Dit protocol beschrijft een snelle en breed toepasbare methode voor onbevooroordeelde RNA-sequencing van virale monsters van humane klinische isolaten.
Methodenartikel
Onpartijdige Deep Sequencing van RNA-virussen uit klinische monsters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier schetsen we een next-generation sequencing RNA-protocol dat de novo assemblages en intra-gastheer variant oproepen van virale genomen verzameld uit klinische en biologische bronnen mogelijk maakt. De methode is onpartijdige en universeel; gebruikt het willekeurige primers voor cDNA-synthese en vereist geen voorkennis van de virale sequentie inhoud. Voordat bibliotheek constructie wordt selectieve RNase H-gebaseerde vertering gebruikt om ongewenste RNA afbreken - met inbegrip van poly (RA) drager en ribosomaal RNA - van het virale RNA-monster. Selectieve verwijdering verbetert de kwaliteit data en het aantal unieke leest viraal RNA sequentie bibliotheken. Bovendien wordt een transposase-based 'tagmentation' stap gebruikt volgens het protocol voor het algemeen bibliotheek bouwtijd vermindert. Het protocol is een snelle diepe sequencing van mogelijk meer dan 600 Lassa en Ebola-virus monsters, waaronder collecties van zowel bloed en weefsel isoleert-en is breed toepasbaar op andere microbiële genomics studies.
Inleiding
Next generation sequencing van virussen uit klinische bronnen kan de transmissie en de epidemiologie van infecties, alsmede hulp ondersteuning nieuwe diagnostische, vaccins en therapeutische ontwikkeling op de hoogte. cDNA-synthese met behulp van willekeurige primers heeft de opsporing en assemblage van genomen van uiteenlopende, co-infecterende of zelfs nieuwe virussen 1,2 toegestaan. Net als bij andere onpartijdige methoden, ongewenste verontreinigingen bezetten vele sequencing leest en een negatieve invloed sequencing resultaten. Gastheer en poly (RA) carrier RNA verontreinigingen aanwezig in vele bestaande virale monstercollecties.
Het protocol beschrijft een efficiënte en kosteneffectieve manier diepe sequencing RNA virusgenomen gebaseerd op onpartijdige totale RNA-seq. De methode maakt gebruik van een RNase H selectieve uitputting stap 3 om ongewenste gastheer ribosomaal en carrier RNA te verwijderen. Selectieve verwijdering verrijkt virale inhoud (Figuur 1) en verbetert de algehele kwaliteit van sequentiegegevens(Figuur 2) uit klinische monsters. Bovendien is tagmentation toegepast op het protocol omdat het aanzienlijk vermindert bibliotheek bouwtijd. Deze werkwijzen zijn gebruikt om snel genereren grote datasets van Ebola en Lassa virus genoom 2,4,5 en kan worden gebruikt om een groot aantal RNA-virussen bestuderen. Tenslotte is de benadering niet beperkt tot humane stalen; het nut van selectieve depletie werd aangetoond weefselmonsters verzameld van Lassa-geïnfecteerde knaagdieren en niet-humane primaten ziektemodellen 5,6.
Figuur 1. Totaal RNA Content Weerspiegelt Verrijking van Lassa virus content met behulp van Selective Uitputting. Vanaf globale inhoud (RNA-ingang) en verrijking van unieke Lassa virus (LASV) leest (Bibliotheek inhoud) op rRNA uitputting uit negen verschillende klinische isolaten. Dit cijfer is gewijzigd van 6 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Hogere kwaliteit Sequencing Na Carrier RNA Uitputting. Median basis kwaliteiten per sequencing cyclus van poly (RA) -contaminated Lassa virus libraries (rood) en controle (geen carrier waargenomen in de bibliotheek, zwart) van QC verslag 13. Zowel lezen 1 en 2 lezen van gepaarde end leest worden samengevoegd in de bibliotheek BAM-bestand en de kwaliteit scores worden getoond bij elke basis. Dit cijfer is gewijzigd van 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het virale RNA-seq protocol gegevens bouw van bibliotheken rechtstreeks uit gehaaldRNA verzameld uit klinische en biologische monsters. Om persoonlijke veiligheid te garanderen, moeten alle virale serum, plasma en weefselmonsters worden geïnactiveerd in geschikte buffers voorafgaand aan RNA-extractie. In sommige inactivatie en extractie kits, wordt carrier poly (RA) RNA opgenomen; dit zal tijdens de eerste RNase H selectieve uitputting stap worden verwijderd. Op basis van volledig herstel, de verwachte concentratie van carrier-RNA is 100 ng / ul. In het protocol, 110 ng / ul oligo dT RNA (1.1x ladingdrager concentratie) wordt gebruikt voor depletie. Als poly (rA) drager niet in het monster, dan oligo (dT) niet voorafgaand aan uitputting toegevoegd.
