Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nieuwe benadering voor gelijktijdige opname van renale sympathiek zenuw activiteit en bloeddruk met intraveneuze infusie in de bewuste, ongebreidelde muizen.

10.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54120

⸱

14 februari 2018

 , 
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Department of Physiology & Biophysics, University of Mississippi Medical Center, 3Mississippi Center for Obesity Research

In dit artikel

Samenvatting

Narcose muizen vertonen niet-fysiologische systemische bloeddruk, die zich verzet tegen de zinvolle beoordeling van autonome Toon gezien de intieme relatie tussen bloeddruk en het autonome zenuwstelsel. Dus, een nieuwe methode om tegelijkertijd record renale sympathiek zenuw activiteit en bloeddruk met intraveneuze infusie in de bewuste muizen wordt geschetst.

Samenvatting

Renale sympathische zenuwen bijdragen aanzienlijk tot zowel fysiologische en pathofysiologische verschijnselen. Evaluatie van de activiteit van de renale sympathiek zenuw (RSNA) is van groot belang op vele terreinen van onderzoek zoals chronische nierziekten, hypertensie, hartfalen, diabetes en obesitas. Eenduidige beoordeling van de rol van het sympathische zenuwstelsel is dus absoluut noodzakelijk voor de juiste interpretatie van de experimentele resultaten en begrip van ziekteprocessen. RSNA is traditioneel gemeten bij narcose knaagdieren, zoals muizen. Echter, muizen meestal vertonen zeer lage systemische bloeddruk en hemodynamische instabiliteit voor enkele uren tijdens anesthesie en chirurgie. Zinvolle interpretatie van RSNA is verward door deze niet-fysiologische toestand, gezien de intieme relatie tussen sympathische zenuwstelsel Toon en cardiovasculaire status. Om deze beperking van de traditionele benaderingen, ontwikkelden we een nieuwe methode voor het meten van de RSNA in bewuste, vrij bewegende muizen. Muizen zijn chronisch geïnstrumenteerd met radio-telemeters voor continue monitoring van bloeddruk evenals een infusie van jugular veneuze katheter en bipolaire elektrode douane-ontworpen voor directe opname van RSNA. Na een herstelperiode van 48-72 uur, overlevingskans was 100% en alle muizen zich normaal gedragen. Op dit moment-punt, werd RSNA met succes opgenomen in 80% van de muizen, met levensvatbare signalen verworven tot 4 en 5 dagen na chirurgie in 70% en 50% van de muizen, respectievelijk. Fysiologische bloed druk werden opgenomen in alle muizen (116±2 mmHg; n = 10). Opgenomen RSNA verhoogd met eten en grooming, als gevestigde in de literatuur. RSNA werd bovendien gevalideerd door ganglionaire blokkade en modulatie van de bloeddruk met farmacologische stoffen. Een effectieve en beheerbare methode voor duidelijke opname van RSNA in bewuste, vrij bewegende muizen wordt hierin beschreven.

Inleiding

Interesse in het gebruik van muizen op verschillende terreinen van biomedisch onderzoek blijft uitbreiden met de ontwikkeling van talloze genetisch gemanipuleerde modellen. Voor het grootste deel, technische vooruitgang gelijke tred hebben gehouden met het toegenomen gebruik van muizen in fysiologie en er is nu een indrukwekkende selectie van verkleinde apparaten ontwikkeld specifiek voor het meten van belangrijke fysiologische parameters in muizen. Hoewel telemetrische apparaten voor directe meting van autonome zenuwstelsel Toon in de bewuste rat zijn beschikbaar voor meer dan een decennium, verkleinde apparaten voor het beoordelen van zenuw activiteit in bewuste muizen zijn momenteel niet beschikbaar. Onderzoekers meestal omzeilen deze beperking door de beoordeling van de bijdrage van het autonome zenuwstelsel met indirecte methoden (d.w.z. plasma of urine catecholamines, farmacologische autonome blokkade, spectrale analyse van patronen van bloed Druk/hartslag)1.

Hoewel deze benaderingen waardevolle informatie bieden, is het resultaat een algemeen beeld van de totale autonome Toon, in plaats van waaruit de afzonderlijke bijdrage van geïsoleerde populaties van zenuwen naar het fenomeen onderzochte. Als alternatief, directe opname van de activiteit van bepaalde zenuwen is uitgevoerd in narcose muizen, die een veelheid van zorgen met zich meebrengt. Het is buitengewoon moeilijk om stabiele bloeddruk binnen de fysiologische bereik in een narcose muis voor enkele uren na de operatie. In feite, in dit soort experimenten, bloeddruk is vaak niet-aangegeven of gepresenteerd op een zeer laag niveau (dat wil zeggen 60-80 mmHg vs > 100mmHg in een bewuste muis)2. De kwetsbaarheid van het cardiovasculaire systeem tentoongesteld in de voorbereiding van een narcose muis vaak uitsluit zinvolle beoordeling van autonome zenuw activiteit, gezien de codependent relatie tussen bloeddruk en sympathieke Toon3, 4.

