Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Samenvatting

Gerichte mutagenese wordt al lang gebruikt als een methode om eiwitstructuur, functie en evolutie te onderzoeken. Recente vooruitgang in massaal parallelle sequencingtechnologie heeft de mogelijkheid geopend om de functionele of fitnesseffecten van grote aantallen mutaties gelijktijdig te beoordelen. Hier presenteren we een protocol voor het experimenteel bepalen van de effecten van alle mogelijke enkele aminozuurmutaties in een eiwit van belang door gebruik te maken van hoogdoorvoer sequencingtechnologie, met behulp van het 263 aminozuur antibioticaresistentie-enzym TEM-1 β-lactamase als voorbeeld. In deze aanpak wordt een volledige-eiwit verzadigingsmutagenesebibliotheek geconstrueerd door middel van gerichte mutagene PCR, waarbij elke positie afzonderlijk wordt gerandomiseerd naar alle mogelijke aminozuren. De bibliotheek wordt vervolgens getransformeerd in bacteriën en geselecteerd op het vermogen om resistentie tegen β-lactam antibiotica te verlenen. Het fitnesseffect van elke mutatie wordt vervolgens bepaald door middel van diep sequencing van de bibliotheek voor en na selectie. Belangrijk is dat dit protocol methoden introduceert die de sequencing-leesdiepte maximaliseren en de gelijktijdige selectie van de volledige mutatiebibliotheek mogelijk maken, door aangrenzende posities te mengen in groepen van lengte die worden geaccepteerd door de hoogdoorvoer sequencingleeslengte en orthogonale primers te gebruiken om elke groep te barcoden. Representatieve resultaten met behulp van dit protocol worden geleverd door de fitnesseffecten van alle enkele aminozuurmutaties in TEM-1 te beoordelen bij een klinisch relevante dosis van ampicilline. De methode zou gemakkelijk uitbreidbaar moeten zijn naar andere eiwitten waarvoor een hoogdoorvoer selectie-assay beschikbaar is.

Inleiding

Mutagenese al lang toegepast in het laboratorium om de eigenschappen van biologische systemen en hun evolutie en mutante eiwitten of organismen produceren met verbeterde of nieuwe functies. Terwijl vroege benaderingen gebruikt methoden die willekeurige mutaties in organismen produceren, de komst van recombinant DNA-technologie konden de onderzoekers selecteren veranderingen aan DNA in een plaatsspecifieke wijze, bijv. Plaatsgerichte mutagenese ^1,2 voeren. Met de huidige technieken, meestal met behulp van mutagene oligonucleotiden in een polymerase kettingreactie (PCR), is het relatief gemakkelijk om kleine aantallen mutaties (bijv., Puntmutaties) in een bepaald gen ^3,4 creëren en te beoordelen. Het is echter veel moeilijker, wanneer het doel nadert, bijvoorbeeld de creatie en evaluatie van alle mogelijke single-site (of hogere orde) mutaties.

Er is al veel geleerd van vroege studies proberen om grote aantallen m beoordelenutations in genen, de toegepaste methoden waren vaak moeizaam, bijvoorbeeld waarbij de beoordeling van elke mutatie afzonderlijk gebruikt nonsense suppressor stammen ^5-7, of werden de kwantitatieve vermogen beperkt vanwege de geringe diepte van Sanger sequentiebepaling sequentiebepaling ^8. De technieken die in deze studies zijn grotendeels verdrongen door werkwijzen die gebruik maken high-throughput sequencing technologie ^9-12. Deze conceptueel eenvoudige benaderingen behelzen het creëren van een bibliotheek omvattende een groot aantal mutaties, het onderwerpen van de bibliotheek om een scherm of selectie voor de functie, en diep-sequencing (bijv. In de orde van> 10 ⁶ sequencing gelezen) de bibliotheek verkregen voor en na selectie. Zo de fenotypische of geschiktheid effecten van een groot aantal mutaties, weergegeven als de verandering in de frequentie bevolking van elke mutant, gelijktijdig en kwantitatief worden beoordeeld.