Het volgende protocol is geschikt voor 24 reacties in PCR plaatformaat (maximaal 250 pi volume). Een eerdere versie van dit protocol werd gemeld in Matranga, et al. 6.
Protocol
Ethiek statement: Lassa koorts patiënten werden gerekruteerd voor deze studie met behulp van protocollen door menselijke proefpersonen commissies aan de Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Kenema Government Hospital (KGH), Oyo State Ministerie van Volksgezondheid, Ibadan goedgekeurd , Nigeria en Sierra Leone ministerie van Volksgezondheid. Alle patiënten werden behandeld met een vergelijkbare standaard van zorg en werd het geneesmiddel ribavirine, al dan niet aangesloten bij de studie werden. Voor Lassa koorts (LF) van de patiënten de behandeling met ribavirine volgden de momenteel aanbevolen richtlijnen en werd over het algemeen zodra LF sterk vermoed werd aangeboden.
Als gevolg van de ernstige uitbraak van Ebola (EVD), kunnen patiënten niet worden ingestemd met onze standaard protocollen. In plaats daarvan gebruik van klinische overmaat monsters van EVD patiënten werd geëvalueerd en door Institutional Review Boards in Sierra Leone en aan de Harvard University goedgekeurd. het Office van het Sierra Leone Ethics and Scientific Review Committee, het Sierra Leone ministerie van Volksgezondheid en Sanitatie, en de Harvard Commissie voor het gebruik van menselijke onderwerpen hebben een verklaring van afstand van de toestemming verleend aan volgorde en maken publiekelijk beschikbare virale sequenties die zijn verkregen van patiënt en contact samples geïnd tijdens het Ebola-uitbraak in Sierra Leone. Deze organen ook gebruik maken van de klinische en epidemiologische gegevens voor de geïdentificeerde monsters verzameld van alle verdachte EVD patiënten die zorg tijdens de uitbraak reactie verleend. De Sierra Leone ministerie van Volksgezondheid en Sanitatie ook ingestemd met de overbrenging van niet-infectieuze, niet-biologische monsters uit Sierra Leone naar de Broad Institute en Harvard University voor genomische studies van de uitbraak monsters.
1. DNase-behandeling van Monster RNA (tot 55 ul Gewonnen Totaal RNA, ~ 4 uur)
- Stel de DNase reactie in een 96-well PCR plaat op ijs in een bio kast zoals beschreven in Tabel 1 , Stap 1.1 (totaal volume 70 pl / putje). Opmerking: Een master mix kan worden voorbereid.
- Vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Cleanup met behulp van RNA Solid Phase omkeerbare immobilisatie (SPRI) kralen.
- Warm RNA kralen tot kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Schud RNA kralen fles naar elke magnetische deeltjes die kunnen hebben gevestigd mengen. Voeg 1,8x volume (126 pl) van RNA kralen-DNase behandelde RNA (70 ui), meng met een pipet 10 keer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (totaal verbruik goed, 196 ui).
- Plaats het mengsel op het magnetische station. Wacht tot de oplossing is verdwenen (5-10 min).
- Verwijder ontruimd oplossing, terwijl op het station met een pipet en de teruggooi. Terwijl op station, wassen kralen door het bedekken pellet met 70% ethanol en incubeer gedurende 1 min. Verwijder ethanol met een pipet en teruggooi. Herhalen voor een totaal van twee wassen.
