Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van overlevingstijd bij

7.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54126

⸱

22 juli 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

In dit artikel

Samenvatting

Rotifers zijn microscopisch kleine zoöplankton die als modellen worden gebruikt in ecotoxicologische en verouderingsstudies. Hier bieden we een protocol voor krachtige en reproduceerbare meting van overlevingstijd in Brachionus rotifers. Synchronisatie van de kweekomstandigheden over meerdere generaties is van bijzonder belang omdat de moederlijke toestand de levensgeschiedenis van het nageslacht beïnvloedt.

Samenvatting

Räderdiertjes zijn microscopisch kosmopolitisch zoöplankton dat als model wordt gebruikt in ecotoxicologische en verouderingsstudies vanwege hun verschillende voordelen zoals korte levensduur, gemak van cultivatie en parthenogenese die klonale cultivatie mogelijk maakt. Er moet echter voorzichtig worden omgegaan met het meten van hun overlevingstijd, omdat deze wordt beïnvloed door de leeftijd van de moeder en de voedingsomstandigheden van de moeder. Hier bieden we een protocol voor krachtige en reproduceerbare meting van de overlevingstijd in Brachionus raderdiertjes na een zorgvuldige synchronisatie van de kweekomstandigheden over meerdere generaties. Empirisch resulteert slechte synchronisatie in vroege mortaliteit en een geleidelijke afname van de overlevingssnelheid, wat leidt tot een zwakke statistische kracht. Inderdaad, onder dergelijke omstandigheden faalde caloriebeperking (CR) om de levensduur van B. plicatilis significant te verlengen, hoewel CR-geïnduceerde levensduur is aangetoond met goed gesynchroniseerde raderdiertjes in vroegere en huidige studies. Dit protocol is waarschijnlijk nuttig voor andere ongewervelde modellen, inclusief de fruitvlieg Drosophila melanogaster en de nematode Caenorhabditis elegans, omdat effecten van de moederlijke leeftijd ook zijn gerapporteerd in deze soorten.

Inleiding

Raderdiertjes zijn microscopisch kleine kosmopolitische zoöplankton (<1 mm) die de stam Rotifera 1 vormen. Ze hebben een eenvoudige bouwplan bestaat uit ongeveer 1000 somatische cellen en een karakteristieke wielvormige ciliaire inrichting genoemd corona, die wordt gebruikt voor vervoer en voeding. De meeste raderdiertjes behoren tot klassen monogononta of bdelloidea, die ongeveer 1.600 en 500 soorten, respectievelijk 2 bevatten. Monogononta raderdiertjes hebben over het algemeen zowel geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting fasen (cyclische parthenogenese), terwijl bdelloid raderdiertjes reproduceren door verplichte parthenogenese 3. Het is dus mogelijk om genetisch identieke rotifeer individuen, die een hoge reproduceerbaarheid zorg draagt ​​voor experimenten te verkrijgen. Bovendien hebben ze een aantal andere voordelen modelorganismen, zoals een korte levensduur, gemakkelijk cultuur, beschikbaarheid van genomische en transcriptoom sequentiegegevens 4-7, en een unieke fylogenetische positie op afstand van eenrthropods en nematoden 8. Raderdiertjes zijn dus veelbelovend ongewervelde modellen in ecologische, toxicologische en veroudering studies 9-12.

Het voortbestaan ​​tijd onder blootstelling aan omgevingsfactoren stress of chemicaliën is een vaak gemeten parameter in deze onderzoeksgebieden 13-19. Toch is voorzichtigheid geboden bij het meten van de overlevingstijd van raderdiertjes, want het is gevoelig voor milieu-omstandigheden van hun moeders. Namelijk, in de monogononta raderdiertje Brachionus manjavacas, vrouwelijke nakomelingen van de leeftijd van de moeders hebben een kortere levensduur dan die van de jonge moeders; echter maternale calorie restrictie (CR) gedeeltelijk compenseert de nadelige effecten van maternale leeftijd 20. In B. plicatilis, moeder CR biedt nakomelingen levensduur, lange overlevingstijd onder honger, en een hoge oxidatieve stress weerstand geassocieerd met een verhoogde expressie van antioxidant enzymen 21,22. De leeftijd van de moeder effectis ook waargenomen in bdelloid raderdiertjes 23. Daarom moeten de voorwaarden van experimentele raderdiertjes zorgvuldig gesynchroniseerd over verschillende generaties voor metingen van overlevingstijd.