We hebben eerder introduceerde een simp(. dwz gehele eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheken) le benadering voor het keuren bibliotheken van alle mogelijke enkele aminozuur mutaties in proteïnen, van toepassing op genen met een lengte langer dan de sequentiebepaling leest lengte ^11,13: Ten eerste, elke aminozuurpositie gerandomiseerd door plaatsgerichte mutagene PCR. Tijdens dit proces wordt het gen verdeeld in groepen bestaande uit aaneengesloten posities met een totale lengte opgevangen door het platform sequencing. De mutagene PCR-producten voor elke groep worden vervolgens gecombineerd en elke groep onafhankelijk onderworpen aan selectie en high-throughput sequencing. Door een overeenkomst tussen de locatie mutaties in de sequentie en de sequentie gelezen lengte, deze benadering het voordeel van het maximaliseren sequencing diepte: terwijl men eenvoudig kan sequencen dergelijke bibliotheken in korte vensters zonder opsplitsing in groepen (bijvoorbeeld door een standaard geweer. sequencing aanpak), de meeste leest verkregen zouden wild-type en dus de m bedragenajority sequencing throughput verloren (bijvoorbeeld voor een gehele eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheek van een 500 aminozuur proteïne gesequenced 100 aminozuren (300 bp) glas ten minste 80% van leest de wild-type sequentie).

Hier wordt een protocol voorgelegd die high-throughput sequentiebepaling gebruikt voor de functionele beoordeling van gehele eiwitten verzadigingsmutagenese bibliotheken met behulp van voornoemde benadering (geschetst in figuur 1). Belangrijker introduceren we het gebruik van orthogonale primers in de bibliotheek kloonproces elke reeksgroep, waardoor ze te multiplexen in een bibliotheek, gelijktijdig onderworpen aan screening of selectie barcode, en vervolgens de-gemultiplext voor diepe sequencing. Aangezien de sequentie groepen niet afzonderlijk worden onderworpen aan selectie, vermindert de werkdruk en zorgt ervoor dat elke mutatie ervaart hetzelfde selectie. TEM-1 β-lactamase, een enzym dat een hoge resistentie verleent tegenβ-lactam antibiotica (bv. ampicilline) in bacteriën wordt gebruikt als modelsysteem ^14-16. Een protocol is beschreven voor de beoordeling van een geheel eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheek van TEM-1 in E. coli onder selectiedruk bij een benaderde serumniveau een klinische dosis van ampicilline (50 ug / ml) ^17,18.

Protocol

Let op: Zie figuur 1 voor het overzicht van het protocol. Verschillende stappen en reagentia in het protocol vereist veiligheidsmaatregelen (aangeduid met "LET OP"). Raadpleeg veiligheidsinformatiebladen voor gebruik. Alle protocol stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.

1. Bereid Cultuur Media en Plates

1. Bereiden en steriliseer autoclaveren 1 L gezuiverd water, 100 ml Super Optimale Broth (SOB; Tabel 1), 1 L Luria-Bertani bouillon (LB; Tabel 2) en 1 L LB-agar (Tabel 3). Bereid afzonderlijk en steriliseer drie cultuur kolven die elk 1 L LB.
   Let op: Het gehele protocol "water" verwijst naar autoclaaf gesteriliseerd gezuiverd water; SOB, LB en LB-agar verwijzen naar de autoclaaf gesteriliseerde oplossingen.
2. Bereid een 12 mg / ml voorraad Tet door het oplossen van 0,12 g tetracycline hydrochloride in 10 ml 70% ethanol. Steriliseren onder toepassing van een 0,2 urn filter en opslagbij 4 ° C beschermd tegen licht.
3. Koel LB-agar met 50 ° C en voeg 1 ml Tet voorraad (eindconcentratie van 12 ug / ml Tet). Giet in petri platen en koele bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht.

2. De bouw van de Whole-gen verzadigingsmutagenese Bibliotheek

Opmerking: Primers; Afgerond PCR's, beperking verteert en ligaties; en gezuiverde DNA-monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.