Opmerking: Het gebruik van precies 70% vers bereid ethanol is kritisch, aangezien een hoger percentage leidt tot inefficiënte wassen van kleinere moleculen, terwijl <70% ethanol verlies van monster 7 kunnen veroorzaken. - Houd plaat op het station en open laten aan de lucht drogen. Opmerking: Zorg ervoor dat u laat de kralen volledig opdrogen totdat parels beginnen te kraken.
- Voeg 55 ul van nuclease-vrij water op de plaat te elueren RNA. Verwijder plaat van het station naar de kralen en water meng door pipetteren grondig. Opmerking: Als alternatief gebruik minder water (≤ 10 ui) teneinde het totale RNA concentreren.
- Plaats de plaat terug op het station. Wacht tot oplossing wist over te dragen met een pipet om nieuwe schroefdop tube voor de lange termijn opslag (-80 ° C). Plaats 5 pl RNA in de nieuwe 96-well PCR-plaat voor uitputting (stap. 2.4).
- Optioneel. Bewaar en verdun 1 ul in 19 ul water (01:20) voor qRT-PCR of rRNA (bijvoorbeeld 18S, 28S rRNA) (Tabel 2) en virale markers 5
2. Selectieve Uitputting van Ribosomaal en Carrier RNA uit Virale RNA-monster (~ 4 uur)
- Voeg 5x 10x hybridisatie en RNase H reactiebuffers en nuclease-vrij water met lineaire acrylamide carrier zoals beschreven in Tabel 1.
- Opgericht hybridisatiereactie combineert RNA met rRNA depletie oligo (Tabel 3) en oligo (dT) op ijs in een 96-well PCR plaat zoals beschreven in Tabel 1.
Opmerking: Een master mix kan worden voorbereid. 50 femtograms (fg) van een unieke synthetische RNA (ERCCs 8) kunnen worden toegevoegd voor het volgen van zowel het virale sequencing en mogelijke index lees kruisbesmetting.- Vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
Incubeer bij 95 ° C gedurende 2 minuten, langzaam verhoging tot 45 ° C bij -0,1 ° C per sec. Pauzeer het thermocycler bij 45 ° C.
- Vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Opzetten van RNase H reactie mix op ijs als beschrijvend in Tabel 1, dan voorverwarmen bij 45 ° C gedurende 2 minuten. Opmerking: Een master mix kan worden voorbereid.
- Voeg de voorverwarmde RNase H mix de hybridisatiereactie in plaat terwijl de plaat in de thermocycler bij 45 ° C.
- Meng goed door zachtjes te pipetteren 6-8 keer. Incubeer bij 45 ° C gedurende nog 30 min. Leg ze op ijs.
- Stel de DNase reactiemengsel op ijs zoals beschreven in Tabel 1. Opmerking: Een meester mix kan worden bereid.
- Toe te voegen aan de RNase H reactie in de plaat, vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- DNase stop reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA. Vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Cleanup met behulp van RNA kralen (zie stap 1.3) met een 1.8x volume (144 ui) kralen. Elueren in 11 ul nuclease-vrij water. Opmerking: Voor een veilige koude opslag, winkel uitgeput RNEen monsters bij -80 ° C O / N.
3. cDNA Synthesis (~ 6 uur)
- Mix rRNA / RNA-carrier verarmd met willekeurige primers op ijs in een 96-well PCR plaat zoals beschreven in Tabel 1, vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Verwarm het mengsel tot 70 ° C gedurende 10 min in een thermocycler. Onmiddellijk na hitte-denaturatie, plaatst het RNA op ijs gedurende 1-5 minuten. Laat de RNA (zelfs op ijs) staan voor langer dan 5 minuten vóór de eerste streng reactie.
- Opgezet eerste streng synthesereactie in ijs zoals beschreven in Tabel 1.
Opmerking: Een master-mix kan worden voorbereid.- Toevoegen aan RNA / random primer mix in de plaat, vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Incuberen bij 22-25 ° C gedurende 10 minuten.
