Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Samenvatting

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Samenvatting

De ingewanden - die het grootste aantal immuuncellen van elk orgaan in het lichaam te bevatten - worden voortdurend blootgesteld aan vreemde antigenen, zowel microbiële en dieet. Gegeven een beter begrip dat deze luminale antigenen meehelpen aan de immuunreactie en vorming van immuuncellen in de darm is essentieel voor een aantal systemische aandoeningen, is er toegenomen belangstelling voor het karakteriseren van de intestinale immuunsysteem. Echter, vele gepubliceerde protocollen lastig en tijdrovend. We presenteren hier een eenvoudige protocol voor de isolatie van lymfocyten uit de dunne darm lamina propria, intra-epitheliale laag en plaques van Peyer die snel, reproduceerbaar en vereist geen moeizame Percoll gradiënten. Hoewel het protocol staat de dunne darm, maar ook voor de analyse van de dikke darm. Bovendien zetten we enkele aspecten die extra optimalisatie kan nodig zijn afhankelijk van de specifieke wetenschappelijke wachtrijentie. Deze benadering resulteert in de isolatie van grote aantallen levensvatbare lymfocyten die vervolgens kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse of alternatieve wijze van karakterisering.

Inleiding

De belangrijkste taak van de dunne darm wordt vaak beschouwd als de vertering en opname van voedingsstoffen ¹ zijn. Hoewel deze metabole functie duidelijk essentieel, heeft de dunne darm een even belangrijke rol in de gastheer te beschermen tegen de voortdurende versperring van antigenen uit de omgeving binnen het lumen ^2. Het darmkanaal scheidt de buitenwereld (bv., Luminale antigenen) uit de interne omgeving van de gastheer met een epitheellaag dat slechts één cel laag dik. Als zodanig, de dunne darm immuunsysteem de enorme taak van een sluitende drempel reactiviteit, waardoor vreemde antigenen uit de voeding en commensale bacteriën aan het slijmvlies voeren met minimale of geen immuunrespons tijdens het monteren een robuuste respons tegen binnendringende pathogenen en andere "schadelijk" antigenen. Overmatige of ongepaste immuunreacties op deze antigenen kunnen leiden tot een pathologische aandoening (bv., Inflammatory darmziekte, type I diabetes, multiple sclerose), en moet worden vermeden ^3-6.

In het algemeen wordt het maagdarmkanaal beschouwd als de grootste immuun orgaan in het lichaam vertegenwoordigen, met meer dan 70% van antilichaam uitscheidende cellen ^7. De kleine-intestinale immuunsysteem is opgebouwd uit 3 hoofdvakken - de lamina propria (LP), de intra-epitheliale laag en plaques van Peyer (PPS) - die elk bevat een opvallende groep van lymfocyten ^2. De LP lymfocyten (LPLs) primair TCRαβ ⁺ T-cellen met ~ 20% B-cellen; intra-epitheliale lymfocyten (IELs) bevatten zeer weinig B-cellen meer TCRγδ ⁺ T cellen dan TCRαβ ⁺ T-cellen; en PP, die secundaire lymfoïde organen ingebed in de kleine darmwand zijn, bevatten ~ 80% B-cellen. Hoewel elk van deze anatomische gebieden heeft iets verschillende functies en ontologische bases, functioneren ze in aharmonized mode naar de host van pathogene beledigingen beschermen.

Verder groeit de waardering die de microbiota een bepalende factor voor de ontwikkeling van de intestinale immuunsysteem, met toenemende erkenning van de verwante relatie tussen specifieke microben en de ontogenie van bepaalde cellijnen ^8,9. Aangezien bovendien vorming van de intestinale immuunsysteem beïnvloedt immuunresponsen in anatomisch afstand gelegen plaatsen (bv. Artritis, multiple sclerose, pneumonie), is gebleken dat de ontwikkeling van de intestinale immuunsysteem meer ziekteprocessen relevant is dan eerder opgenomen ^{10 -12.} Als zodanig heeft interesse in kwantitatief beoordelen van de intestinale immuunsysteem verlengd tot na gastheer-pathogeen interacties om nu ook gastheer-commensaal interacties en de pathogenese van vele systemische ziekten ook.

Gezien de verschillen in de huidige methodenisolatie van intestinale lymfocyten, een methode die is geoptimaliseerd voor opbrengst, levensvatbaarheid en consistentie waarbij een evenwicht de benodigde tijd steeds belangrijker. Protocollen die Percoll gradiënten betrekken zijn tijd en arbeidsintensief en mogelijk meer kans op menselijke fouten, wat leidt tot variabele opbrengst en uitvoerbaarheid ^13. Hierin geven we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en karakterisering van lymfocyten uit alle 3 dunne darm immune compartimenten. Daarbij komt steeds meer belangstelling microbe-geïnduceerde veranderingen in het mucosale immuunsysteem, nemen we stappen die kunnen worden gebruikt om de horizontale overdracht van micro-organismen tussen muizen om te bepalen hoe deze veranderingen kwantitatief beïnvloeden de intestinale immuunsysteem.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd onder strikte toetsing en richtlijnen op basis van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Harvard Medical School, waar de veterinaire normen van de American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) in te stellen voldoet.

