We beschreven een protocol voor de preventie van warmtestresseffecten bij ratten door orale voorbehandeling met nuttige bacteriën. Dit protocol kan worden aangepast en gebruikt voor verschillende toedieningsroutes en voor de analyse van verschillende verbindingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Preventie van hittestress schadelijke effecten bij ratten door
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie werd ontworpen om de beschermende werking van de Bacillus subtilis stam tegen complicaties bij hittestress evalueren. Tweeëndertig Sprague-Dawley ratten werden gebruikt in deze studie. De dieren werden oraal behandeld tweemaal daags gedurende twee dagen met B. subtilis BSB3 stam of PBS. De volgende dag na de laatste behandeling, elke groep werd gesplitst en twee experimentele groepen (één behandeld met PBS en behandeld met een B. subtilis) werden bij 45 ° C gedurende 25 min geplaatst. Twee controlegroepen bleven 25 minuten bij kamertemperatuur. Alle ratten werden gedood en verschillende parameters werden geanalyseerd in alle groepen. Nadelige effecten van hittestress zijn geregistreerd door de daling van de villi hoogte en totale mucosale dikte in het darmepitheel; translocatie van bacteriën uit het lumen; grotere blaasjes van erytrocyten en verhoging van de lipopolysacchariden (LPS) in het bloed. De beschermende werkzaamheid van de behandeling wordt geëvalueerd door preinterventie van deze bijwerkingen. Het protocol werd opgezet voor de orale behandeling van ratten met bacteriën voorkomen hittestress complicaties, maar dit protocol kan worden gemodificeerd en gebruikt voor andere toedieningswijzen en voor de analyse van verschillende verbindingen.
Inleiding
Verschillende stressfactoren hebben invloed op de gezondheid van mens en dier. Temperatuur is een van de meest stressvolle factoren en veroorzaakt chronische, acute en zelfs dodelijke ziekten1. Veranderingen in de darmmorfologie en een verlies van de darmwandintegriteit na hittestress werden in veel gevallen gedocumenteerd2,3. Deze beschermende barrière is verantwoordelijk voor de verdediging tegen translocatie van darmbacteriën en hun toxines, in het bijzonder lipopolysachariden (LPS), van het lumen naar de interne circulatie4,5. Stabiliteit van de darmmicrobiota heeft een significante invloed op de darmwandfunctie, de immuunrespons van de gastheer en de tolerantie voor stresscondities6. Daarom kan modulatie van de darmmicrobiota een nieuwe aanpak bieden voor het voorkomen van stress-gerelateerde bijwerkingen.
Nuttige bacteriën zijn gebruikt als een veelbelovende strategie om de darmmicrobiota te wijzigen voor het succesvol beheer van verschillende klinische aandoeningen, zoals diarree, inflammatoire darmaandoeningen, atopische dermatitis, metabole stoornissen7-10. Probiotica-effecten van nuttige bacteriën omvatten de productie van essentiële metabolieten ter ondersteuning van de darmgezondheid, stimulatie van het immuunsysteem, promotie van lactosetolerantie en herstel van epitheliale disfunctie. Probiotica waren effectief in de preventie van stress-gerelateerde complicaties in vitro en in diermodellen11,12.
Onderzoekers hebben meer aandacht besteed aan Bacillus bacteriën als probiotica omdat deze bacteriën de darmhomeostase ondersteunen13 en gunstige effecten hebben op de gastheer14. Onze eerdere gegevens toonden een hoge werkzaamheid van Bacillus probiotica tegen pathogenen in vitro15,16 en in klinische onderzoeken17,18. Hier willen we het preventieve effect van B. subtilis BSB3-stam tegen complicaties na hittestress evalueren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door IACUC van Auburn University, Auburn, Alabama.
1. Voorbereiding van Cultuur Media, serviesgoed en bacteriecultuur
- Inoculeer 10 ml nutriënt bouillon in een kolf met een enkele kolonie van Bacillus subtilis BSB3 cultuur, overnacht gegroeid op een nutriënt agar plaat.
- Voeg 500 ml van sporulatie medium 19 (per liter: Bacto Nutrient Broth, 8 g, 10% (w / v) KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) magnesiumsulfaat 4 x 7H 2 O, 10 ml, agar, 15 g) en steriliseren bij 121 ° C gedurende 20 min. Laat afkoelen tot 50 ° C en voeg de volgende steriele oplossingen: 1 M Ca (NO3) 2, 1 ml; 0,01 M MnCl2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml.
- Koel bereid medium tot 40 ° C gedurende 20 min bij kamertemperatuur en giet 25 ml in elk van 20 steriele Petrischalen in de steriele kast. Laat het medium stollen 's nachts.