- Incubeer bij 55 ° C in een lucht incubator gedurende 60 minuten. Plaats de plaat op het ijs om de reactie te beëindigen. Niete: Het gebruik van een lucht incubator wordt aanbevolen om geleidelijke opwarming van de eerste streng reactie waarin de primers annealen en de eerste streng begint te rekken creëren.
- Opgericht tweede streng synthese reactiemengsel in ijs zoals beschreven in Tabel 1.
Opmerking: Een master-mix kan worden voorbereid.- Naar de eerste streng synthesereactie in de plaat, vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Incubeer gedurende 2 uur bij 16 ° C (houd deksel bij 25 ° C). Zorg ervoor dat de temperatuur boven 16 ° C stijgen.
- Plaats de plaat op ijs, vervolgens inactiveren reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA, meng voorzichtig en zorgvuldig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Cleanup met DNA kralen (zie stap 1.3 voor protocol) met behulp van 1.8x volume (153 pl) van kralen. Elueren in 9 pl elutiebuffer (EB). Bewaar 1 pl voor de kwantificering. Gebruik 1 ng van cDNA voor subsequent stappen. Als cDNA concentratie te laag is om te detecteren, gebruiken 4 ul van cDNA voor tagmentation (zie stap 4.1).
- Voor veilig koude opslag, opslag dubbelstrengs cDNA bij 4 ° CO / N of -20 ° C voor lange termijn opslag.
4. Bibliotheek Voorbereiding - DNA Library Construction (~ 4 uur)
- Overdracht 4 pl cDNA een 96-wells plaat en sla de resterende cDNA voor een tweede poging indien nodig.
- Stel de tagmentation reactiemengsel op ijs zoals beschreven in Tabel 1.
Opmerking: Een master-mix kan worden voorbereid. Background en meer besparen, is het totale volume van het reactiemengsel verlaagd tagmentation 20-10 pl. Aangezien cDNA is de beperkende factor is de hoeveelheid ATM (dwz transposome) gebruikt in de reactie verminderde ook het aantal integratieplaatsen verminderen.- Voeg tagmentation mix cDNA in de plaat, vortex zacht en grondig en centrifugeer bij 280 xg (bij kamertemperatuur) gedurende 1 min.Incubeer bij 55 ° C gedurende 5 min, bij 10 ° C.
- Eenmaal op 10 ° C, direct voeg 2,5 pl neutraliseren Tagment buffer (NT) om de reactie te beëindigen. Meng door op en neer pipetteren, centrifugeer bij 280 xg (bij kamertemperatuur) gedurende 1 min.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Opgericht PCR amplificatiereactie op ijs zoals beschreven in Tabel 1.
- Vortex zacht en grondig, centrifugeer bij 280 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Voer PCR op thermocycler met de in tabel 1 beschreven omstandigheden.
Let op: 12 cycli van PCR worden voorgesteld voor 1 ng tagmented cDNA; echter, virale klinische monsters vaak ondetecteerbare hoeveelheden cDNA. Voor kleine hoeveelheden cDNA (<1 ng), gebruik tot 18 cycli PCR genoeg bibliotheek te maken voor sequentiebepaling.
- Bibliotheek voorbereiding - opruimen en het gemeenschappelijk gebruik voor sequencing
- Breng het monster tot 50 ul met EB.
- Cleanup metDNA kralen (zie stap 1.3 voor protocol) met behulp van 0.6x volume (30 ui) kralen. Elueren in 15 ul EB.
- Bepaal de concentratie van de bibliotheek (Figuur 3) van geleidend gebied analyse (150 tot 1000 bp) met behulp bioanalyzer software 9, met uitzondering van primer dimeren (~ 120 bp) van regio analyse. Let op: Als alternatief kan qPCR worden gebruikt om bibliotheken 10 kwantificeren.
- Pool bibliotheken de laagste molaire concentratie van 1 nM of hoger. Als bibliotheek dan 1 nM, voeg een klein volume bibliotheek pool (~ 1x volume van andere bibliotheken) om sequentie-informatie uit deze bibliotheken vangen.