1. Het ontwerpen van mutagenese primers
   1. Aan elke aminozuurpositie alle mogelijke aminozuren mutageniseren, ontwerp een paar complementaire mutagenese primers (sense / antisense voorwaartse en / achteruit) voor elke aminozuurpositie de volgende richtlijnen:
      1. Vervang het codon dat overeenkomt met de aminozuur te mutageniseren door NNS (waarbij N een mengsel van alle vier nucleotidebasen en S is een mengsel van cytosine (C) en guanine (G)) en het centrum in de primer, geflankeerd door ongeveer 15 nucleotiden aan elke kant.
      2. Controleer of de 5 'en 3' uiteinden eindigen in C of G en de smelttemperatuur _(Tm) ongeveer 70 ° C ^3. Gebruik de rekenkundige script NNS_PrimerDesign.m (Zie Aanvullende Code File) naar NNS mutagenese primers ontwerpen op basis van deze richtlijnen.
   2. Bestel primers van een commerciële bron. Voor het gebruiksgemak, hebben ze gesynthetiseerd in 96-well plaat formaat en vooraf verdund in water tot 50 uM, met één set platen met de sense primers en mutagenese andere de antisense primers.
   3. Vul een pipet bassin met water en gebruik een multichannel pipet 95 ul brengen naar 263 putjes drie 96-well platen. Verdun de primers 20-voudig tot 2,5 uM via een multichannel pipet 5 ul brengen van de 96-well platen bevattende de sense mutagenese primers de verwante putjes van de platen met water.
   4. Herhalingprotocol stap 2.1.3 om de antisense mutagenese primers verdunnen.
2. Synthese van NNS subbibliotheken voor elke aminozuurpositie van tweestaps PCR plaatsgerichte mutagenese
   1. Voer de eerste ronde mutageen PCR's. Voor elke mutagenese primer, bereiden een 25 pi PCR-reactie met behulp van pBR322_AvrII plasmide als template en primers AatII_F of AvrII_R (sense mutagenese primers in combinatie met primer AvrII_R en antisense mutagenese primers gecombineerd met primer AatII_F, in totaal 526 PCR). Zie tabel van materialen voor AatII_F en AvrII_R sequenties.
      1. Bereid een PCR "master mix" door toevoeging van de reagentia uit tabel 4 tot een 15 ml conische buis. Over te dragen aan een pipet bekken. Gebruik een multichannel pipet tot 15 pl transfer naar 263 wells over drie 96-well PCR-platen. Gebruik een multichannel pipet 10 pi te brengen van de 96-well platen met de verdunde zin mutagenese primers voor de verwante putjes in de PCR-platen.
      2. Bedek elk PCR-plaat met 96 putjes seal. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 minuten.
      3. Breng de PCR-platen te thermocycler en start het volgende programma: 98 ° C gedurende 30 seconden; 20 cycli: 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 2 min; houden op 4 ° C.
      4. Herhaal stap protocol 2.2.1.1 - 2.2.1.3 voor de 96-well platen met de verdunde antisense mutagenese primers.
   2. Voer de tweede-ronde-mutageen PCR's. Voor elk aminozuur positie, bereiden een 25 pi PCR-reactie met behulp van primers AatII_F en AvrII_R, en de gemengde en verdund eerste ronde mutagene PCR-producten als een template (in totaal 263 PCR).
      1. Vul een pipet bassin met water en gebruik een multichannel pipet om 198 ul brengen naar 263 putjes drie 96-well platen.
      2. Combineer en verdun 100-voudig de mutagene PCR-producten voor elk aminozuur positie met behulp van een multichannel pipet omeerste overdracht 1 pl van de 96-well platen met PCR het PCR producten verkregen door mutagenese sense primers de verwante putjes van de platen met water. Herhaal vervolgens de overgang voor de PCR-producten als gevolg van de antisense mutagenese primers.
      3. Bereid een PCR "master mix" door toevoeging van de reagentia uit tabel 5 naar een 15 ml conische buis. Over te dragen aan een pipet bekken. Gebruik een multichannel pipet tot 24 pl transfer naar 263 wells over drie 96-well PCR-platen. Gebruik een multichannel pipet 1 pi brengen van de 96-well platen die de gemengde en verdund eerste ronde mutagene PCR producten om de verwante putten in de PCR-platen.
