Methodenartikel

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

DOI:

10.3791/54131

⸱

31 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methylering is een van de belangrijkste epigenetische veranderingen aan het DNA, die verantwoordelijk is voor de precieze regulering van genen die nodig zijn voor stabiele ontwikkeling en differentiatie van verschillende weefseltypen. Ontregeling van deze werkwijze is vaak het kenmerk van verschillende ziekten zoals kanker. Hier schetsen we een van de recente sequencing technieken, Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-volgende), gebruikt om methylering te kwantificeren in verschillende normale en zieke weefsels voor grote patiënt cohorten. We beschrijven een gedetailleerd protocol van deze affiniteitsverrijking benadering samen met een bioinformatica pijpleiding optimale kwantificatie te bereiken. Deze techniek is gebruikt om honderden patiënten in verschillende kankertypes sequentie als onderdeel van de 1000 methyloom project (Cancer methyloom System).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische regulatie van genen door middel van DNA methylatie is een van de belangrijkste mechanismen voor het lot van de cel met stabiele differentiatie van verschillende weefseltypen bepalen het lichaam 1. Ontregeling van deze werkwijze is bekend dat verschillende ziekten veroorzaken waaronder kanker 2.

Deze werkwijze omvat in hoofdzaak de toevoeging van methylgroepen op het cytosine residuen in de CpG dinucleotiden van DNA 3. Er zijn verschillende technieken die momenteel worden gebruikt om dit mechanisme te onderzoeken, elk met hun eigen voordelen zoals in vele studies 2-8. Hier zullen we een van deze technieken genoemd Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-volgende), waarbij we gebruik maken van een affiniteit verrijking techniek om gemethyleerde regio's van het DNA te identificeren bespreken. Deze techniek is gebaseerd op het methyl-bindingsvermogen van de MBD2 eiwit te verrijken voor de genomische DNA fragmenten die gemethyleerd CpG sites. We maken gebruik van een commerciële gemethyleerd DNA verrijking kitvoor het isoleren van deze gemethyleerde gebieden. Ons laboratorium heeft honderden patiënten monsters met deze techniek gescreend en hier geven wij een volledig geoptimaliseerd protocol dat kan worden gebruikt om grote patiëntcohorten onderzoeken.

Zoals duidelijk met enige next-generation sequencing technologie, MBDCap-seq vereist ook een specifieke bioinformatica aanpak om nauwkeurig te kwantificeren van de niveaus van methylatie over de monsters. Er zijn veel recente studies in een poging om de normalisatie en analyseproces van de sequentiedata 9, 10 optimaliseren geweest. In dit protocol, tonen we een van deze methoden implementeren van een unieke read herstel aanpak - LONUT - gevolgd door een lineaire normalisering van elk monster om onpartijdige vergelijkingen tussen groot aantal monsters van patiënten mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle weefsels worden verkregen na de goedkeuring van de commissie Institutionele Review Board en wanneer alle deelnemers ingestemd met zowel de moleculaire analyses en follow-up studies. De protocollen zijn goedgekeurd door het Comité Human Studies aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio.