1. horizontale overdracht van bacteriën via Co-behuizing (optioneel)

1. Om exogene besmetting te minimaliseren (in het bijzonder bij gebruik van gnotobiotische muizen), oefenen aseptische techniek tijdens het monteren steriele kooien, met behulp van voedsel en water dat beide zijn geautoclaveerd.
2. Gebruik oor stoten of tags om individueel te markeren 6 weken oude C57BL / 6 muizen die verschillende microbiotas haven en huisvesten ze in dezelfde kooi. Omdat muizen Coprofagie eten fecale pellets uit de kooi vloer, microben vanzelf horizontaal doorgegeven tussen de muizen.
3. Co-house muizen voor ≥1 week om tijd voor microbiële overdracht en immunologische veranderingen voorafgaand aan de analyse mogelijk te maken.

2. Bereiding van een suspensie van losse cellen van de Small-intestinale Intra-epitheliale Layer en Lamina Propria

1. Voorbereiding van de Solutions
   1. Bereid extractiemedium (per dunne darm): 30 ml RPMI + 93 pl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 gl 0,5 M EDTA + 500 ul foetaal runderserum (FBS). Voeg de DTT onmiddellijk voor gebruik.
   2. Bereid spijsvertering media (per dunne darm): 25 ml RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg collagenase II + 300 ul FBS. Voeg de dispase en collagenase onmiddellijk voor gebruik.
   3. Voor alle incubaties uitgevoerd bij 37 ° C, voorverwarmen oplossingen tot 37 ° C.
2. Euthanaseren de muis door CO ₂ stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
3. Plaats de muis dorsale zijde en spuit de buik met 70% ethanol. Gebruik een schaar om een ​​laparotomie te voeren door achtereenvolgens het snijden van de huid en vervolgens peritoneale fascia langs de ventrale middellijn weerm de symphysis de processus xiphoideus, waardoor de peritoneale holte bloot.
4. Knip met een schaar de dunne darm van de maag te scheiden door doorsnijden de pylorus sfincter. Verwijder de dunne darm van het buikvlies, plagen weg de mesenteriale vet.
   1. Om volledig verwijderen van de dunne darm, maak een tweede snede in het ileo-cecal kruising. Plaats de geïsoleerde dunne darm in koude (bijv., 4 ° C) RPMI dat 10% FBS om cellevensvatbaarheid te maximaliseren.
5. Verwijder voorzichtig grote stukken vet met behulp van gebogen pincet. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het scheurt darmweefsel zichzelf terwijl het proberen om vet te verwijderen.
6. Om darminhoud, voorzichtig spoelen darmen te verwijderen met 15 - 20 ml koud PBS met behulp van een 18 G feeding naald bevestigd aan een injectiespuit.
7. Gebruik een schaar om accijnzen PP's, en leg ze in koud RPMI dat 5% FBS. PP bevinden zich aan de antimesenteric zijde van de dunne darm en verschijnen als een multi-gelobde witmassa. Afhankelijk van de specifieke stam, een muis heeft meestal 8-12 PP.
8. Snijd de dunne darm in 3-4 inch segmenten.
9. Resten vet door rollen elke dunne darm segment op keukenpapier bevochtigd met RPMI, met een doffe scalpel om het vet van het weefsel plagen.
10. Draai het weefsel in cannuleren door de intestinale segmenten gebogen pincet en grijpen het distaal uiteinde van het weefsel. gebruik dan een paar rechte tang verwijder de weefselsegment van de gebogen pincet (vanaf het proximale uiteinde), waardoor het weefsel wordt omgekeerd.
11. Plaats weefsel segmenten in een beker met 30 ml van de winning media en een roerstaafje. Bevestig de deksel op de beker, en roer bij 500 rpm gedurende 15 min bij 37 ° C; roeren moet krachtig, maar niet turbulent zijn.
12. Na incubatie, gebruik dan een stalen zeef om weefsel stukken scheiden van de epitheel-bevattende supernatant, die troebel moeten verschijnen. Deze supernatant bevat intraepithelial lymfocyten die verder kunnen worden geanalyseerd, desgewenst, door een filtering van het monster in stappen 2,18-2,23.
13. Manueel in beweging de weefselstukken in RPMI om resterend extractiemedium wegspoelen.
14. Plaats weefsel op een droge papieren handdoek en draai het einde meer dan een paar maal om de verwijdering van de resterende slijm dat niet werd bevrijd door de winning medium te vergemakkelijken.
15. Plaats weefselfragmenten in een 1,5 ml buis met 600 ui digestiemedium.
16. Gebruik een schaar om het weefsel te vermalen tot stukken niet langer vasthouden aan de schaar en de oplossing lijkt homogeen. Deze stap is essentieel om volledige enzymatische afbraak van het weefsel te verzekeren.
17. Voeg gehakt dunne darm een ​​kopje met 25 ml van de spijsvertering media. Roeren bij 500 rpm gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Halverwege de spijsvertering (bijv., 15 min), pipet op en neer met een serologische pipet te helpen breken elke grote brokken van weefsel.
18. Filter verteerd weefsel (of epithEliel laag uit stap 2.12 wanneer de verwerking IELs) door een 100 micrometer cel zeef in een 50 ml buis. Spoel het filter met 20 ml RPMI met 10% FBS.
19. Centrifugeer de gefilterde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
20. Decanteer supernatant en resuspendeer pellet voorzichtig in 1 ml RPMI met 10% FBS.
21. Filter geresuspendeerde cellen door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis. Spoel zeef met 20 ml RPMI met 10% FBS.
22. Centrifugeer gefiltreerde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
23. decanteren zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml RPMI met 2% FBS.