Om deze beperking, een nieuwe methode voor directe opname van renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) in bewuste, ongebreidelde muizen, ongestoord binnen hun huis kooien werd ontwikkeld. Zowel de chirurgische en experimentele aanpak voor een succesvolle implementatie van deze techniek wordt in detail beschreven. Deze voorbereiding kan de onderzoeker gelijktijdig opnemen arteriële druk via radiotelemetry naast RSNA, met de toegevoegde mogelijkheid om intraveneus infuus agenten van belang zonder verstoring van de muis.

Vierentwintig uur na chirurgie, muizen zich normaal gesproken gedragen en doen niet vertonen tekenen van pijn of leed. Experimentele opnames kunnen dan 48 tot 72 uur na operatie beginnen, terwijl de muis comfortabel in haar kooi met onbeperkte toegang tot voedsel, water en milieu verrijking ligt. Duidelijke RSNA sporen worden gepresenteerd en de karakteristieke reacties van deze zenuw bevolking normale fysieke bewegingen van het dier (zoals eten en grooming) worden gedemonstreerd naast farmacologische modulatie van de systemische bloeddruk. De kwaliteit en de specificiteit van de RSNA signaal wordt verder bevestigd door ganglionaire blokkade. Dit manuscript bevat de audiovisuele aanvulling op een aanvankelijk gepubliceerde beschrijving van deze techniek5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle van de experimentele procedures zijn in overeenstemming met de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité van het medisch centrum van de Universiteit van de Mississippi.

1. dieren en huisvesting

  1. Huis muizen (24-35 g) bij aankomst in de institutionele laboratorium dier faciliteit.
  2. Muizen bieden standaard knaagdier chow en leidingwater ad libitum in alle stadia van het experimentele protocol in een gecontroleerde omgeving van temperatuur en vochtigheid.

2. aangepaste fabricage van de implanteerbare RSNA-elektrode

Opmerking: Construeer de implanteerbare RSNA elektrode minstens een paar dagen voor de geplande chirurgische ingreep voor genezing en sterilisatie tijd (hieronder beschreven).

  1. Snij drie gelijke lengtes van geïsoleerde RVS meerdere-stranded wire elke 250 mm (draaddiameter 0.0254 mm kale, 0,14 mm gecoat). Gebruik een scalpel blad (bij voorkeur #11) aan strook van ongeveer 15 mm van het isolatiemateriaal om het onderliggende metaal van het ene eind van elk van de lengtes van draad bloot te stellen.
    1. Soldeer een enkele mannelijke pinsconnector (messing met goudlaag) naar het bared einde van slechts twee van de draden tot bipolaire elektrode leidt (figuur 1A). Laat het einde van de derde lengte van de draad kaal. Dit zal fungeren als de draad van de grond.
    2. Een korte (~2.0 - 2,5 cm) glijden stuk van 1,6 mm diameter heat-shrink tubing over de pinsconnector en de draad te volledig dekken de nieuw gesoldeerd pakking tussen de draad en pin connector.
      Opmerking: Het uiteinde van de pinsconnector die zal worden aangesloten op de versterker headstage moet blijven blootgesteld.
    3. Houd de draad boven een warmte-pistool met een paar kleine tangen of hemostats te krimpen van de buis warmtegevoelig en elektrisch isoleert de verbinding tussen de pens-connector en de draad. Herhaal dit voor de tweede draad/pin-connector.
  2. Knip een 200 mm lengte van polyethyleen slang (PE 90; binnendiameter 0,86 mm, buitendiameter 1,27 mm). Groep van de drie draden (twee leidt + draad op de grond) en de invoering van de ongerepte uiteinden in de PE 90-buis, draadsnijden ze samen door naar het open uiteinde van de buis (figuur 1B).
    Opmerking: De 90 van de PE buizen functies als een omhulsel te groeperen en te beschermen van de elektrode leidt en draad op de grond.
    1. Identificeer de grond draad en haal deze door de schede PE 90 een beetje verder om deze te onderscheiden van de bipolaire elektrode leads.

3. bouw van het elektrode-Tip

  1. Visualiseer de ongerepte uiteinden van de draden van de elektrode met een ontleden Microscoop. Rijg de drie losse eindjes van de elektrode via een 5 mm - lange stuk kleinere polyethyleen slang (PE 10, binnendiameter 0,28 mm, buitendiameter 0.61 mm) om de draden van de elektrode te verenigen.
    1. Een 1,5 mm stuk van deze PE 10-buizen op de drie elektrode draden met elkaar verbinden. Verder deze buizen om uit te rusten van 2.0 mm afstand van de eerste 5 mm stuk van PE-10.
    2. Rijg een tweede bagagestuk van 1,5 mm PE 10 buis op de toppen van de twee bipolaire elektrode leidt tot dekken en het isoleren van de tips en het scheiden van de grond draad (figuur 1 c).
  2. Trim eventuele overtollige lengte van de draden met een schaar.
  3. Lijm de afzonderlijke stukjes PE 10 buis aan de draden van de elektrode met een kleine druppel vloeibare formule Cyanoacrylaat lijm. Plaats een afgestompte 25 meter naald op het uiteinde van de buis van de lijm morsen te verbeteren van de controle.
    1. Plaats de naald tip op het kruispunt tussen de PE 10 en draad, dan afzien van een kleine daling van lijm en visualiseren lijm coating van de binnenkant van de PE-buis.
    2. Laat de lijm aan volledig genezen overnachten.