1. Methyl-bindende DNA Capture (MBDCap)

  1. Monstername en DNA-isolatie
    1. Verzamel bulk tumor of normale weefselmonsters van patiënt paraffine ingebedde weefselmonsters.
    2. Gebruik commerciële DNA mini kit genomisch DNA van de paraffine ingebedde weefselmonsters volgens het protocol van de fabrikant geïsoleerd.
    3. Gebruik een gemethyleerd DNA verrijking kit met de hier beschreven volgens het protocol van de fabrikant procedure.
  2. Initial kraal wash
    Opmerking: De kralen worden gebruikt voor het koppelen met biotine MBD-eiwit, dat DNA methylatie detecteert op het genoom. Korrels worden gewoonlijk gesuspendeerdin een voorraad oplossing. Gebruik deze stappen deze vloeistof af te wassen.
    1. Resuspendeer de voorraad van streptavidine kralen (zie Materials Table) door voorzichtig en neer te pipetteren om een homogene suspensie te verkrijgen. Laat de kralen niet door vortexen gemengd.
    2. Voor een ingang ug DNA, ADD10 pl kralen een buis met 90 pl 1x Bind / Wash Buffer. Draai gedurende 1 min. Niet mengen door vortexen.
    3. Plaats de buis (buizen) op een magnetische rek voor 1 min.
    4. Verwijder de vloeistof met een pipet en gooi de vloeistof.
    5. Voeg 250 ul van 1x Bind / wasbuffer aan de kralen en draai gedurende 1 min.
    6. Herhaal stap 1.2.3 - 1.2.5 tweemaal.
  3. Koppelen van het MBD-Biotine eiwit aan de korrels
    1. 1,2 ug input-DNA, voeg 7 pl (3,5 ug) van MBD-biotine proteïne aan elke buis.
    2. Voeg 93 ul van 1x Bind / wasbuffer aan het eiwit aan een eindvolume van 100 pl te maken.
    3. Meng de beads-eiwitmengsel op een roterende mixer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  4. Gefragmenteerde DNA (input)
    1. Ultrasone trillingen DNA door het toevoegen van 1,2 ug van totaal genomisch DNA in 96 ui TE-buffer en 24 ui 5x Bind / wasbuffer een 120 pi oplossing. Gebruik 30 s AAN en 30 s UIT tijdens sonicatie, 20 - 25 keer.
    2. Run 1 pi van gesoniceerd DNA-oplossing via een bioanalyzer systeem met een commerciële hoge gevoeligheid DNA kit om de grootte van de fragmenten controleren in het bereik van 150-350 bp volgens het protocol van de fabrikant.
  5. Was de MBD-kralen
    1. Plaats de buis met MBD-kralen op een magnetische rek voor 1 min.
    2. Verwijder de vloeistof met een pipet zonder het kralen.
    3. Resuspendeer de kralen met 250 pl 1x Bind / Wash Buffer.
    4. Meng de korrels op een roterende mixer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    5. Herhaal stap 1.5.1 - 1.5.4 tweemaal.
  6. Gefragmenteerde DNA capture reactie (1 ug ingang DNA)
    1. Breng de DNA / buffermengsel de buis met het MBD-kralen.
    2. Meng de MBD-kralen met het DNA op een roterende mixer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Als alternatief, meng O / N bij 4 ° C.
  7. Verwijderen van niet-gevangen DNA van de kralen
    1. Na mengen van het DNA en MBD-kralen Plaats de buis op de magnetische rek voor 1 min om alle korrels concentreren op de binnenwand van de buis.
    2. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet en opslaan in een schone DNase-vrij microcentrifugebuis als nonmethylated DNA. Bewaar dit monster op het ijs.
    3. Voeg 200 ul van 1x Bind / wasbuffer aan de kralen om de parels te wassen.
    4. Meng de korrels op een roterende menger gedurende 3 minuten.
    5. Plaats de buis op de magnetische rek voor 1 min.
    6. Verwijder de vloeistof met een pipet en opslaan in een microcentrifugebuis.
    7. voor captuur reacties van ≤1 ug ingang DNA Herhaal stap 1.7.3 - 1.7.6 voor 2 wassen fracties in totaal.
  8. Single fractie elutie
    1. Meng zoutarme buffer met een hoge zoutconcentratie (1: 1) tot elutiebuffer (1000 mM NaCl) krijgen.
    2. Resuspendeer de kralen in 200 ul elutiebuffer (1000 mM NaCl).
    3. Incubeer de kralen op een roterende menger gedurende 3 minuten.
    4. Plaats de buis op de magnetische rek voor 1 min.
    5. Met de buis op zijn plaats op de magnetische rek, verwijder de vloeistof met een pipet zonder het aanraken van de kralen met de pipet tip, en opslaan in een schone DNase-vrij 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaar dit monster op het ijs.
    6. Herhaal stap 1.8.1 - 1.8.4 een keer, het verzamelen van het tweede monster in dezelfde buis (totaal volume 400 ul). Bewaar het samengevoegde monster op het ijs.
  9. Ethanolprecipitatie (DNA cleanup)
    1. Aan elk noncaptured, wassen en elutie fractie frOM de vorige stappen, voeg 1 pi glycogeen (20 ug / ul, in kit), 1/10 monstervolume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2 (bijvoorbeeld 40 ul per 400 pl monster) en 2 monstervolumes 100% ethanol (bijvoorbeeld 800 pl per 400 pl monster). Het totale volume is 1241 ul.
    2. Meng goed en incubeer bij -80 o C gedurende ten minste 2 uur.
    3. Centrifugeer de buis gedurende 15 minuten bij 11.363 xg bij 4 ° C
    4. gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.
    5. Voeg 500 ul koude 70% ethanol.
    6. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 11.363 xg bij 4 ° C
    7. gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.
    8. Herhaal stap 1.9.6 - 1.9.7 eens en verwijder alle resterende resterende supernatant.
    9. Lucht Droog de pellet gedurende ~ 5 min. Niet helemaal de pellet drogen.
    10. Resuspendeer de DNA pellet in 37,5 gl DNase-vrij water of anderegeschikt volume buffer.
    11. Plaats het DNA op ijs of bewaar het DNA bij -20 ° C of lager tot verder gebruik.
    12. Controleer of de totale hoeveelheid DNA is meer dan 20 ng, (bv gebruiken fluorimetrische kwantificering systeem, zie Materialen Table).