Hier bieden we een protocol voor het meten van overlevingstijd bij Brachionus raderdiertjes na synchronisatie van kweekomstandigheden over meerdere generaties. Intermitterende vasten (IF), een variant van CR waarbij raderdiertjes periodiek worden toegevoerd, werd toegepast om het effect van synchronisatie onthullen door de bekende effecten van IF op levensduur 22,24.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de Media

Opmerking: Gebruik half-verdund Brujewicz kunstmatig zeewater van het zoutgehalte 16,5 ppt (PSU). Andere kunstmatige zeewater wordt ook vaak gebruikt om de cultuur Brachionus raderdiertjes 25,26.

  1. Voeg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl en 10 mM CaCl 2-4,5 L gedestilleerd water (uiteindelijk volume 5 L zijn). U kunt ook gebruik maken van gedemineraliseerd water verdunnen in plaats van gedestilleerd water. Voeg na oplossing CaCl2 alle andere zouten.
  2. Bereid de 0,48 M NaHCO3 voorraad-oplossing (200x concentratie). Voeg 25 ml aan de bovenstaande oplossing. De eindconcentratie van NaHCO3 is 2,4 mM.
  3. Bereid de 0,4 M NaBr voorraad-oplossing (500x concentratie). Voeg 10 ml aan de bovenstaande oplossing. De eindconcentratie van 0,8 mM NaBr is. Vul aan tot 5 L met gedestilleerd water.
  4. Filtreer de oplossing door een 0,45 urn membraanfilter.Verdunnen twee keer met steriel water voor gebruik (v / v).
    Opmerking: Het is mogelijk een 2x concentratie van Brujewicz kunstmatig zeewater zo een voorraadoplossing.

2. Algemene Voorwaarden Cultuur

  1. Cultuur laboratoriumschaal verhoogd of wild gevangen raderdiertjes in een steriele 100 ml bekerglas tussen 20 en 30 ° C. Hogere temperaturen resulteren in een kortere levensduur en versnelde weergave. Gebruik 25 ° C voor het gemak van experimenten. De rotifer dichtheid of het volume van kunstmatig zeewater is niet een groot probleem hier.
  2. Cultuur dieet microalgen soorten in kunstmatig zeewater 11. Zie Snell et al. (2014) voor meer informatie 11. Gewoonlijk gebruiken Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellen / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellen / ml 25,29), en Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellen / ml 30,31). Sinds dieet algen (species, cultuur Conditionen, biochemische composities) beïnvloedt significant overlevingstijd van Brachionus raderdiertjes, maken gebruik van dezelfde veel microalg in alle experimentele groepen.
  3. Houd een voorraad populatie van rotiferen in een batch cultuur door het voeren en het veranderen van de media af en toe (bijvoorbeeld voeden om de 2 dagen en te enten per week). Veel pasgeborenen en volwassenen dragen 2-3 eieren kunnen worden waargenomen wanneer raderdiertjes in optimale omstandigheden.
    Opmerking: Een alternatieve manier om experimentele raderdiertjes te verkrijgen is om rust eieren uitbroeden. Raderdiertjes uitgebroed uit rusteieren worden geacht goed te synchroniseren, waardoor de levensduur ervan is niet significant verschillend van die van raderdiertjes uitgebroed uit eieren amictic 11. Echter, raderdiertjes van rusteieren start reproductie eerder dan die uit amictic eieren. Zo, is voorzichtigheid geboden voor het meten van hun reproductieve eigenschappen.

3. Synchronisatie van Raderdiertjes door Pre-culture

  1. Selecteer één rotifer van de stock bevolking en cultuur zoals beschreven in 2.1-2.3 een subpopulatie die wordt gebruikt voor experimenten vastgesteld. Typisch kweek gedurende twee weken.
  2. Collect-ei-dragende raderdiertjes uit de sub-populatie (het verzamelen van een dubbele aantal mensen dat zal worden gebruikt voor het experiment). Cultuur ze als één cohort (dichtheid: ~ 50 personen / ml) in een 6-well cultuur plaat zoals beschreven in 2.1-2.3 in een vers medium onder ad libitum voeden. Beheersing van de bevolkingsdichtheid is belangrijk omdat het geconditioneerde medium van invloed op de reproductieve fysiologie van Brachionus raderdiertjes 32,33.
  3. Transfer pasgeborenen uitgebroed uit eerste eieren van de volwassenen om nieuw bereide voedingsbodems. Herhaal deze procedure op 2-3 generaties.
  4. Gebruik pasgeborenen uitgebroed binnen een bepaalde periode (bijvoorbeeld <3 uur) voor het meten van de overlevingstijd. Om een ​​mogelijke vertekening in de selectie van het individu te vermijden, hoewel zeer onwaarschijnlijk, kijk reproduceerbaarheid met behulp van verschillende indehangende subpopulaties.
    Opmerking: Zoals raderdiertjes meestal alleen reproduceren ongeslachtelijk onder deze voorwaarde, zodat er geen mannetjes gedurende het experiment aanwezig zijn. Mannetjes zijn kleiner dan neonaten en typisch sneller bewegen dan vrouwen. Mictic vrouwtjes hebben verschillende levensduur van amictic vrouwen onder bepaalde voorwaarden 29.