4. fijne voorbereiding van de elektrode Tip voor opname

  1. Strip de isolerende coating van de bipolaire elektrode-tips en het uiteinde van de draad van de grond met een scalpel #11 mes. Niet storen of schade aan de onderliggende meerdere gestrande draden zoals dit invloed op de kwaliteit van het signaal van de RSNA hebben zal.
  2. Greep de geconstrueerde elektrode tussen de 5.0 mm en 1.5 mm PE 10 ankers met pincet gebogen en buig de draden te vormen een hoek van 90° (figuur 1 d).
    Opmerking: Dit manoeuvre moet de positie van de bipolaire elektrode leads boven de draad van de grond, in een optimale positie aan de wieg van de bundel van de zenuw.

5. bouw van de verankerende sokkel

  1. Construct een voetstuk te stabiliseren van de elektrode tot de mid schapulier regio van de muis op exteriorization leidt door het snijden van een 3 cm stuk polyethyleen slang (binnendiameter 2.70 mm, buitendiameter 4.00 mm).
    1. Grip van de buis met een tang en smelt een uiteinde over een warmte-pistool. Druk op de verwarmde end van buizen loodrecht op een koele metalen oppervlak om een afgeronde rug of "flens" te maken.
    2. Rijg deze voetstuk op de geconstrueerde elektrode, zodanig dat de flens naar het uiteinde van de elektrode wijst.
      Opmerking: De combinatie van de PE 90 schede en voetstuk zal beschermen de elektrode leads keer die van het dier.

6. sterilisatie van de voltooide implanteerbare elektrode

  1. Pakket de voltooide elektrode individueel in sterilisatie tassen en ozon steriliseren (TSO3) vóór implantatie.
    Opmerking: Raadpleeg met plaatselijk ziekenhuis sterilisatiefabriek met betrekking tot specifieke type van sterilisatie tas en procedure zoals dit tussen instellingen verschilt.

7. narcose en voorbereiding op de operatie

  1. Beheren analgesie 20 minuten voorafgaand aan de start van de operatie (2 mg/kg meloxicam, S.C.). Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een zaal van de inductie met 100% medische kwaliteit zuurstof toegediend. Vaporizer instellingen aanpassen zodat verhoging van het percentage van Isofluraan verdoving in stappen van 0,5 tot 4%. Evalueren van chirurgische vliegtuig door de beoordeling van de reflex reactie op zachte druk op de tenen of de stootkussens van de voet van voorgrond toegepast en hind ledematen en de vertraging van de ademhaling.
    1. Het dier overbrengen in de chirurgische tabel en onderhouden van anesthesie met 1,5 tot 2% Isofluraan via een neuskegel zodra het chirurgische vliegtuig heeft bereikt en niet langer de teen-snuifje-reflex vertoont. Herhaal het antwoord teen-snuifje periodiek en respiratoire tarief gedurende de gehele chirurgische procedure beoordelen. Ophthalmic zalf toepassen om te voorkomen dat droge ogen.
    2. Het handhaven van de normale lichaamstemperatuur van het dier te allen tijde met gel gevulde isothermische warmte pads en bijbehorende chirurgische tabel. Isothermische pads opslaan in een waterbad 37° C en vervangen remblokken zo vaak als nodig tijdens chirurgie om fysiologische lichaamstemperatuur.
    3. Beheren van glycopyrrolaat (50-70 µg/kg, subcutaan (S.C.)) om te voorkomen dat buitensporige productie van airway afscheidingen onmiddellijk na de inductie van de anesthesie. Beheren deze dosis glycopyrrolaat een tweede fouillering, bij het middelpunt van de chirurgische procedure (stap 9.1).
    4. Het gedrag van alle chirurgische ingrepen onder aseptische condities. Zorgen ervoor alle chirurgische instrumenten gesteriliseerde met autoclaaf vóór de geplande operatie. Schoonmaken van het chirurgische gebied zoals hieronder (7.2.1) beschreven en steriliteit gedurende de hele procedure handhaven.
      1. Draag een gezichtsmasker, gesteriliseerde met autoclaaf isolatie jurk en steriele handschoenen voor eenmalig gebruik. Reinig alle grote apparatuur, zoals zwanenhals lamp, ontrafeling van werkingssfeer en chirurgische tafel met 70% ethanol. Periodiek tijdens de procedure, wordt 70% ethanol toepassen door de chirurgische handschoenen om steriliteit.
  2. Verwijderen haren van het dier linkerflank, ventrale nek en dorsale midscapular regio met kleine dierlijke tondeuses, gevolgd door ontharende room (gevoelige huid formule).
    1. Reinigen van de huid van deze twee chirurgische velden met 3 afwisselend toepassingen van chirurgische reiniging oplossing (10% Povidon jodium) en 70% ethanol. Het chirurgische gebied met een definitieve toepassing van de chirurgische reiniging oplossing voor te bereiden.