- Cleanup zwembad met 0,7x DNA parels als hierboven beschreven (zie stap 2). Elueren in 15 ul EB. Opmerking: Volume parels zal afhangen van het eindvolume van het zwembad.
- Analyseer zwembad 9. Bepaal molaire concentratie analyse geleidende gebied (150 tot 1000 bp) 9. Let op: Als alternatief kan qPCR worden gebruikt om de bibliotheek zwembad 10 / Sup>.
- Load sequencer op 22:00 bibliotheek concentratie tot 101 bp te genereren, gepaarde-end leest met dubbele barcode leest 11.
Figuur 3. Bibliotheken Opgebouwd uit Ebola virus klinische monsters. Gel beeld van 4 representatieve Ebola virus (EBOV) bibliotheken. Regio's van de bibliotheek en de primer dimeren worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Resultaten
De beschreven protocol kan de generatie van hoge kwaliteit sequencing leest van low-input viraal RNA-monsters, terwijl het verrijken van unieke virale content. Zoals getoond in figuur 1, het protocol verrijkte unieke Lassa virus inhouden ten minste vijf maal in alle monsters (in vergelijking met niet-verarmd controles) met ten minste één miljoen kopieën van 18S rRNA (~ 100 pg totaal RNA). Evenzo sequencing succes ook gecorreleerd met de hoeveelheid virus in een gegeven monster. Gebruik qRT-PCR als een surrogaat voor virale hoeveelheid monsters die welke ~ 1000 of meer virale genoom exemplaren meestal gemaakt volledig samenstellen (gegevens niet getoond). Bovendien, uitputting van poly (rA) carrier vermindert homopolymeer sequenties A en T bibliotheken, wat resulteert in schonere preparaten en een betere kwaliteit sequentiebepaling leest (figuur 2). Final bibliotheken van lage input virale klinische monsters hebben vaak een breed fragment lengte van 150 tot 1000 bp(Figuur 3).
Na sequencing, om te proeven verkeerde identificatie en overspraak tussen bibliotheken te verminderen binnen een pool 12, alleen index leest met een basis kwaliteit score van 25 (Q25) en zorgen voor zero mismatches worden gedurende het demultiplexen proces gehouden. Virale genomen worden geassembleerd met behulp van een bio pijpleiding specifiek voor uiteenlopende virussen 2,4-6. Deze tools zijn verkrijgbaar bij https://github.com/broadinstitute/viral-ngs of via commerciële cloud platforms 4.
| Stap 1.1: DNase reactie | |
| Reagens | Volume per reactie (pl) |
| 10x DNase buffer | 7 |
| Nuclease-vrij water | 6 |
| Gehaalde viraal RNA | 55 |
| DNase (2 U / & #181; l) | 2 |
| Totale volume | 70 |
| Stap 2.1: 5x hybridisatiebuffer | |
| Reagens | Volume van 1 ml (pl) |
| 5 M NaCl | 200 |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,4) | 500 |
| Nuclease-vrij water | 300 |
| Totale volume | 1000 |
| Stap 2.1: 10x RNase H reactiebuffer | |
| Reagens | Volume van 1 ml (pl) |
| 5 M NaCl | 200 |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,5) | 500 |
| 1 M MgCl2 | 200 |
| Nuclease-vrij water | 500 |
| Totale volume | 1000 |
| Stap 2.1: Water wie lineaire acrylamide | |
| Reagens | Volume van 1 ml buffer (pl) |
| Nuclease-vrij water | 992 |
| Lineaire acrylamide (5 mg / ml) | 8 |
| Totale volume | 1000 |
| Stap 2.2: hybridisatie reactie voor selectieve uitputting | |
| Reagens | Volume per reactie (pl) |
| 5x Hybridization Buffer | 2 |
| rRNA-uitputting oligo mix (100 uM) | 1.22 |
| Oligo (d) T (550 ng / ul) | 1 |
| DNase-behandelde totaal RNA | maximaal 5 |
| Spike in RNA (Dit is optioneel) | 0.5 |
| Water (met lineaire acrylamide) | brengen tot 10 totaal |
| Totaal Volume | 10 |
| Stap 2.3: RNase H reactie voor selectieve uitputting | |
| Reagens | Volume per reactie (pl) |