      4. Bedek elk PCR-plaat met 96 putjes seal. Centrifugeer bij ongeveer 200 xg gedurende 2 minuten. Transfer platen thermocycler en start het hetzelfde programma als in protocol stap 2.2.1.3.
   3. Analyseer resultaten van de tweede ronde mutageen PCR's door gelelektroforese.Zorg ervoor dat alle producten zijn van de juiste maat en afwezigheid van vervuilende producten.
      1. Voeg 2 ml van 2 x gel laadkleurstof een pipet bassin en vervolgens een multichannel pipet om 6 pl brengen naar 263 putjes drie 96-well platen. Gebruik een meerkanaalspipet overdragen 6 ui van de 96-well PCR-platen met de tweede ronde mutagene PCR producten om de verwante putjes van de 96-well platen bevattende kleurstof.
      2. Bereid een 1,5% agarosegel met 0,2 ug / ml ethidiumbromide (NB).
      3. Load DNA ladder in de eerste en laatste lanen van elke rij. Maak dan gebruik van een multichannel pipet tot 10 pl van de monsters te laden van protocol stap 2.2.3.1.
      4. Voer de elektroforese bij 100 V gedurende 40 minuten en het op een UV transilluminator.
      5. Herhaal protocol stappen 2.2.3.2 - 2.2.3.4 totdat alle monsters worden geanalyseerd.
   4. Nauwkeurig de concentratie van elk NNS subbibliotheek PCR product op een dsDNA kwantificering reagens.
      1. Overdrachtongeveer 15 ml buffer EB een pipet bassin. Gebruik een multichannel pipet tot 49 pl transfer naar 263 wells over drie 96-well black-walled, heldere bodem assay platen.
      2. Gebruik een multichannel pipet 1 pi van elke tweede stap PCR-product (protocol stap 2.2.2) over te dragen aan de verwante putjes van de 96-well assay platen.
      3. Bereid een DNA-concentratie standaardcurve door verdunning van lambda faag DNA 2 ng / ul in 300 ul buffer EB en dan 1002-voudige verdunningen (van totaal 11 concentraties). Breng 50 pl tot eerste elf kolommen van een rij van een van de 96-well testplaten uit de vorige stap waarin geen monster bevat; tot de twaalfde kolom voeg 50 ul buffer EB (blanco).
      4. Bereid dsDNA kwantificering reagens door het toevoegen van 75 pi reagens (zie tabel van Materialen) aan een 15 ml conische buis, voeg dan 15 ml EB buffer. Meng door de buis en vervolgens over te dragen aan een pipet bekken. Bescherm reagens tegen licht.
      5. Gebruik een multichannel pipet 50 pi bereid dsDNA kwantificatie reagensoverdracht aan elk putje van de assay platen. Meng door pipetteren up-and-down. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten beschermd tegen licht.
      6. Meten fluorescentie van elk monster met behulp van een microplaat reader en standaard fluoresceïne golflengte (excitatie 485 nm, emissie 520 nm; 0,1 sec).
      7. Trek de fluorescentie waarde van de blanco van alle monsters. Genereren van een standaardcurve van de fluorescentiemetingen lambda faagmonsters. Bereken de concentratie van elk monster met behulp van hun respectievelijke fluorescentiemetingen en de standaardcurve.
3. Klonen van NNS sub-bibliotheken in selectie vectoren
   1. Meng 100 ng van elk NNS sub-bibliotheek PCR-product in vijf NNS sub-bibliotheek groepen. Na instructies van de fabrikant, het schoonmaken van monsters met behulp van een DNA-zuivering kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA kwantificatie reagens.
      Opmerking: Elke groep bestaat uit ongeveer 53 contigue aminozuren posities afstand langs het TEM-1 sequentie (NNS subbibliotheek groepen 1-5 omvatten posities 26-78, 79-132, 133-183, 184-236, en 237-290, respectievelijk nummering volgens Ambler et al ^19)..
   2. Maak kloneringsvectoren voor elk NNS sub-bibliotheek groep.