8. chirurgische implantatie van de RSNA-elektrode

  1. Plaats de muis op de rechterkant met de rostraal einde wijst naar de surgeon's links, bloot de linker flank van het dier. Maak een 5 mm incisie in de huid van de midscapular regio met een scalpel (#11).
    Opmerking: Dit is de site waarop de RSNA elektrode leads die zal worden.
    1. Maak een tweede snede (< 20 mm) in de huid over de linkerflank, loodrecht op de wervelkolom en de 2 mm caudal aan de ribbenkast. Tunnel een 13G RVS naald subcutaan van deze incisie aan de insnijding op de site van de dorsale afsluiten.
      Opmerking: File de scherpe randen van de naald te verlaten een gladde, niet-cutting edge.
    2. De gesteriliseerde implanteerbare RSNA elektrode (stap 2 - 6) passeren de 13G naald. Trek de naald 13G terug te laten de tip van de elektrode liggend op de buikspier van de linkerflank. Laat een segment van de elektrode leads liggen onder de huid en laat de resterende lengtes die voortkomen uit de dorsale incisie.
  2. Plaats het uiteinde van de elektrode naar de kant. Maak een incisie in de buikspier rechtstreeks ten grondslag liggen aan de huid incisie gemaakt in 8.1.1. Scheid de vet en bindweefsel langs de rug spier met kleine katoen-tipped applicatoren bloot de linker nier.
    1. Open het chirurgische gebied met micro-OPROLMECHANISMEN en intrekken van de nier. Doe niet te rekken van de renale neurovasculaire bundel, die onherroepelijk zullen beschadigen de renale zenuwen en beletsel voor opname van een levensvatbare RSNA signaal.
      Opmerking: Staal micro-OPROLMECHANISMEN kunnen worden gevormd uit een standaard paperclip en een lengte van de zijde van de 4-0. Zorg ervoor dat deze oprolmechanismen zijn ook gesteriliseerd met de chirurgische instrumenten ter bescherming van aseptische techniek.
  3. Visualiseer de renale neurovasculaire bundel met behulp van een high power ontrafeling van Microscoop. Identificeer de renal zenuw bundel, die meestal (maar niet altijd) langs de renale slagader en ader loopt. Ontleden de bundel van de zenuw van de omliggende weefsels met een fijne, rechte Tang.
    Opmerking: De renale zenuw bundel ondoorzichtig, met een "touw-achtige" reflecterende uitstraling uniek ten opzichte van de lymfevaten, die duidelijk weergegeven.
    1. Manipuleren van de zenuw bundel zo weinig mogelijk. Niet aanraken, rekken of pick-up de zenuw bundel op elk gewenst moment. Fijne bloedvaten bevoorrading van de zenuw, of de renale lymfe-buis, omdat dit zal levensvatbaarheid van de zenuw en produceren continu lymfe vloeistof bundelen rond de zenuw/elektrode, die zal belemmeren of volledig vernietigen het signaal van de zenuw niet verstoren.
    2. Laat de renale zenuw bundel intact, die zal helpen behouden op de lange termijn levensvatbaarheid van de zenuw, alsmede stabiele contacten tussen de zenuw en de elektrode (dat wil zeggen een verdeelde zenuw kan glijden off van elektroden met tijd en natuurlijke lichaamsbewegingen) onderhouden.
  4. De RSNA elektrode tip in de buik te introduceren. Haar positie aanpassen zodat de bipolaire elektrode uiteinde en grond draad staan loodrecht op de renale neurovasculaire bundel. De positie van de elektrode verder aanpassen zodat de grond wire goed contact met de onderliggende weefsels heeft en de elektrode niet de renale schepen comprimeren doet, afbreuk te doen aan de renale circulatie (figuur 1 d).
  5. Til de renale zenuw bundel met schuine pincet. Glijd de elektrode-tip onder de zenuw, waardoor de zenuw in rechtstreeks contact met beide draden.
    1. Een klein stukje van paraffine film glijden tussen de zenuw/bipolaire draden en de derde (grond) draad (figuur 1 d).
      Opmerking: Soak steriliseren de paraffine film in 70% ethanol gedurende 24 uur en spoel in een steriele fysiologische zoutoplossing vóór.
    2. Verwijder eventuele bloed of vloeistof uit rond de zenuw/elektrode met kleine absorberend spears als elke vloeistof links rond de zenuw of elektrode draden zal belemmeren of het signaal van de zenuw te blussen.
    3. Snel test de kwaliteit van het signaal van de RSNA indien gewenst (setup hieronder beschreven).
      Opmerking: Dit moet snel worden gedaan zoals blootstelling aan lucht zal drogen van de zenuw en haar levensvatbaarheid.
    4. Een tweecomponenten silicone-elastomeer toepassen op de eenheid van de zenuw/elektrode, ervoor te zorgen dat de siliconen zwembaden onder/nabij het lef om te zorgen voor volledige elektrische isolatie (d.w.z. niet alleen een druppel op de top van de zenuw).
      Opmerking: Zorg ervoor dat de elektrode tips zijn ook gecoat in het silicone. De draad van de grond moet blijven in contact met de onderliggende weefsel en elastomeer hoeft dus niet te zwembad onder deze draad. Vermijd een onnodig groot bedrag van de silicone-elastomeer, toe te passen omdat dit renale doorbloeding potentieel kan belemmeren, of met natuurlijke lichaamsbewegingen met tijd worden verdreven.
    5. Laat 1-2 minuten voor de silicone-elastomeer te genezen volledig, vervolgens zorgvuldig opheffing van de buitenste randen van het silicone "glob" met een tang en breng een kleine hoeveelheid vloeibare formule chirurgische plakband over de opening.
      Opmerking: zorg niet toe te passen van een bovenmatige hoeveelheid deze lijm, aangezien het kan afbreuk doen aan de omloop of verspreid naar de zenuw en haar levensvatbaarheid.
  6. Sluit de abdominale incisie met discontinue, absorbeerbare hechtingen (5-0). Sluit de bovenliggende huid op een soortgelijke manier met hetzelfde hechtdraad materiaal.