2. Sequencing

  1. Met de DNA-fragmenten gewonnen uit MBDCap procedure voor sequentiebepaling. Voor elk monster te worden gesequenced, een totaal bedrag van 20 - wordt 40 ng DNA nodig voor bibliotheek voorbereiding.
  2. DNA-bibliotheek seq preparaat Gebruik een volledig geautomatiseerde bibliotheek bouwsysteem (zie Materialen Table) en volgt het standaard protocol geleverd door de fabrikant. Kies een DNA-fragmenten van grootte 200-400 bp voor bibliotheek voorbereiding. De automatisering bibliotheek voorbereiding systeem maakt het standaardiseren van de bibliotheek voorbereiding procedure en het minimaliseren van de variatie tussen de monsters als gevolg van handmatige voorbereiding.
  3. Gebruik adapter primers en verdun tot 100x concentratie. Hiervan gebruikt 10 pi van elk monster.
  4. Na stap 2.2, neem de reactie, en kwantificeren van de DNA-seq bibliotheek met behulp van een fluorometrische kwantificering systeem (zie Materials tabel).
    1. Opzetten van PCR-amplificatie procedure. De keuze van PCR master mix is ​​de PCR efficiëntie van GC verrijkt regio genoom verbeteren. In een PCR-buis, voeg 15 ul DNA-seq bibliotheek, 25 pi PCR master mix (zie Materials Table), 2 pi PCR-primer mix (zie tabel Materials) en 8 ul H 2 O.
  5. Volg PCR aanbeveling van de fabrikant van de PCR master mix, wijziging cyclustijden en temperaturen voor verschillende uitgangsmaterialen: 98 o C gedurende 45 s, X cycli van 98 ° C gedurende 15 s, 65 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s, en vervolgens 72 ° C gedurende 1 min. Houd bij 4 o C.
    1. Perform genoeg cycli eindigen met 2-10 nM bibliotheek DNA (8-10 cycli).
  6. Opruimen PCR reactie met 1: 1 verhouding van PCR zuivering parels volgens het protocol van de fabrikant (zie Materials Table).
  7. Elueer met 20-30 pl elutiebuffer.
  8. Barcode elk monster en het zwembad 4 monsters samen in één rijstrook van een stroom cel. Gebruik de standaard 50 bp enkel read protocol voor sequencing (zie Materials tabel).

3. Bioinformatica Analyse

Opmerking: Verdere verwerking van de ruwe fastq bestanden verkregen uit de sequencing om kwaliteitscontrole uit te voeren en in kaart brengen van de korte DNA-sequenties (leest) naar het genoom.