| 10x RNase H Reaction Buffer | 2 |
| Water (met lineaire acrylamide) | 5 |
| Thermostabiel RNase H (5 U / pl) | 3 |
| Totale volume | 10 |
| Stap 2.4: DNase reactie bericht selectieve uitputting | |
| Reagens | Volume per reactie (pl) |
| 10x DNase Buffer | 7.5 |
| Water (met lineaire acrylamide) | 44.5 |
| RNase inhibitor (20 U / pl) | 1 |
| RNase-vrij DNase I (2,72 U / pl) | 2 |
| Totaal volume (met RNase H reactie) | 75 |
| Stap 3.1: cDNA synthese primer willekeurige hybridisatie | |
| Reagens | Volume per reactie (pl) |
| rRNA /-carrier uitgeputte RNA | 10 |
| 3 pg willekeurige primer | 1 |
| Totale volume | 11 |
| Stap 3.2: Eerste streng cDNA synthesereactie | |
| Reagens | Volume (pl) |
| 5x First-Strand Reaction Buffer | 4 |
| 0,1 M DTT | 2 |
| 10 mM dNTP mix | 1 |
| RNase inhibitor (20 U / pl) | 1 |
| Reverse transcriptase (add laatste) | 1 |
| Totaal volume (met RNA hierboven) | 20 |
| Stap 3.3: Tweede streng cDNA synthesereactie | |
| Reagens | Volume (pl) |
| RNase-free water | 43 |
| 10x Tweede-Strand Reaction Buffer | 8 |
| 10 mM dNTP mix | 3 |
| E. coli DNA ligase (10 U / pl) | 1 |
| E. coli DNA polymerase I (10 U / pl) | 4 |
| E. coli RNase H (2 U / pl) | 1 |
| Totaal volume (met 1 st streng reactie) | 80 |
| Stap 4.2: Tagmentation reactie | |
| Reagens | Volume (pl) |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | 1 |
| Tagment DNA Buffer (TD) | 5 |
| Totaal volume (met cDNA) | 10 |
| Stap 4.3: Library PCR reactie | |
| Reagens | Volume (pl) |
| PCR Master Mix (NPM) | 7.5 |
| Index 1 primer (i7) | 2.5 |
| Index 2 primer (i5) | 2.5 |
| Totaal volume (met tagmented cDNA) | 25 |
| Stap 4.3.2: Library PCR-omstandigheden | |
| 72 ° C, 3 min | |
| 95 ° C, 30 sec | |
| tot 18 cycli-10 sec bij 95 ° C, 30 sec bij 55 ° C, 30 sec bij 72 ° C | |
| 72 ° C, 5 min | |
| 10 ° C, voor altijd | |
Tabel 1:. Reaction set-up en buffers stap-voor-stap tafels met inhoud van alle buffers en de reactie mixen.
Tabel 2: qRT-PCR Primers sequenties Primers gebruikt voor het meten van ontvangst (18S rRNA) en virale (Ebola en Lassa) -gehalte.. 'KGH' is Kenema regering ziekenhuis in Sierra Leone, waar de Ebola primers werden getest 2. 'Kulesh' is de onderzoeker die het ontwerp van de primer te stellen 14.
Tabel 3: ribosomaal RNA (rRNA) Uitputting Oligo 195 50-nucleotide lange sequenties die complementair zijn aan de menselijke rRNA voor selectieve depletie stap 6.. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| oligo Naam | Sequentie (5 'naar 3') |
| Ebola KGH FW | GTCGTTCCAACAATCGAGCG |
| Ebola KGH RV | CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT |
| Ebola kulesh FW | TCTGACATGGATTACCACAAGATC |
| Ebola kulesh RV | GGATGACTCTTTGCCGAACAATC |
| Lassa SL FW | GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC |
| Lassa SL RV | AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A |
| 18S rRNA FW | TCCTTTAACGAGGATCCATTGG |
| 18S rRNA RV | CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT |
Discussie
De geschetste aanpak maakt robuuste, universele, snelle sequencing en werd gebruikt voor het sequentiëren van Ebola-virus tijdens de 2014 uitbraak 2,4. Door het koppelen van selectieve uitputting en cDNA-synthese met tagmentation bibliotheek bouw, werd het totale proces tijd verminderd met ~ 2 dagen na de vorige adapter ligatie methoden. Meer recent werd dit protocol in dienst van internationale medewerkers en anderen met groot succes 15,16 en zal worden ingezet om labs in West-Afrika aan de lokale richt op innovatief gentechnologisch onderzoeken en diagnostiek 17 te ondersteunen.