      1. Bereid vijf 100 ul PCR volgens tabel 6, met gebruik van primers en AvrII_F AatII_OP1_R - AatII_OP5_R en plasmiden pBR322_OP1-5 als matrijs (AatII_OP1_R gekoppeld pBR322_OP1, etc.).
      2. Transfer naar thermocycler en start het volgende programma: 98 ° C gedurende 30 seconden; 25 cycli: 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 1,5 min; 72 ° C gedurende 2 min; houden op 4 ° C. Zie T staat van Materialen voor sequenties van AatII_R en AvrII_F.
      3. Bereid een 1% agarosegel met 0,2 ug / ml ethidiumbromide (NB).
      4. Voeg 20 ul van 6x gel laadkleurstof elke PCR monster. Laad de eerste baan van de gel met DNA ladder; laden gehele volume van elk monster, het overslaan van ten minste ook een tussen de monsters.
      5. Run gel bij 100 V gedurende 50 min.
      6. Visualiseer gel met behulp van een lange golflengte UV-verlichting (LET). Accijnzen schijfjes met het PCR-product bij ~ 3500 bp; overbrengen naar microfugebuizen scheiden. Gelstukjes kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
      7. Volgens de instructies van de fabrikant, zuiveren monsters met behulp van een gel extractie kit en meet de concentratie dsDNA met een kwantificering reagens.
   3. Voor zowel de NNS subbibliotheek groepen (protocol stap 2.3.1) en kloneringsvectoren (protocol stap 2.3.2) ingestelde restrictiedigesten met AatII en AvrII enzymen volgens T abel 7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na instructies van de fabrikant, het schoonmaken van monsters met behulp van een DNA-zuivering kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA Quantitatie reagens.
   4. Opgericht ligatiereacties volgende Tabel 8 voor elk restrictie-gedigereerd NNS subbibliotheek groep cognate restrictie-gedigereerde kloneringsvector (NNS subbibliotheek groep 1 met pBR322_OP1, etc.). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Opruimen reacties met een DNA-zuivering kit volgens instructies van de fabrikant; elueer DNA met 20 pl water.
   5. Transformatie het geheel van de gezuiverde ligatiereacties in bibliotheek efficiënte E. coli-cellen door elektroporatie.
      1. Dooi elektrocompetente E. coli-cellen en vervolgens plaats cellen en gezuiverd ligatiereacties op ijs.
      2. Breng 10 pl ontdooide cellen elk gezuiverd ligatiereactie en breng elektroporatie cuvet. Electroporate 1,8 kV.
      3. Recover cellen door resuspenderen in 1 ml SOB. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
      4. Resuspendeer 10 pi van elke herstel cultuur in 990 pi LB; 100 pl uitgespreid op LB-agarplaten containing 12 ug / ml Tet. Incubeer de platen O / N (= 16 uur) bij 37 ° C.
      5. Voor elk herstel cultuur, bereiden een 250 ml kolf met 50 ml LB en 50 pi Tet voorraad. Transfer naar het resterende ~ 1 ml van herstel cultuur kolf. Incubeer O / N (= 16 uur) bij 37 ° C onder krachtig schudden (-200 rpm).
   6. Tel het aantal kolonies op elke plaat. Bereken het aantal succesvolle transformanten als waar is het aantal kolonies, is het herstel cultuur volume (1000 pl) en is het volume van het herstel cultuur vergulde (1 pl).
      Opmerking: Om volledige dekking van alle mutaties te verzekeren, als vuistregel het aantal succesvolle transformanten moet ≥100-vouw over het aantal verwachte mutaties. NNS elke sub-bibliotheek ~ 53 posities, zodat het verwachte aantal mutaties posities 53 × 32 codons / positie ≈ 1,7 x 10 ^3; een bibliotheek maat geven ≥100-voudig (≥1.7 x 10 ⁵⁾ moet er ≥170 kolonies op elke plaat.
   7. Volgens de instructies van de fabrikant, geïsoleerd plasmide-DNA uit kweken met behulp van een plasmide zuivering kit en concentraties te meten met behulp van een dsDNA kwantificering reagens. Meng 100 ng van elk plasmide. Hierdoor ontstaat de uiteindelijke gehele eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheek.

