Methodenartikel

Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

DOI:

10.3791/54141

⸱

23 juni 2016

 , 
1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een benadering voor het visualiseren van fluorescente eiwit-DNA-bindend peptide (FP-DBP)-gekleurde grote DNA-moleculen die verankerd zijn op het polyethyleenglycol (PEG) en avidine-gecoate glasoppervlak en gestrekt zijn met microfluïdische afschuiwingsstromingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grote DNA-moleculen verankerd op het functionele glazen oppervlak zijn gebruikt in polymeerfysica en biochemie, met name voor het onderzoeken van interacties tussen DNA en zijn bindende eiwitten. Hier beschrijven we een methode die fluorescentiemicroscopie gebruikt voor het visualiseren van grote DNA-moleculen verankerd op het oppervlak. Ten eerste worden glazen dekglasjes gebiotinileerd en gepassiveerd door bedekking met gebiotinileerd polyethyleenglycol, dat specifiek gebiotinileerd DNA bindt via avidine-eiwitlinkers en ongewenst binden van niet-specifieke interacties van eiwitten of DNA-moleculen op het oppervlak aanzienlijk vermindert. Ten tweede worden de DNA-moleculen gebiotinileerd door twee verschillende methoden, afhankelijk van hun terminalen. Het bot eindigende DNA wordt getagd met gebiotinileerd dUTP op zijn 3' hydroxyl-terminus, door terminale transferase, terwijl het kleverige eindigende DNA wordt gehybridiseerd met gebiotinileerde complementaire oligonucleotiden door DNA-ligase. Ten slotte zorgt een microfluïdische schuifstroom ervoor dat enkele DNA-moleculen zich uitstrekken tot hun volledige contourlengte nadat ze zijn gekleurd met een fluorescente eiwit-DNA-bindend peptide (FP-DBP).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visualisatie van grote DNA-moleculen gebonden op glas of kraal oppervlakken is gebruikt voor het onderzoeken van DNA-eiwit interacties, eiwit dynamica van DNA-substraat, 1,2 en polymeerfysica. 3,4 Een platform voor single-tethered grote DNA-moleculen heeft een paar verschillende voordelen ten opzichte van andere DNA immobilisatie werkwijzen. 5 Ten eerste, een groot DNA-molecuul gebonden aan het oppervlak een natuurlijke willekeurige coil conformatie zonder shear flow die cruciaal voor een DNA bindend eiwit aan zijn bindingsplaats herkennen. Ten tweede is het zeer gemakkelijk om de chemische omgeving rond DNA moleculen veranderen van een reeks enzymatische reacties in een stromingskamer. Ten derde, een microfluïde afschuifstroming induceert DNA moleculaire uitstrekt tot 100% van de volledige contour lengte, die zeer moeilijk te bereiken alternatieve DNA elongatie zal zoals oppervlakte immobilisatie 6 en nanokanaal opsluiting. 7 Een volledig stretched DNA molecuul ook positie-informatie voor de controle enzymatische bewegingen op de genomische kaart kan zijn.

Toch is de DNA-tethering aanpak heeft een kritische tekortkoming in de intercalerende kleurstof zoals YOYO-1 in het algemeen veroorzaakt tethered DNA-moleculen gemakkelijk om gebroken te worden door middel van fluorescentie excitatie licht. In het algemeen grote DNA moleculen te worden gemerkt met een fluorescente kleurstof voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop. Daartoe YOYO-1 of andere TOTO series kleurstoffen worden vooral omdat deze kleurstoffen alleen fluoresceren wanneer ze dubbelstrengs DNA intercaleren. 8 is echter bekend dat bis-intercalerende kleurstof veroorzaakt licht geïnduceerde DNA foto-splitsing omdat intercalatie van de fluoroforen. 9 verder fluorescerend gekleurd DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak zijn kwetsbaarder omdat shear flows uitoefenen brekende krachten op vrij bewegen DNA moleculen. Daarom hebben wij FP-DBP als nieuw DNA-eiwit kleuring kleurstof voor het afbeelden van grote DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak. Het voordeel van FP-DBP is dat het geen foto-splitsing van de DNA-moleculen waaraan het bindt veroorzaakt. 10 Bovendien FP-DBP niet de contour lengte van DNA verhogen, terwijl bis-intercalerende kleurstoffen verhogen de contourlengte ongeveer 33%.