De hier beschreven protocol gebruikt willekeurige primers voor cDNA bereiden viraal RNA-seq bibliotheken. In tegenstelling tot eerdere viraal RNA-seq benaderingen, het vereist geen voorkennis van sequentiegegevens of ingewikkelde en tijdrovende primer ontwerp voor een bepaald virus of clade. De werkwijze kan worden toegepast op elk viraal RNA-monster. Zo werd het gebruikt om virale content van beide Ebola genererenen Lassa monsters 6. Het protocol kan ook worden gebruikt voor host transcriptomics, metagenomic en pathogeen ontdekking sequencing projecten 1.
Een kritische stap van het protocol is gericht RNase H spijsvertering, een high-throughput, goedkope manier voor het verwijderen van ongewenste vervoerder en gastheer RNA van virale monsters. De selectieve uitputting stap van het protocol maakt gebruik van een groot aantal componenten en vereist vaardigheid en nauwkeurigheid. Extra tijd en zorg moeten worden genomen tijdens de eerste installatie.
Aangezien de meeste klinische serum- en plasmamonsters vaak weinig nucleïnezuurmateriaal, vervuiling en schade monster zijn gebruikelijk. Om deze problemen te voorkomen, moet speciale zorg worden genomen bij het gebruik van dit protocol. Ten eerste RNA is zeer gevoelig voor afbraak; daarom alle gebieden moeten schoon en vrij van nucleasen zijn. Anderzijds monsters geschikt voor gebruik in dit protocol geïdentificeerd dient qRT-PCR assays voor zowel gastheer RNA en virus worden gebruikt voor kwantificering 5,6 . Bij het vergelijken van ingang bedraagt met sequencing resultaten van het protocol, sequencing succes (dat wil zeggen, het genereren van voldoende gegevens voor een volledige virale montage) gecorreleerd met monsters die ten minste 100 pg totaal RNA en 1.000 exemplaren van het virus bevatte. Ten derde, verhoogde blootstelling aan bronnen van nucleïnezuren moeten worden vermeden. De hier geschetste protocol wordt gedaan in een bioveiligheid kast voor veiligheidsmaatregelen en voor het beperken van milieuverontreinigende stoffen. Bovendien, onze groep en anderen hebben gemerkt dat commerciële enzymen een andere bron van verontreinigende bacteriële nucleïnezuren in lage input monsters 6,18 kan zijn. Het gebruik van een schone werkplek (bijvoorbeeld PCR kap, bioveiligheid kast) en negatieve controles (bijvoorbeeld water of buffer) zal helpen verlichten en besmetting te volgen, respectievelijk. Voor monsters met <100 pg totaal RNA, enkel poly (rA) carrier RNA, rRNA niet moet worden uitgeput naar hoge kwaliteit sequencing resultaten maar beperkt materiaalverlies. voor zeerlage ingangsmonsters kan cDNA-amplificatie methoden geschikter 19, alhoewel poly (rA) vervoerder voor de cDNA-synthese moet worden verwijderd.
De uitputting van gastheer rRNA verrijkt virale inhoud sequencing bibliotheken en is toepasbaar op verschillende monsterverzamelingen zoals serum of plasma, en meerdere soorten weefsels van knaagdieren en primaten 5,6. In niet-humane organismen, leest uitgelijnd tegen 28S rRNA overbleven na uitputting, hetgeen suggereert 28S rRNA minder geconserveerd tussen mens en andere diersoorten 6,20. Bij gebruik van deze methode met niet-humane isolaten, kan het nodig zijn om te vullen met DNA-oligo's complementair aan de uiteenlopende rRNA sequenties van de specifieke gastheer 3,21.