3. Selectie van de TEM-1 Whole-eiwit verzadigingsmutagenese Library voor resistentie tegen antibiotica

1. Bereiding van de voorselectie cultuur.
   1. Verdun het plasmide uit stap 2.3.7 protocol tot 0,5 ng / ul in water en breng 20 pl van een microcentrifugebuis. Voer transformatie, rehersteltools, plateren en O / N groei zoals eerder beschreven in stap protocol 2.3.5, behalve overdracht 1 pl van de SOB herstel cultuur aan 999 gl LB.
   2. Tel het aantal kolonies. Om volledige dekking van alle mutaties te waarborgen moeten er ≥100 kolonies, met vermelding van ≥10 ⁶ succesvolle transformanten (100 × 263 × 32 posities codons / positie ≈ 10 ^6).
   3. Meet de concentratie van de 50 ml O / N kweek.
      1. Bereid een LB leeg door toevoeging van 1 ml LB een spectrofotometer cuvette. OD600 gemeten op een spectrofotometer.
      2. Verdun de O / N kweek 10-voudig door resuspenderen 100 pi in 900 ul LB. Meet de OD600. Trek de OD600 lezing van de blanco en vermenigvuldig met 10 tot de OD600 van de O / N cultuur.
   4. Pre-warm de drie kolven van protocol stap 1.1 voor ~ 30 minuten bij 37 ° C. Verdun de O / N kweek tot OD600 = 0,1 en voeg 1 ml tot één fles (uiteindelijke OD600 = 0,001). Thij is de "pre-selectie cultuur".
   5. Incubeer de "voorselectie cultuur 'bij 37 ° C onder heftig schudden (200 rpm). Periodiek controleren groei door het meten van OD600 volgens protocol stap 3.1.3 (het is niet nodig om de cultuur 10-voudig verdund) tot OD600 = 0,1 (-2,5 uren).
   6. Breng 100 ml van de pre-selectie kweek twee 50 ml conische buizen. Centrifugeer bij 4000 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Verwijder het grootste deel van supernatant en combineren in één 15 conische buis. Herhaal het centrifugeren en verwijder alle supernatant. Bewaar bij -20 ° C.
2. Selectie op ampicillineresistentie.
   1. Terwijl de pre-selectie cultuur incubatie, bereiden een 50 mg / ml voorraad van Amp in het water door het oplossen van 0,5 g natrium ampicilline in 10 ml water. Steriliseren met een 0,2 pm filter en bewaar bij 4 ° C.
   2. De andere twee flessen, Tet voegen tot een eindconcentratie van 12 ug / ml en een volume van de voorselectie cultuur: tha t de uiteindelijke OD600 = 0,001. Een kolf, voeg 1 ml Amp, voor een eindconcentratie van 50 ug / ml - dit is de "selectie cultuur".
   3. Incubeer de kweken bij 37 ° C onder heftig schudden (200 rpm). Monitor groei van de kweek waarvoor geen ampicilline is in de vorige stap toegevoegd, totdat OD600 = 0,1 (-2,5 uren). Op dit moment, ook het meten van de OD600 van de cultuur selectie.
   4. Verdeel de OD600 van de selectie cultuur in 0,1 en vermenigvuldig met 100 ml. Breng de volume (~ 400 ml) aan 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 4000 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Verwijder het grootste deel van supernatant en combineren in één 15 conische buis. Herhaal het centrifugeren en verwijder alle supernatant.
   5. Volgens de instructies van de fabrikant, isoleren plasmide-DNA uit de pre-selectie (protocol stap 3.1.6) en selectie (protocol stap 3.2.4) cultuur celpellets en vervolgens concentraties te meten met behulp van een dsDNA kwantificering reagens.