9. de innesteling van de bloeddruk Radiotelemeter

  1. Verplaats de muis op zijn rug, met de rostraal einde wijzen naar de chirurg. Anesthesie neuskegel naar wens aanpassen. Beheren de tweede dosis van glycopyrrolaat op dit punt (zie 7.1.3).
  2. Maak een middellijn-incisie in de huid van de nek regio met een scalpel (#11), vanaf net onder de onderkaak van het dier en uitbreiding van net boven de ribbenkast. Scheid het klierweefsel om de onderliggende nekspieren bloot te stellen. Bloot de linker gemeenschappelijke halsslagader en scheiden van de omringende weefsels.
    Opmerking: Neem grote zorg niet te beschadigen van de nervus vagus, omdat dit tot verhoogde na chirurgische sterfte leiden kan.
    1. Drie gedeeltes van de 6-0 zijde hechtdraad materiaal onder de slagader doorgegeven. Positie één hechtdraad zo veel rostrally mogelijk en bind het om het occlude van het schip. Plaats een tweede hechtdraad halverwege langs de lengte van het schip en losjes binden. Plaats de laatste hechtdraad zo caudally mogelijk en losjes binden.
    2. Intrekken van de rostraal-meeste hechtdraad en veiligste tot de neuskegel met een klein stukje navelstreng tape. Intrekken van de caudal-meeste hechtdraad met micro-mug pincet te beperken van de bloedstroom in het schip.
    3. Maak een kleine incisie in de vaatwand met fijne lente schaar zo rostrally mogelijk. Het introduceren van de muis bloeddruk radiotelemeter katheter in het vaartuig en de vooraf aan de caudal hechtdraad.
      1. Bind de middelste hechtdraad tijdelijk stabiliseren van de katheter, laat de caudal retractie en verder van de katheter 10 mm. Tie hechtdraad rond katheter in plaats veilig te stellen.
    4. Tunnel de telemeter lichaam aan een subcutane zak langs de rechterflank.

10. implantatie en Exteriorization van de Jugular veneuze katheter

  1. Met kleine katoen-tipped applicatoren waarmee werkmapberekeningen de juiste halsslagader. Twee gedeeltes van de 6-0 zijde hechtdraad materiaal doorgegeven rond het schip.
    1. Positie één hechtdraad rostrally zo ver als mogelijk en band met de occlude van het schip. Plaats de tweede hechtdraad zo caudally mogelijk en voorzichtig intrekken om te stoppen met de bloedstroom in het schip.
    2. Gebruik fijne lente schaar om een kleine incisie in de vaatwand zo dicht mogelijk bij de rostraal hechtdraad mogelijk. De ader met warmte-uitgerekt tubing catheterize (od 1,02 mm, uitgerekt tot OD 0.64 mm), die is vooraf gevuld met steriele fysiologische zoutoplossing.
      Opmerking: Zorg ervoor dat het uiteinde van de katheter wordt gesneden met een scalpel tot een afgeronde schuine kant om te voorkomen dat vaartuig perforatie. Bepalen van de hoeveelheid vloeistof in de katheter (dode spatie) voor naslaginformatie (Zie stappen 14.4-14.6 hieronder).
      1. Verder de katheter ~ 8 mm in de ader. Het beveiligen van de katheter door koppelverkoop de zijde hechtingen rond het schip en katheter, evenals de toepassing van een kleine daling van gel formule Cyanoacrylaat lijm.
  2. Plaats de muis aan de linkerkant. Tunnel de intraveneuze katheter vanaf de nek om af te sluiten op de dorsale midscapular regio met behulp van een naald 13G RVS.
  3. Verplaats de muis op zijn rug. Sluit de hals snede met niet-aaneengesloten hechtingen.
  4. Plaats het dier in de vatbaar positie. Rijg een kleine onderhuidse knop op de veneuze katheter. Beveilig de knop onder de huid met hechtingen. Rijg de overeenkomstige roestvrij stalen veer over de veneuze katheter en veilig naar de knop van de huid te beschermen van de katheter.