- Verspreid 0,5 ml overnacht cultuur van Bacillus subtilis BSB3 op het oppervlak van het medium in petrischalen. Incubeer cultuur bij 37 ° C gedurende 5 dagen tot 90% sporulatie. Reveal fase-heldere sporen van hoge resolutie microscopie.
- Oogst bacteriën door toevoeging van 1 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op de plaat en schrapen bacteriën uit een oppervlak met steriele cel spreader. Bewaar de suspensie in de koelkast totdat het nodig is.
- Bevestigen levensvatbaarheid van bacteriën door het uitplaten 0,1 ml van de geschikte verdunning (10 tot 10 -5 -6) van een bacteriesuspensie op sporulatie mediumplaten gevolgd door incubatie gedurende 18-24 uur bij 37 oC
- Rekenen bacteriële kolonies op de platen met behulp van een kolonieteller en bereken de titer van bacteriën in de geteste suspensie. Bereid bacteriesuspensie met de eindconcentratie 1 x 10 8 CFU / ml in PBS.
2. Dieren
- Met 32 mannelijke Sprague-Dawley ratten (250-300 g). Handhaaf dieren onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden met gratis toegang tot de standaard pellet chow en water. Opzetten van een gemiddelde temperatuur (21 ± 1 o C), vochtigheid (50 ± 5%) en een 12 uur licht-donker cyclus.
3. Experimenteel ontwerp
- Start behandeling van dieren door orale sondevoeding 11, na 2 dagen van acclimatisatie. Gebruik spuit met de orale maagsonde naald. Behandel 16 ratten met B. subtilis BSB3 suspensie (1 ml per rat) tweemaal per dag gedurende twee dagen (B. subtilis groep). Behandel 16 ratten met PBS (1 ml per rat) tweemaal per dag gedurende twee dagen (PBS groep) (figuur 1).
- Na de behandeling onderverdelen elke groep (8 ratten per groep): Groep 1- controle (PBS / geen stress), Groep 2- B. subtilis (B. subtilis / geen stress), Groep 3- stress (PBS / hittestress) en Group 4 B. subtilis + stress (B. subtilis / hittestress).
- Meet de rectale temperatuur van elke rat met behulp van een electronic digitale thermometer. Houd ratten van groepen 1 en 2 bij kamertemperatuur gedurende 25 min. Plaats dieren van groepen 3 en 4 in een klimaatkamer bij 45 ° C en relatieve vochtigheid 55% voor 25 minuten.
- Daarna meet de rectale temperatuur van elke rat in alle groepen met een elektronische digitale thermometer. Plaats alle dieren bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Verdoven ratten met isofluraan (2-4%) in een afsluitbare anesthesie pot en waarnemen totdat de ratten diep geanesthetiseerd (ontbreken van reactie op teen knijpen). Euthanaseren ratten door snelle onthoofding met een guillotine.
- Verzamel trunk bloed van elke rat 20 (15-16 ml) met de pyrogeenvrij pipetten in pyrogeenvrij buizen serum te krijgen en onmiddellijk het nemen van monsters van het bloed (7 ui van elke rat) met een pipet voor microscopisch onderzoek.
- Zet de buizen met bloed in een ijskast minstens 30 minuten om stolling te laten. Centrifugebuizen bij 20 ° C, 7000 g gedurende 10 min en snelverwijderen serum met een pipet. Aliquot serum verkregen van elke rat in 50 pl volumes en bewaar bij -20 ° C tot analyse.
4. Chirurgische Procedure
- Cut / trimmen alle bont uit de buik en de borstkas van de onderkant van het karkas met elektrische scharen. Leg het karkas in een steriele kabinet en de behandeling van de geschoren oppervlak van het karkas met 70% alcohol.
- Een steriele scalpel om middellijn incisie van de buik te creëren. Verwijderen lever, mesenterische lymfklieren, de milt en de dunne darm van elke rat met steriele pincet.
5. Analyse van de bacteriële Translocation
- Plaats elk monster lever, mesenterische lymfeknopen en de milt in vooraf gewogen steriele buizen en weeg. Bereken het gewicht van het monster als een verschil tussen het gewicht van een buis met een monster en het gewicht van een lege buis.
- Voeg steriel PBS om de buis een 1:10 verdunning te verkrijgen (w / v) van het monster en homogeNize elk monster met een steriele glazen tissue homogenisator om een homogene suspensie 21 te verkrijgen.
- Maak seriële verdunningen (10 -1 tot -4 10) van elk monster in steriele PBS. Plaat 0,1 ml van verdunningen van elk weefsel op het oppervlak van MacConkey en 5% bloed agar en Brucella agar met hemine (0,005 g / L) en vitamine K1 (0,01 g / l) platen.