  1. Gebruik Bowtie korte read aligner, genoom mapping tool op elk monster fastq bestand in kaart het leest de referentie-genoom. Veel lees- mapping tools beschikbaar om deze stap uit te voeren en kan gebruikt worden op basis van individuele voorkeuren.
    1. Het kan tot 2 mismatches in de groe leest terwijl afbeelden van de verwijzing genoom. Rapporteren tot 20 beste uitlijning voor elke lezen. Gebruik bijvoorbeeld bowtie -v 2 --best k 20 --chunkmbs 200 .
  2. Gebruik LONUT 9 om te herstellen van de vermenigvuldigen toegewezen leest aan de detectie van de verrijkte regio's te verbeteren. Per lezen, hoogstens één lijn worden teruggewonnen wanneer het dicht genoeg bij een van de bovenstaande genoemd pieken. Gebruik bijvoorbeeld: perl lonut.pl -g hg19 w 250 -p 99 . LONUT zal de volgende stappen uit te voeren.
    1. Split groeperingen in unieke wijze in kaart gebracht leest en vermenigvuldigen in kaart gebracht leest. Call piek op de uniek toegewezen leest met behulp van peak beller BELT 11. De optie -w 250 en -p 99 in het voorbeeld opdracht zijn voor BELT.
    2. Combineer uniek toegewezen leest de herstelde leest verkregen LONUT en de gecombineerde bepaalt onder BED vorm zal worden gebruikt in verdere analyse. Bereken het aantal Combined leest voor toekomstige normalisering.
  3. Bin het leest. Extract leest in de regio van belang met behulp van perl-script: perl methyPipeline.pl -up -dn . Voor elk in de sampleInfoFile vermeld bed-bestand, het perl script voert de volgende taken.
    Opmerking: Zie aanvullende codering bestand voor de perl-script.
    1. Bin het leest in grootte van vaste bak, bijvoorbeeld, 100 bp, 24 chromosomen.
    2. Voor elke in refGeneFile gen, pak de bakken rond de transcriptie start site (TSS), tot de uitbreiding van de lengte gespecificeerd door optie -up en -dn. Zo halen de gegevens in de regio die voor en achter 4 kb van TSS. Bij binafmeting 100 bp, deze geëxtraheerde gegevens 81 bakken en het centrum bin correspondeert met de TSS.
    3. Voor het gen op de antisense streng, draai het geëxtraheerde gebied van links naar rechts, zodat stroomopwaarts bakken altijd placed aan de linkerkant van de perl-script.
    4. Verder deelden de TSS ± ​​4 kb gebied in drie subregio's: Links, upstream 4 kb tot 2 kb stroomopwaarts; Midden, voor en achter 2 kb; Rechts, downstream 2 kb tot 4 kb.
    5. Voor elk monster, verdeel de telling van de leest in elke bak door het totale aantal gecombineerde kaart gebracht leest berekend 3.3.3. De normalisatie zal het monster specifieke elimineren lezen verschillen en maakt het mogelijk om te vergelijken het leest over verschillende monsters.
  4. Voer het dreunmanuscript (zoals in het script) statistische testen de genormaliseerde leest verkregen uit het linkergebied, differentiële methylatie detecteren tussen normale en case groep in de beschreven in de flank regio's.
    Opmerking: Zie de aanvullende codering bestand voor de bash script. Gebaseerd op de gebieden die differentieel gemethyleerd zijn er zeven combinaties:
    Hele regio: differentiële methylatie gedurende de TSS ± ​​4 kb regio
    MiddleLeft: differentiële methylatie in zowel het midden en links regio
    MiddleRight: differentiële methylatie in zowel midden en rechts regio
    Flank: differentiële methylatie in zowel links als rechts regio
    Links: differentiële methylatie in de linker regio alleen
    Rechts: differentiële methylatie in de juiste regio alleen
    Midden: differentiële methylatie in het midden regio alleen
  5. Gebruik dezelfde bash script om de differentiële methylatie te visualiseren in een tornado plot. Teken de hyper en hypo gemethyleerde genen op een apart venster en sorteren in de volgorde van de regio combinatie zoals beschreven in 3,4, respectievelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben MBDCap-seq gebruikt om DNA methylatie veranderingen te bestuderen in een groot aantal patiënten uit verschillende kankersoorten zoals borstkanker 12, endometrial 13, prostaat 14 en leverkanker onder anderen. Hier laten we zien wat informatie van de borstkanker onderzoek dat onlangs 12 gepubliceerd. In dit geval gebruikten we de volledige genoomsequenties benadering CpG eilanden die differentieel gemethyleerd in tumor met betrekking tot normaal in verschillende genoomgebieden identificere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MBDCap-seq techniek een affiniteitsverrijking benadering 3, beschouwd als een kosteneffectief alternatief bij het onderzoek cohorten met een groot aantal patiënten 15. De pijpleiding hier gepresenteerde beschrijft een alomvattende aanpak van steekproef inkoop tot data-analyse en interpretatie. Een van de belangrijkste stappen is het opzetten van een PCR amplificatie procedure om de PCR efficiëntie van de GC verrijkte gebieden in het genoom verbeteren omdat daar DNA methylering plaatsvindt. Ook is het van wezenlijk b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is ontwikkeld in de laboratoria van Dr. Tim Huang en Dr Victor Jin aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk wordt ondersteund door CPRIT Research Training Award RP140105, evenals gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) verleent R01 GM114142 en door William & Ella Owens Medical Research Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Methylminer DNA enrichment KitInvitrogenME10025
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen112-05D
Bioruptor Plus Sonication DevicediagenodeB01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2SigmaS7899100 mL
SPRIworks Fragment Library System IBeckman CoulterA50100Fully automated library construction system
Adapter PrimersBioo Scientific514104PCR primer mix
QubitInvitrogenQ32854Fluorometric Quantitation System
PCR master mixKAPA scientificKK2621PCR master mix
AMPure XPBeckman CoulterA63881PCR Purification beads
EB BufferQiagen19086
HiSeq 2000 Sequencing SystemIllumina
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
  2. Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
  3. Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
  4. Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233(2012).
  5. Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
  6. Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
  7. Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
  8. Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
  9. Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788(2013).
  10. Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980(2013).
  11. Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
  12. Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13(2015).
  13. Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
  14. Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
  15. Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
  16. Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA methyleringsanalysepati ntenweefselmonstersisolatie van genomisch DNAsonicatieprotocolbereiding van elutiebufferbio informaticapijplijnCpG eilandmethyleringCancer Methylome Projectontdekking van epigenetische biomarkers

Gerelateerde artikelen