11. beveiliging van de elektrode die leidt

  1. Beveilig de polyethyleen voetstuk beschermen die de elektrode tot de onderliggende spier weefsel verlijmd leidt. Suture de bovenliggende huid over de flens voor verdere ondersteuning.

12. na chirurgisch herstel

  1. Antibiotische zalf toepassen op alle incisies.
  2. Beheren van pijnstillende medicatie. Beheren van extra doses van pijnstillende medicatie indien nodig tijdens de herstelperiode als het dier tekenen van pijn of leed toont.
  3. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een metabole kooi bekleed met houtsnippers beddengoed en papieren handdoek om te herstellen. Voortdurend volgen van het dier en laat niet het zonder toezicht totdat het bewustzijn herwint en sternale ligcomfort kan handhaven. Op dit moment introduceren van milieu verrijking en voedsel en water (ad libitum).
  4. Spoel elektrode leidt buiten de kooi tot het tijdstip van het experiment.
  5. Plaats de kooi boven een warme warmte pad voor de eerste 24 uur van herstel. RVS lente en intraveneuze katheter verbinden met een draaibare/infusie systeem voor continue infusie van fysiologische zoutoplossing tijdens de herstelperiode (0,5 mL/uur).
  6. Zorgen dat het dier blijft afzonderlijk gehuisvest in een speciale kooi vanwege de aard van de exteriorized katheter en elektrode leidt.

13. experimentele opstelling voor opname bloeddruk en RSNA

  1. Voorzien van een roestvrij staal hoogste trillingdempende tafel met een eenvoudige kooi van Faraday.
    Opmerking: Deze kooi van Faraday kan worden geconstrueerd met een houten frame en aluminium scherm mesh. Elektrisch gemalen de tabel/Faraday kooi te elimineren alle elektrische ruis.
  2. Plaats een bloeddruk radiotelemetry ontvanger binnen de kooi van Faraday.
  3. Sluit de ontvanger van de radiotelemetry naar de bijbehorende druk output adapter. Deze adapter aansluiten een data-acquisitiesysteem naar record bloeddruk online.
  4. Soldeer twee vrouwelijke pins aansluitingen die gratis naar de elektrode mannelijke pins connectors (messing met goudlaag) aan de uiteinden van een gekoppelde, afgeschermde PVC geïsoleerde kabel. Soldeer de tegenovergestelde einden van deze gekoppelde kabel Banaan pluggen. De banaan stekkers verbinden met een preamplification headstage (10 X amplificatie).
  5. Deze voorversterker verbinden met een differentiële versterker. Pas de instellingen te versterken om de zenuw signaal x10, 000. Filterinstellingen als volgt aanpassen: laag uitgesneden, 100Hz; Hoge knippen, 1000 Hz.
  6. Plaats de kooi met de muis op de ontvanger van de radiotelemetry gelegen binnen de kooi van Faraday 48 tot 72 uur na de operatie. Inschakelen van de radiotelemetry sonde bloeddruk signalen opnemen.
    Opmerking: De muis wennen door het plaatsen van de kooi in de setup in de loop van 1 week voorafgaand aan de operatie is optimaal.
  7. Uncoil van de elektrode leads en steek de aansluitingen van de pin van de bipolaire elektrode in de overeenkomstige vrouwelijke pin aansluitingen (13,4) hierboven om te beginnen met het opnemen van de RSNA.
  8. Weergeven en tegelijkertijd opnemen bloeddruk signalen online met een computer, terwijl de infusie van fysiologische zoutoplossing of oplossing van belang. Record een minimale overdrachtssnelheid voor gegevens bedraagt 2500 samples per seconde.