- Incubeer MacConkey en 5% agarplaten aëroob en Brucella agarplaten onder anaërobe omstandigheden bij 37 ° C 22.
- Telling kolonies van aërobe bacteriën na 24 uur en kolonies van anaërobe bacteriën na 48 uur incubatie met een kolonieteller. De resultaten worden uitgedrukt als het aantal kolonievormende eenheden (CFU) in een gram weefsel.
6. Histologische analyse
- Verwijder dunne darm monsters uit elke rat van de chirurgische procedure (stappen 4,1-4,2). Fix monsters in Bouin's Fixatief, insluiten in paraffine,bereiden 6 um secties en kleuring secties met hematoxyline en eosine onder toepassing van standaard procedures 23.
- Gebruik een hoge resolutie microscoop voor diepte-van intestinale villi en mucosale totale dikte in elk monster (vergroting 100X) 24. Analyseer 4 monsters van elke rat en maak minstens twintig metingen in elk monster. Versneld resultaten in micrometers.
7. Cytokine Assay
- Gebruik commerciële rat ELISA-kits voor IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ en IL-10 de niveaus van cytokinen te meten in serum volgens het protocol van de fabrikant.
- Genereer standaard curves voor elke set van de monsters getest met behulp van normen voor de betreffende kit. Definieer het niveau van cytokines in elk monster door vergelijking van experimentele gegevens met de geschikte standaardcurve.
8. Lipopolysaccharide Assay
- Analyseer niveau van LPS in het serum onder toepassing van een rat LPS ELISA kit volgensprotocol van de fabrikant. Schatting concentratie van LPS in monsters door vergelijking van de verkregen waarden met de waarden van de standaardcurve.
9. met hoge resolutie Light Microscopie of Blood
- Gebruik de microscoop systeem eerder beschreven 25,26. Gebruik een trillingsisolatie platform als basis voor de microscoop systeem en video-camera en de computer 25 om de live beelden op te nemen. Kalibreren testbeelden met behulp van een Richardson dia zoals eerder beschreven 27.
- Plaats 7 pl vers afgenomen bloed van elke rat op een glasplaatje, dekglaasje, foto en opnemen tien beeldrasters van 72 x 53,3 micrometer 2 in elk monster (vergroting 1,700X).
- Meet de concentratie van vesicles met software die hoge-resolutie direct-zicht optische beelden in real time verschaft. Onderzoek een minimum van 20 beeldframes voor elke experimentele conditie 28.
10. Statistics
- Versneld alle waarden als gemiddelde en de standaarddeviatie. Voer statistische analyse en grafiek plotten. Analyseer de resultaten met de twee sample t-test, ligt het significantieniveau van 0,05 statistische significantie te bepalen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gemiddelde lichaamstemperatuur van de dieren voor en na hittestress was 36,7 ± 0,07 o C en 40,3 ± 0,17 o C respectievelijk (p <0,05). Blootstelling van ratten warmte (groep 3) resulteerde in significante remming van villi hoogte en mucosale totale dikte (figuren 2, 3). Orale toediening van BSB3 stam voordat spanning beschermd darm tegen de schadelijke invloed van warmte.
Translocati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Blootstelling aan hoge temperaturen leidt tot ernstige gezondheidsproblemen 29. Preventie en vroege opsporing van complicaties in verband met hittestress zijn van vitaal belang 30. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om de werkzaamheid van verschillende benaderingen voor het voorkomen van hittestress nadelige effecten ervan.
Kritische stappen in dit protocol zijn onder meer: de warmtebehandeling procedure (45 o C, 25 min); het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Auburn University-fonds FOP 101002-139294-2050.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar platen | VWR | 470180-742 | |
| 5% bloed agar platen | VWR | 89405-024 | |
| Brucella bloed agar plaat met Hemin en Vitamine K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin’s Fixatievloeistof | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC4021 | |
| TNF-alpha Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Rat LPS ELISA Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Environmental Chamber 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultracentrifuge | |||
| Lichtmicroscoop optisch systeem | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Kolonieteller | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Vriezer | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra microplate reader | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipetten | Gilson, Pipetman, Frankrijk | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Slinger shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petri schotels | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Opkweekflacons | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer kolven |
| Optisch Spectrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Videocamera | Sony | ||
| Richardson testplaatje | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore waterzuiveringssysteem | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Driebalans | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Weefselhomogenisator, Dounce | VWR | 71000-518 |
Referenties
- Crandall, C. G., Gonzalez-Alonso, J. Cardiovascular function in the heat-stressed human. Acta Physiol. 199, 407-423 (2010).