Deze video methode introduceert de experimentele aanpak voor tethering grote DNA-moleculen aan een PEG-biotine oppervlak. Figuur 1 toont verschillende benaderingen van aanbinden DNA met stompe uiteinden en sticky ends. Aldus kan deze kleuring worden toegepast op elk soort DNA-molecuul. Figuur 2 toont een schematische weergave van de stromingskamer samenstelling die kan worden gecontroleerd door een spuitpomp om dwarskracht stromen DNA-moleculen strekken en chemische en enzym plaatsen genereren oplossingen. Figuur 3 toont microfoto van volledig gestrekt DNA-moleculen gebonden aan het PEGylated oppervlak 11 en gekleurd met FP-DBP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DNA Biotinylatie

  1. Biotinylering van stompe uiteinden DNA met behulp van Terminal transferase (TdT)
    Opmerking: Gebruik T4 DNA (166 kbp), dat een stomp eindigende DNA.
    1. Voeg 5 ul van 2,5 mM CoCl2, 5 pi 10 x reactiebuffer, 0,5 pi 10 mM biotine-11-dUTP, 0,5 gl terminale transferase (10 eenheden) en 0,5 pl T4 DNA (0,5 ug / ul) aan het reactiemengsel. Maak een eindvolume van 50 ul door toevoegen van 38,5 pl water.
    2. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur.
      Opmerking: uitbreiding reactietijd kan dubbel-gebonden DNA werd verkregen, dat wil zeggen, het is mogelijk dat biotine gelabeld zijn aan beide uiteinden.
    3. Stop de reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Houd de buis bij 4 ° C.
  2. Biotinylering van kleverige eindigende DNA gebruiken DNA Ligase
    Opmerking: Gebruik λ DNA (48,5 kbp), dat een klevende uiteinden DNA.
    1. Voeg 1 pl T4 DNA ligase, 5 ui 10 x ligatiebuffer, 1 pl 25 ng / pl λ faag-DNA en voeg 43 ul water tot een eindvolume van 50 pl te maken.
    2. Houd de buis bij 4 ° C.

2. Gefunctionaliseerde Surface Derivatisering

Opmerking:. Om een uiteinde van een DNA-molecuul op glasoppervlakte tether, is een primaire aminegroep gesilaniseerd op een dekglaasje gevolgd door biotine-PEG bekleding zoals weergegeven in figuur 1 Dit PEGylatie is van belang voor het individuele molecuul DNA beeldvorming omdat het kan aanzienlijk verminderen willekeurige ruis door aanhechting van ongewenste moleculen op het oppervlak.

  1. Piranha Cleaning
    Opmerking: Piranha oplossingen reageren heftig met organische materialen, dus het moet met zorg worden behandeld, volgens de juiste richtlijnen voor veiligheid.
    1. Plaats coverslips op een polytetrafluorethyleen (PTFE) rack, en houd ze by PTFE Draaddichtend tape lengte, helft aan de rand van de oppervlakken en de helft op het rek. Na het verpakken, laat een lang stuk (~ 5 cm) van de tape voor de behandeling van het rek tijdens de reiniging.
    2. Vul een 1 L glazen beker met 350 ml H 2 SO 4 en 150 ml H 2 O 2 tot piranha oplossing in een zuurkast maken. Plaats het rek piranha-oplossing gedurende 2 uur.
    3. Lege piranha oplossing uit de beker, en spoel dekglaasjes grondig met gedemineraliseerd water totdat de pH van het water in de beker bereikt neutraal. Gebruik pH-papier stroken.
    4. Ultrasone trillingen de rekken van de dekglaasjes in de beker met water, gedurende 30 minuten. Lege water uit de beker net voor amino silaneren. Gebruik 75 W van sonicatie vermogen te reinigen en te derivatiseren de glassubstraten.
  2. Aminosilanization op glasoppervlakte
    1. Voeg 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethyleendiamine en 10 ml ijsazijn en 200 mlmethylalcohol in een schone polypropyleen houder voor het bereiden van de aminosilanization oplossing.
    2. Plaats gereinigd dekglaasjes in de polypropyleen container. Schud ze bij 100 rpm en kamertemperatuur gedurende 30 min.
    3. Ultrasone trillingen het bekerglas met gederivatiseerde dekglaasjes gedurende 15 minuten bij 75 W. Schud ze op 100 rpm en kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min.
    4. Leeg de uit de beker, en spoel dekglaasjes voorzichtig, eenmaal met methanol en tweemaal met ethanol. Store dekglaasjes in ethylalcohol en gebruik ze binnen twee weken.
  3. PEGylatie van het dekglaasje
    1. Voeg 10 ml 0,1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3). Filtreer de oplossing door een 0,22 urn spuitfilter.
    2. Los 2 mg biotine-PEG-succinimidyl carbonaat (biotine-PEG-SC) en 80 mg PEG-succinimidyl valeraat (mPEG-SVG) in 350 pl van NaHCO3. Gebruik een lichte bescherming buis.
    3. Vortex de buis krachtig gedurende 10 sec, en centrifuge het op 10.000 xg gedurende 1 min te bellen te verwijderen.
    4. Spoel een glasplaatje met aceton, gevolgd door spoelen met ethylalcohol. Laat de schuif aan de lucht volledig drogen.
    5. Een druppel (50 pl) van PEG-oplossing op de schone glasplaatje. Bedek de druppel voorzichtig af met een amino-gesilaniseerd dekglaasje, zonder dat dit tot enige bubbels.
    6. Plaats dia's voor 3 uur 's nachts in een donkere, goed genivelleerd vochtige kamer bij kamertemperatuur. Gebruik een lege pipet tip houder als de kamer, met water op de bodem. Seal resterende PEG-oplossing in de buis en houd het bij 4 ° C.
    7. Spoel de gePEGyleerde dekglaasje grondig met gedemineraliseerd water. Bewaar het in een donkere en droge plaats tot gebruik.