TLE "> 4. High-throughput sequencing om de Fitness Effecten van mutaties Bepaal

1. Monstervoorbereiding voor high-throughput sequentiebepaling
   1. Bereid 25 pi PCR's om de-multiplexen van de NNS sub-bibliotheek groepen met orthogonale primers
      1. Bereid een PCR master mix volgens tabel 9; overdracht 23 ul tien PCR buizen.
      2. Voeg 1 pl 0,5 ng / ul gezuiverd plasmide DNA uit de voorselectie cultuur tubes 1 PCR - 5 en de selectie cultuur buizen 6-10.
      3. Meng 50 ul van 50 uM voorwaarts orthogonale primers OP1_F - OP5_F met de betreffende omgekeerde orthogonale primers OP1_R - OP5_R. In dezelfde volgorde, de overdracht 1 ui tot PCR-buisjes 1-5 en 6 - 10. Zie tabel van materialen voor sequenties van OP1_F - OP5_F en OP1_R - OP5_R.
      4. Transfer PCR buizen thermocycler. Het volgende programma: 98 ° C gedurende 30 seconden; 20 cycli: 98 ° C gedurende 10 sec, 55 °; C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 1,5 min; 72 ° C gedurende 2 min; houden op 4 ° C.
   2. Bereid 25 pi PCR om alle NNS subbibliotheek groepen isoleren
      1. Verdun 100 maal de tien PCR's van protocol stap 4.1.1.4 door de overdracht van 1 pi van elke PCR-buizen te scheiden en het toevoegen van 99 ul van water. Mix, dan pipet uit 99 ul en gooi ze weg.
      2. Meng 50 pi 50 pM forward primers Group1_F - Group5_F met de betreffende omgekeerde primers Group1_R - Group5_R. In dezelfde volgorde, de overdracht 1 ui buizen PCR 1 - 5 en 6 - 10. Zie tabel van materialen voor sequenties van Group1_F - Group5_F en Group1_R - Group5_R.
      3. Bereid een PCR master mix volgens tabel 9, overdracht 23 ul aan elke PCR-buis. Transfer PCR buizen thermocycler; lopen hetzelfde programma als in protocol stap 2.2.1.3.
   3. Voer de laatste 25 ul PCR's te indexeren sequenties toe te voegen
      1. diluit 100 maal de tien PCR's van protocol stap 4.1.2.3 door de overdracht van 1 pi van elke PCR-buizen te scheiden en het toevoegen van 99 ul van water. Mix, dan pipet uit 99 ul en gooi ze weg.
      2. Bereid een PCR master mix volgens tabel 9, overdracht 23 ul aan elke PCR-buis.
      3. Voor buizen met template afkomstig van NNS sub-bibliotheek groepen 1-5, overdracht 0,5 ul per buis forward primers 501_F - respectievelijk 505_F. Voor buizen met template die voortvloeien uit de pre-selectie en de selectie culturen, overdracht 0,5 ul per buis reverse primers 701_R en 702_R, respectievelijk. Zie tabel van materialen voor sequenties van 501_F - 505_F en 701_R en 702_R.
      4. Transfer PCR buizen naar de thermocycler en voer het programma uit stap 2.2.1.3.
   4. Mix en zuiveren samples
      1. Maatregel door gebruikmaking van een dsDNA kwantificatie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Meng 100 ng van elk PCR-product intoa enkele microcentrifugebuis.
      2. Bereid een 2% agarosegel met 0,2 ug / ml ethidiumbromide (NB).
      3. Voeg 6x gel laden kleurstof aan de gemengde PCR-producten monster. Laad de eerste baan van de gel met DNA ladder; laden gehele volume van het monster.
      4. Run gel bij 100 V gedurende 50 min. Visualiseer gel met behulp van een lange golflengte UV-verlichting (LET). Accijnzen slice met de PCR-product bij ~ 360 bp; overbrengen naar microcentrifuge buis. Gelplakje kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
      5. Na instructies van de fabrikant, zuiveren monster met behulp van een gel extractie kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA kwantificering reagens. Dit is het eindmonster voor high-throughput sequencing.
   5. Volgorde op een high-throughput sequencing platform (zie tabel van Materialen voor platform gebruikt in dit protocol).
      1. Bereken sample-concentratie in nM als , Waarbij de concentratie van het monster in ng / pl en de sequentie lengte van het monster DNA (~ 360 bp). Verdun monster tot 4 nM in EB buffer.
      2. Volg de instructies van de fabrikant om het monster te denatureren en verdun tot 21:00 in hybridisatiebuffer.
      3. Belasting 600 ui monster in cartridge reagens. Sequence volgende instructies van de fabrikant en de on-screen prompts.
2. Analyse van de sequentiegegevens
   1. Download Flash (Fast Lengte aanpassing van de Short gelezen) ^20, te plaatsen in de map samen met fastq.gz bestanden verkregen uit sequencing.
   2. Gebruik Flash te treden tot de fastq.gz bestanden die overeenkomen met de gepaarde-end leest voor elk paar van indices (vooruit en achteruit leest voor elke NNS sub-bibliotheek groep voor de pre-selectie en culturen).
      1. Open een opdrachtprompt en change directory naar map in protocol stap 4.2.1. Word lid van elk paar leest met de opdracht: flash , waarbij mates1.fastq.gz en mates2.fastq.gz zijn de bestanden met de voorwaartse en achterwaartse leest, respectievelijk.
   3. Na de toetreding tot elk paar leest, plaatst u het out.extendedFrags.fastq output file in aparte mappen voor de resultaten van de pre-selectie of selectie culturen. Naam van het out.extendedFrags.fastq uitvoerbestand volgens de NNS subbibliotheek waartoe deze overeenkomt (bijv., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
   4. Voer het computationele script NNS_DataAnalyzer.m (Zie Aanvullende Code File) van elke map naar de tellingen voor elk enkel aminozuur mutatie, en de graven te berekenen voor het wild-type, voor elke NNS sub-bibliotheek groep.
   5. Bereken de fitness effect elke mutatie op elke positie als basis tien logaritme van de verhouding tussen de tellingen verkregen in de selectie ( ) Ten opzichte van de pre-selectie ( ) Staat ten opzichte van de wild-type:
      .