3. Voorbereiding van een enkele celsuspensie van Patches Peyer's

1. Transfer uitgesneden PP naar een beker met 25 ml van de spijsvertering media en een roerstaafje. Veiligheidsafsluiting en centrifugeren bij 500 rpm gedurende 10 min bij 37 ° C.
2. Filter verteerd PP's door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis. Als er klontjes Remain, druk ze door de zeef met het platte uiteinde van de plunjer van een 1 ml spuit.
3. Spoel zeef met 10 ml RPMI met 10% FBS.
4. Centrifugeer gefiltreerde oplossing bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
5. decanteren zorgvuldig supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml RPMI met 2% FBS.

4. Surface kleuring voor flowcytometrie

1. Aliquot zodanige hoeveelheid van cellen (bijv., 200 pl LPLs) in een 96 putjes ronde bodemplaat.
2. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
3. Resuspendeer cellen in 90 ui RPMI dat 2% FBS en een 1: 100 verdunning van anti-CD16 / 32 (Fc blok). Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
4. Voeg 10 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
5. Resuspendeer cellen in 250 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant dooromkeren van de plaat.
6. (Optioneel) Stain cellen met levensvatbaarheid kleurstof, indien gewenst, door volgens het protocol van de fabrikant.
7. Resuspendeer cellen in 100 gl 1% formaline om de cellen te repareren. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
8. Voeg 200 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
9. Resuspendeer cellen in 250 ul PBS. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant door het omkeren van de plaat.
10. Resuspendeer cellen in 200 ul PBS. Analyseren cellen met een flow cytometer.

Resultaten

Flow cytometrische analyse van enkelvoudige celsuspensies van dunne darm lymfocyten zou een discrete populatie van cellen die soortgelijke voorwaartse en zijwaartse verstrooiing karakteristieken als splenocyten (Figuren 1A en 1B) hebben verkregen. De lymfocyten kan beginnen te sterven als het weefsel tijdens de eerste stadia van de isolatie niet bij 4 ° C wordt gehouden, waardoor de lymfocyt populatie een onderste voorwaartse verstrooiing en zijn moeilijker te scheiden v...

Discussie

We presenteren een protocol voor de isolatie en flow cytometrische karakterisatie van small-intestinale lymfocyten, met inbegrip van de LPLs, IELs en lymfocyten in de PP. Voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de evaluatie van hoe veranderingen in de microbiota van invloed op de dunne darm immuunsysteem, we detail de eenvoudige stappen die betrokken zijn bij de horizontale overdracht van organismen tussen de muizen die verschillende microbiotas. Hoewel dit protocol is gericht op de dunne darm, de procedure is hetzelfd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sterile Gloves	Kimberly-Clark	555092
sterile mouse cage	Innovive	MS2-AD	bevat deksel, kooibodem en alpha-dri bedden
Metal feeder	Innovive	M-FEED
Water bottle	Innovive	M-WB-300
Card holder	Innovive	CRD-HLD-H
Autoclavable rodent chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medium 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Fetal Bovine Serum (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	de concentratie in het protocol is gebaseerd op een activiteitsniveau van 1.878 U/mg
Collagenase, type II	Invitrogen	17101-015	de concentratie in het protocol is gebaseerd op een activiteitsniveau van 245 U/mg
Dissecting scissors	Roboz	RS-5882
Feeding needle (18 G, 2" length)	Roboz	FN-7905
10 ml Syringe	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Disposable Scalpel (15 blade)	Miltex	4-415
Curved forceps	Roboz	RS-5211
Straight forceps	Roboz	RS-5132
Multi-purpose cups, 120 ml	VWR	89009-662
Stir bar	VWR	58949-062
Multi-position stir plate, 9-position	VWR	12621-048
Stainless steel conical strainer, 3 inch	RSVP
1.5 ml Tube	Eppendorf	0030 125.150
100 μm Cell strainer	Falcon	08-771-19
40 μm Cell strainer	Falcon	08-771-1
50 ml Conical tube	Falcon	352098
1 ml Syringe	BD	309659
96-well Plate, round-bottom	Corning	3799
Anti-mouse CD16/32 (Fc block)	Biolegend	101320
(Optional) Fixable viability dye eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% Formalin, neutral buffered	Thermo Scientific	5725