4. Metingen van Survival Time

  1. Plaats neonaten in kunststofplaten (kenmerkend 24- of 48-putjes, waarbij elk putje 1 ml kunstmatig zeewater).
  2. Op 24 uur intervallen overdragen raderdiertjes om nieuw bereide kweekmedia of 12 uur intervallen of bij hogere temperatuur (30 ° C of hoger). Noteer het aantal nakomelingen en of ieder individu is dood of levend. Noteer de rotifer als dood toen cilia beweging van de corona volledig tot stilstand is gekomen.
    Opmerking: Raderdiertjes hechten vaak de zijwanden van de putjes. Gentle pipetteren van het water helpt om ze te vinden. Als raderdiertjes niet worden gevonden of are ongeluk beschadigd door het pipetteren, hen op te nemen als "gecensureerd", niet als "dood".
  3. Verwijder pasgeborenen wanneer experimentele raderdiertjes actief reproduceren. Pasgeborenen groeien snel en het is soms moeilijk om ze te onderscheiden van experimenteel raderdiertjes.

5. Data Analysis

  1. Maak de Kaplan-Meier survival curve (figuren 1 en 2) door het uitzetten cumulatieve overleving op de Y-as en de tijd op de X-as. Dit is de meest voorkomende representatie van overlevingsdata. Gebruik de niet-parametrische log-rank test (ook wel Mantel-Cox test) voor statistische vergelijking van de overlevingstijd 34. De log-rank test wordt ook in andere standaard statistische pakketten zoals JMP en R.
    Opmerking: t-toets of variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door meervoudige vergelijkingstest parametrische gebruiken omdat normale distributie gewoonlijk niet voldoet overlevingsdata 35. Bovendien zijn deze methods niet censureerde individuen rekening te houden. Mann-Whitney U test kan worden gebruikt als er geen gecensureerde data.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten


Figuur 1 toont vertegenwoordiger survival curves van slecht gesynchroniseerde bevolking (van twee herhalingen). In dit experiment, raderdiertjes waren ofwel dagelijks gevoed [ad libitum (AL) groep] of om de dag (IF groep). De mediane overleving was 13 en 18 dagen in de AL en IF groepen, respectievelijk. Hoewel het bekend is dat IF verlengt de levensduur van de rotifer dit experiment niet een statistisch significant verschil tussen de levensduur van de AL e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol beschrijft een werkwijze voor het meten van de overlevingstijd bij raderdiertjes Brachionus. De kritische stap is de synchronisatie van rotifer voorwaarden over meerdere generaties. Wanneer experimentele raderdiertjes goed worden gesynchroniseerd, is een typisch type I survival curve waargenomen met zeer weinig vroege mortaliteit zoals gerapporteerd in een aantal eerdere studies 18,24,37,38. Standaarddeviatie van hun overlevingstijd dus kleiner geworden in vergelijking met slecht...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor George Jarvis, Martha Bock, en Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, voor hun hulp bij het filmen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NatriumchlorideWako190-13921
MagnesiumchlorideWako136-03995
MagnesiumsulfaatWako131-00427
KaliumchlorideWako168-22111
CalciumchlorideWako035-00455
NatriumbicarbonaatWako199-05985
NatriumbromideWako190-01515
Membraanfilter (0.45 µm poriegrootte)MilliporeHAWP04700
Kweekplaat, 6-well, niet-behandeldThomas Scientific6902D01Vlakke bodem
Kweekplaat, 48-well, niet-behandeldThomas Scientific6902D07Vlakke bodem
Tetraselmis, LevendCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad SoftwareVersie 6.0d

Referenties

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Overlevingstijd van rotiferensynchronisatie van de moederlijke conditieBrachionus plicatilislevensduur bij caloriebeperkingprotocol voor intermittent vastenkweek van neonatencollectie van eidragende individuenbereiding van kunstmatig zeewateranalyse van overlevingscurvesmeting van statistische power
Meting van overlevingstijd bij
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.