- Lambert, G. P. Role of gastrointestinal permeability in exertional heatstroke. Exerc. Sport Sci. Rev. 32, 185-190 (2004).
- Yu, J., et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study. Comp. Biochem. Physiol. A-Mol. Integr. Physiol. 156, 119-128 (2010).
- Moseley, P. L., Gisolfi, C. V. New Frontiers in Thermoregulation and Exercise. Sports Med. 16, 163-167 (1993).
- Lambert, G. P. Stress-induced gastrointestinal barrier dysfunction and its inflammatory effects. J. Anim. Sci. 87, 101-108 (2009).
- Berg, A., Muller, H. M., Rathmann, S., Deibert, P. The gastrointestinal system - An essential target organ of the athlete's health and physical performance. Exerc. Immunol. Rev. 5, 78-95 (1999).
- Khan, M. W., et al. Microbes, intestinal inflammation and probiotics. Expert Rev Gastroent. 6, 81-94 (2012).
- Quigley, E. M. M. Prebiotics and Probiotics: Their Role in the Management of Gastrointestinal Disorders in Adults. Nutr Clin Pract. 27, 195-200 (2012).
- Gore, C., et al. Treatment and secondary prevention effects of the probiotics Lactobacillus paracasei or Bifidobacterium lactis on early infant eczema: randomized controlled trial with follow-up until age 3 years. Clin Exp Allergy. 42, 112-122 (2012).
- Gomes, A. C., Bueno, A. A., de Souza, R. G. M., Mota, J. F. Gut microbiota, probiotics and diabetes. Nutr. J. 13, (2014).
- Eutamene, H., et al. Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress-induced gut permeability and sensitivity increase in rats. J. Nutr. 137, 1901-1907 (2007).
- Ait-Belgnaoui, A., et al. Lactobacillus farciminis treatment attenuates stress-induced overexpression of Fos protein in spinal and supraspinal sites after colorectal distension in rats. Neurogastroenterol. Motil. 21, 585-593 (2009).
- Fujiya, M., et al. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal Homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter. Cell Host Microbe. 1, 299-308 (2007).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiol. 28, 214-220 (2011).
- Pinchuk, I. V., et al. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. Antimicrob Agents Ch. 45, 3156-3161 (2001).
- Sorokulova, I. B., Kirik, D. L., Pinchuk, I. V. Probiotics against Campylobacter pathogens. J. Travel Med. 4, 167-170 (1997).
- Gracheva, N. M., et al. The efficacy of the new bacterial preparation biosporin in treating acute intestinal infections. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. , 75-77 (1996).
- Horosheva, T. V., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic-associated diarrhoea: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. JMM Case Report. 1, (2014).
- Sorokulova, I. B., Krumnow, A. A., Pathirana, S., Mandell, A. J., Vodyanoy, V. Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores. Biotechnol. Prog. 24, 1147-1153 (2008).
- Vogel, H. G., Vogel, W. H. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. eds H.G. Vogel & W.H. Vogel. Vogel, H. G., Vogel, W. H. , 658-659 (1997).
- Bailey, M. T., Engler, H., Sheridan, J. F. Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice. J. Neuroimmunol. 171, 29-37 (2006).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118, 229-241 (2004).
- Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. J. Appl. Physiol. 100, 1400-1409 (2006).
- Ribeiro, S. R., et al. Weight loss and morphometric study of intestinal mucosa in rats after massive intestinal resection. Influence of a glutamine-enriched diet. Rev. Hosp. Clìn. Fac. Med. S. Paulo. 59, 349-356 (2004).
- Vainrub, A., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Resolution of 90 nm (lambda/5) in an optical transmission microscope with an annular condenser. Opt Lett. 31, 2855-2857 (2006).
- Moore, T., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Oral administration of Bacillus subtilis strain BSB3 can prevent heat stress-related adverse effects in rats. J Appl Microbiol. 117, 1463-1471 (2014).
- Richardson, T. M. Test slides: Diatoms to divisions-What are you looking at. Proc Roy Microsc Soc. 22, 3-9 (1988).
- Moore, T., Sorokulova, I., Pustovyy, O., Globa, L., Vodyanoy, V. Microscopic evaluation of vesicles shed by rat erythrocytes at elevated temperatures. J Therm Biol. 38, 487-492 (2013).
- Leon, L. R., Helwig, B. G. Heat stroke: Role of the systemic inflammatory response. J. Appl. Physiol. 109, 1980-1988 (2010).
- Kumar, Y., Chawla, A., Tatu, U. Heat Shock Protein 70 as a Biomarker of Heat Stress in a Simulated Hot Cockpit. Aviat Space Env Med. 74 (7), 711-716 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