14. het monster van experimentele Protocol en validatie van RSNA signaal

  1. Zorgen dat muizen zijn comfortabel in hun kooi, ongebreidelde met gratis toegang tot voedsel en water. Volg institutionele dierenverzorgers richtlijnen voor het controleren van de normale weergave en het gedrag.
  2. Het huis van de muizen in de dezelfde temperatuur en de vochtigheid gecontroleerd kamer in welke RSNA opname zal plaatsvinden. Zorgen voor intraveneuze infusie blijft zoals hierboven beschreven.
  3. Toestaan ten minste 30 minuten van stabilisatie zodra het dier in de opname-instellingen ligt voordat u gaat opnemen van één uur van basislijn bloeddruk en RSNA gegevens hierboven beschreven. Zorgen dat het dier rustig rust tijdens opname aangezien natuurlijke beweging gekoppeld aan verhoging van sympathieke Toon is. Opmerking Wanneer het dier rechtstreeks op het digitale spoor gaat tijdens opname zodat dit kan worden genegeerd tijdens de analyse.
  4. Test de baroreflex reactie van eerste langzaam een bolus van natrium nitroprusside (2,5 µg/g lichaamsgewicht in een volume van 25 µL zoutoplossing) injecteren in de lijn van de infusie. Langzaam spoelen de regel met ~ 50 µL fysiologische zoutoplossing. Zorg katheter dode ruimte is uitgeschakeld. Record bloeddruk en RSNA voor 2 tot 5 minuten.
  5. Langzaam injecteren een bolus van phenylephrine (20 µg/g lichaamsgewicht in 25 µL zoutoplossing). Spoelen met ~ 50 µL fysiologische zoutoplossing. Zorg katheter dode ruimte is uitgeschakeld. Record bloeddruk en RSNA voor nog eens 10 tot 15 minuten.
  6. Controleer of de postganglionic aard van het signaal van de zenuw door het langzaam het injecteren van een bolus van de ganglionaire blocker, hexamethonium (50 µg/g lichaamsgewicht in 25 µL zoutoplossing) in de lijn van de infusie. Spoelen met ~ 50 µL zoutoplossing. Zorg katheter dode ruimte is uitgeschakeld. Doorgaan met opnemen gedurende enkele minuten.
  7. Gebruik de resterende activiteit die na toediening van de hexamethonium als een schatting van achtergrondgeluiden voor gebruik in de analyse van de RSNA blijft (hieronder beschreven).
  8. Euthanaseren van de muis met een overdosis van Isofluraan (stapsgewijze dosering in stappen van 0,5 tot 5%) en blijven opnemen RSNA voor nog eens 30 minuten. Opmerking: De resterende signaal kan ook gebruikt worden als een schatting van achtergrondgeluiden voor analyse van RSNA.

15. de gegevensanalyse

  1. Gebruik de software van de overname van het gegevens om ruwe bloeddruk en RSNA sporen te analyseren.
    1. Digitaal integreren en full-wave corrigeren de ruwe RSNA trace gebruikend deze software. Selecteer "Absolute integraal" voor integraal instellingen; een tijd van constante verval van 0,1 seconden6van toepassing.
    2. Analyseer het geïntegreerde RSNA signaal (weergegeven in eenheden van µV·s) voor elk segment van het experimentele protocol. Segmenten van de opname negeren wanneer het dier is gebeurd te bewegen. Neem minstens 3 maten voor basislijn en experimentele gedeelten van het experiment, respectievelijk.
    3. RSNA op het niveau van de minimale en maximale bloeddruk bereikt voor natrium nitroprusside of phenylephrine, respectievelijk om te beoordelen van de gevoeligheid van de baroreflex te analyseren.
    4. Het gemiddelde van de individuele metingen boven voor elk gedeelte van de experimentele protocol naar een enkele waarde opleveren.
    5. De RSNA respons te kwantificeren door het berekenen van de procentuele verandering van RSNA vanaf basislijn, die is aangewezen op 100%7. Volledige statistische analyse zo nodig.
      Opmerking: In dit voorbeeld, statistische analyse van de reactie van RSNA op natrium nitroprusside en phenylephrine werd afgesloten met een Student t -test; betekenis werd aanvaard met P -waarden < 0.05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na het protocol beschreven was overlevingspercentage 100% - alle muizen geïnstrumenteerd in deze studie overleefd en herstelde zich goed na de chirurgische ingreep. Binnen 24 uur na chirurgische voorbereiding, alle muizen zich normaal gesproken gedragen vertonen de typische eten, verzorgen en experimentele gedrag. Geen dieren toonde teken van pijn of leed op dit moment. 48 uur na de operatie, werd een verifieerbare en duidelijk signaal van de RSNA opgenomen in 10 van de 12 muizen. Dit sig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wij hebben hierin uiteengezet, aangetoond en een nieuwe methode voor gerichte beoordeling van RSNA in bewuste muizen, vrij te verplaatsen en comfortabel rusten in hun huis kooien gevalideerd. Na chirurgische implantatie van een radiotelemeter van de arteriële druk, een inwonende intraveneuze infusie-katheter en een douane-ontworpen RSNA bipolaire elektrode, muizen hersteld van de operatie en gedurende 48 tot 72 uur ongemoeid werden gelaten. Muizen bleef comfortabel vaste in hun kooi te allen tijde (met inbegrip van exper...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