Resultaten

De plasmide kaart van de vijf gemodificeerde pBR322 plasmiden die orthogonaal priming site (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) wordt getoond in Figuur 2A. Om te testen of de orthogonale primers specifiek zijn, PCRs werden uitgevoerd met elk paar orthogonaal primers afzonderlijk, samen met alle vijf pBR322_OP1-5 plasmiden of met alle plasmiden minus het plasmide overeenkomt met de orthogonale primerpaar. Het juiste product werd alleen verkregen wanneer het overeenkomende plasmide w...

Discussie

Hier een protocol beschreven voor het uitvoeren van de functionele beoordeling van gehele eiwitten verzadigingsmutagenese bibliotheken, met behulp van high-throughput sequencing technologie. Een belangrijk aspect van de werkwijze is het gebruik van orthogonale primers tijdens het klonen. Kort samengevat, wordt elke aminozuurpositie gerandomiseerd door mutagene PCR en gemengd in groepen van posities waarvan de totale sequentielengte wordt opgevangen door high-throughput sequencing. Deze groepen worden gekloneerd in plasm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Typtone	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Yeast extract	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Petri plates	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	25 nmol schaal, standaard desalting
pBR322_AvrII	beschikbaar op aanvraag		pBR322 plasmide gemodificeerd om een AvrII restrictieplaats stroomafwaarts van het TEM-1 gen te bevatten
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	beschikbaar op aanvraag		vijf gemodificeerde pBR322 plasmiden, elk met een paar orthogonale priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491L	inclusief 5x PCR buffer en PCR additief (GC versterker)
15 ml conische buis	Corning	430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
PCR plate, 96 well	Fisher Scientific	14230232
96 well plate seal	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Ethidium bromide	Bio-Rad	161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.	http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer	Qiagen	19086
96-well zwart-wandige, doorzichtige bodem assay platen	Corning	3651
Lambda phage DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA reagent	Invitrogen	P7581	dsDNA kwantificeringsreagens, gebruikt in protocol stap 2.2.4
Victor 3 V microplate reader	PerkinElmer
DNA purificatie kit	Zymo Research	D4003
Microcentrifuge buisjes	Corning	3621
Lang-golflengte UV verlichter	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Agarose gel DNA extractie buffer	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli	Avidity	EVB100
Electroporator (E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Electroporatie cuvettes	Bio-Rad	165-2089
Spectrofotometer (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 ml conische buizen	Corning	430828
Plasmid purificatie kit	Macherey-Nagel	740588.25
8 well PCR strip buisjes	Axygen	321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32854	dsDNA kwantificeringsreagens
Qubit assay buisjes	Invitrogen	Q32856
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32866
Ampicillin natriumzout	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)	Illumina	MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	alternatief, men zou kunnen sequencen op Illumina HiSeq platform
FLASh software	John Hopkins University - open source	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	software om gepaarde end reads van next-generation sequencing data samen te voegen
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F			AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R