Aangezien het protocol is onbevooroordeeld, viraal leest kan slechts een klein deel van de totale inhoud bibliotheek vertegenwoordigen. Hoewel rRNA de meest voorkomende soort van gastheer RNA en slechts een klein percentage van rRNA leest (0, 1%) volgen op selectieve depletie, zullen alle andere gastheer RNA (bijvoorbeeld mRNA) na uitputting blijven en kan verantwoordelijk zijn voor vele sequentiebepaling leest van het monster. Daarom "oversampling" (dwz oversequencing) afzonderlijke libraries nodig om voldoende dekking voor virale assemblage en variant oproepen. Voor onze studies, proberen we opeenvolging ~ 20 miljoen leest per monster voldoende diepte voor de analyse van virale genoom en de bijbehorende varianten evenals metagenomic inhoud van 2,5 te hebben. Voor metagenomic en pathogeen ontdekking studies, is het belangrijk op te merken dat verontreinigend gastheer DNA wordt verwijderd door digestie met DNase. Daarom virussen en andere pathogenen die DNA-genomen bevatten mogelijk verloren tijdens het proces echter RNA tussenproducten kunnen nog worden gesequenced.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd met federale middelen van de National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (Nr.: DP2OD06514) (PCS) en van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, in het kader van contracten (Nr: HHSN272200900018C, HHSN272200900049C en U19AI110818).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
| Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml fles |
| TURBO DNase | Ambion | AM2238 | na RNA extractiestap, 2 U/µl, buffer inbegrepen |
| PCR cycler | elke PCR cycler | ||
| Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads voor RNA opruiming |
| Real Time qPCR systeem | elke systeem | ||
| DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
| 70% Ethanol | vers vers bereiden | ||
| qRT-PCR primers | IDT DNA | zie Tabel 2 | |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9760G | |
| 1 M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Lineair acrylamide | Ambion | AM9520 | |
| DNA oligos die het hele rRNA-gebied bedekken | IDT DNA | zie Tabel 3, bestel klaar voor laboratoriumgebruik bij 100 µM | |
| Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt lang, ontzilt | |
| Hybridase Thermostabiele RNase H | Epicentre | H39100 | |
| RNase-vrij DNase Kit | Qiagen | 79254 | na selectieve aftastingsstap |
| SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
| Willekeurige primers | Invitrogen | 48190-011 | voornamelijk hexamers |
| 10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | met first-strand buffer, DTT |
| Luchtincubator | elke luchtincubator cycler | ||
| NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-vrij) Reactiebuffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
| E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
| E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
| E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
| 0.5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
| Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads voor DNA opruiming |
| Elutie Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
| High Sensitivity D1000 reagentia | Agilent | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
| High Sensitivity DNA reagentia | Agilent | 5067-4626 | |
| Library Quantification Complete kit (Universeel) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternatief voor tapestation, bioanalyzer voor bibliotheekkwantificering |
Referenties
- Stremlau, M. H., et al. Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa. PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631(2015).
- Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345, 1369-1372 (2014).
- Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue. PLoS One. 7, e42882(2012).
- Park, D. J., et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone. Cell. 161, 1516-1526 (2015).
- Andersen, K. G., et al. Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus. Cell. 162, 738-750 (2015).
- Matranga, C. B., et al. Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples. Genome Biol. 15, 519(2014).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Jiang, L., et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).
- Agilennt Technologies. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf. (2015).
- Kapa Biosystems. , Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2015).
- Illumina Technologies. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf. (2015).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 40, 3(2012).
- Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Hu, Y., et al. Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing. Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713(2015).
- Simon-Loriere, E., et al. Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic. Nature. 524, 102-104 (2015).
- Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. Empowering African genomics for infectious disease control. Genome Biol. 15, 515(2014).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, 19(2011).
- Malboeuf, C. M., et al. Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification. Nucleic Acids Res. 41, 13(2013).
- Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny. Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nat Methods. 10, 623-629 (2013).
Herprints en machtigingen