S.M.H. werd gesteund door postdoctorale beurzen van de Canadese instituten voor gezondheid onderzoek (CIHR), hart & beroerte Stichting van Canada (HSFC) en Alberta innoveert Health Solutions (AiHS); J.E.H. wordt ondersteund door een subsidie van de National Heart-, Long- en bloed Instituut PO1HL-51971.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Teflon-coated roestvrij staal meerdraads draadA-M Systems7932000,001 inch diameter bare; 0,0055 inch diameter gecoat
#11 ScalpelbladFisher ScientificALMM9011
Soldeerbout en soldeertinElke make of model geschikt
Mannelijke miniatuur pin connectorsA-M Systems520200Messing met goud plating
Vrouwelijke miniatuur pin connectorsA-M Systems520100Messing met goud plating
Heat Shrink tubingRadio ShackModel #: 278-1610 | Catalog #: 27816101,6 mm diameter
Polyethyleen 90 (PE90) buisVWRCA-63018-7030,86mm binnendiameter; 1,27mm buitendiameter
Dissectie microscoopLeica MicrosystemsLeica M80Elke make of model ook geschikt
Polyethyleen 10 (PE10) buisBraintree ScientificPE10  50 FT0,28mm binnendiameter; 0,61mm buitendiameter
Superlijm VloeibaarLoctiten/aVloeibare formule; elk merk geschikt
Superlijm GelLoctiten/aGel formule; elk merk geschikt
Polyethyleen buisScientific CommoditiesBB31695-PE/13Voor sokkel 2,7mm binnendiameter; 4,0mm buitendiameter
Ziekenhuis Sterilisatie Diensten & Ozon Sterilisatie pakkettenContact lokale ziekenhuis sterilisatie diensten
IsofluraangeanesthesieAbbott05260-05
Deltaphase isotherme hitte pads & operatietafelBraintree Scientific39OPHoud hitte pads warm in een 37°C waterbad; Corresponderende operatietafel essentieel
GlycopyrrolateAmdipharm Mercury Company Limitedn/a
Isofluraan verdampingssysteem & flow meterBraintree ScientificVP IVoeg medische kwaliteit zuurstof toe
WeefselschaarFine Science Tools14173-12
Fijne veerschaarFine Science Tools15006-09
Kleine wattenstaafjesFisher Scientific23400100
Fijne rechte pincetFine Science Tools11254-20#5, FST door Dumont Biologie Tip
Gebogen pincetFine Science Tools11251-35#5/45 FST door Dumont
Kleine absorberende sperenFine Science Tools18105-03
ParafilmSigma AldrichBR701605 ALDRICH
Kwik-Sil 2 component Silicone PolymeerWorld Precision Instruments (WPI)KWIK-SILKoop extra gespecialiseerde tips van WPI
5-0 Polysorb NaaldTyco Healthcaren/a
6-0 Zijde NaaldBraintree ScientificSUT-S  104Deknatel merk, spoel
Radiotelemetry SondeData Sciences International (DSI)TA11-PAC10
Radiotelemetry OntvangerData Sciences International (DSI)PhysioTel RPC-1
Omgevingsdruk ReferentieData Sciences International (DSI)Apr-01
Druk Uitvoer AdapterData Sciences International (DSI)R11CPA
Rena Pulse SlangBraintree ScientificRPT-040
Infusie DraaischarnierInstech Solomon375/D/22
Draaischarnier Ondersteunende Arm & MountInstech SolomonSMCLA
Polysulfone knop Instech SolomonLW62S/6
Roestvrij staal veerInstech SolomonPS62
Vetbond chirurgische lijm3Mn/a
Drievoudig Antibioticum ZalfFougeran/a
PowerLab 8 Kanaals Data Acquisitie Systeem & SoftwareADInstrumentsPowerLab 8/35
PVC Geïsoleerde KabelBeldenPVC Audio Verbindingskabel 32 AWG
Preamplificatie HeadstageDagan CorporationModel 4002
Differentiële VersterkerDagan CorporationEX4-400
Natrium NitroprussideSigma Aldrich71778-25G
FenylephrineSigma AldrichP6126-5G
Steriele Fysiologische Saline 0,9% NaClBeckton DickinsonContact lokale ziekenhuis leverancier
hexamethoniumSigma AldrichH0879-5G
Roestvrij Staal top anti vibratie tafeln/an/aOp maat ontworpen in huis; Solide stalen plaat op een werkbank is ook geschikt
Faraday kooin/an/aOp maat ontworpen en gebouwd in huis
Kleine dieren haar trimmern/an/aDrugstore, mannen baard trimmer geschikt
Depilator Creamn/an/aVeet merk, gevoelige huid formule
10% Povidone JodiumPurdue ProductsBetadine
70% Ethanoln/an/a
Stalen microretractorsn/an/aGemaakt in huis. Buig een stalen paperclip & loop 4-0 zijde om een retractor te vormen
HemostatsFine Science Tools13011-12
WarmtepistoolFisher Scientific09-201-27

Referenties

  1. Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
  2. Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
  3. Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
  4. Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
  5. Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
  6. DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
  7. Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
  8. do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
  9. Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
  10. Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
  11. Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
  12. Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127(2010).
  13. Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
  14. Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
  15. Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6(2013).
  16. Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
  17. Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
  18. Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
  19. Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
  20. Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
  21. Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218(2015).
  22. Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
  23. Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
  24. Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
  25. Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
  26. Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
  27. Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
  28. Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
  29. Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
  30. Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
  31. Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
  32. Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
  33. Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
  34. Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
  35. Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
  36. Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
  37. Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bloeddrukmetingbewuste muizenjugulaire veneuze katheterbipolaire elektroderadiotelemetriechirurgische instrumentatieganglionblokkadefysiologische registratiebeoordeling van de autonome tonus
Nieuwe benadering voor gelijktijdige opname van renale sympathiek zenuw activiteit en bloeddruk met intraveneuze infusie in de bewuste, ongebreidelde muizen.
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.