3. Het assembleren van een Flow Kamer

  1. Fabriceren een geperforeerd acryl houder, zoals in figuur 2. Controleer of de diameter van de buis insert is 0,762 mm, en wijst een gat is een inlaat en de andereeen uitlaat (figuur 2).
  2. Plaats dubbelzijdige plakband strips (breedte 5-6 mm) op acryl houder (figuur 2), en lijn loodrecht op een inlaat- en uitlaatopening, geen storende elk kanaal gaten. Gebruik deze tape strips als multi-channel muren om kamers te maken. Schrob de tape met behulp van een pipet tip.
  3. Plaats een gePEGyleerde dekglaasje op de bovenkant om stroom kamers te maken, met de gePEGyleerde zijde omlaag.
  4. Om te voorkomen dat elke oplossing lekken, drukt u op de top van een dekglaasje over het gebied waar de dubbelzijdige tapes worden geplaatst. Add sneldrogende epoxylijm aan de randen van de kamer bovenaan en onderaan (gele kleur in figuur 2) afsluiten.
  5. Sluit een kort stukje (2,5 cm) van de buis (buitendiameter, OD, 0,042 ") om een ​​gasdichte spuit en sluit de verbinding met epoxy lijm.
  6. Sluit een lange flexibele buis (OD: 0,03 ") om de slang verbonden met de spuit en sluit de verbinding met epoxylijm.
  7. Vul het Tubing verbonden met de spuit met DI water. Zorg ervoor dat er geen luchtbel.
  8. Plaats de buis in het gat van de stromingskamer afgedicht met epoxylijm.
  9. Plaats gele punt (200 pl tip) anderzijds hole als reservoir.

4. Sample laden in Flow Kamer

Opmerking: neutravidine kan worden vervangen door andere eiwitten zoals avidine streptavidine. Alle reacties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij vermeld. Neem het monster oplossing in een gele tip, en installeer de tip met de oplossing op het gat van acryl houder (Figuur 2b).

  1. Stel het debiet van de inspuitpomp 50 pl / min. Load 20 ul avidine-eiwit (25 ug / ml in T50-oplossing, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8) en houdt deze gedurende 10 min.
  2. Belasting 20 pi van gebiotinyleerd oligodeoxynucleotiden (100 micrometer op 1 × TE), en houd het voor 10 min. Als klem transferase wordt gebruikt, slaat u de laad-van oligodeoxynucleotiden.
  3. Belasting 20 pl DNA-oplossing van stap 1 in de stroom kamer bij een stroomsnelheid van 10 pl / min en houdt deze gedurende 30 min.
  4. Was de stroom kamer met 1 x TE, en de belasting 40 pi van FP-DBP 10 (~ 80 nm).
  5. Observeer DNA onder een fluorescentiemicroscoop met een continue stroom van kleuring moleculen in 1 × TE op een 60X objectief. Gebruik 488 nm solid state laser voor excitatie van FP (eGFP) -DBP. Voor volledige stuk DNA moleculen hanteren verschillende stroomsnelheden volgens de DNA lengtes gebruikt. Breng bijvoorbeeld 50 pl / min gedurende 48,5 kbp van λ DNA, en 100 pl / min gedurende 166 kbp van T4 DNA.
    1. Voor de recycling van de acryl houder, genieten gemonteerd stroom kamers in een huishouden reinigingsmiddel 12. Verwijder tapes en epoxy met een scheermesje en wrijf met de handen om ze volledig uit te schakelen. Ontstoppen gaten met injectienaalden. Houd de houders in gedemineraliseerd water tot verder gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont twee verschillende DNA tethering methoden afhankelijk terminale structuur van het DNA-molecuul. Figuur 1a toont hoe de kleverige eindigende DNA moleculen worden gehybridiseerd met complementaire gebiotinyleerde oligonucleotiden, die worden geïmmobiliseerd op de met avidine beklede PEG oppervlak. Figuur 1b toont de toevoeging van gebiotinyleerd ddNTP en dNTP om de 3-hydroxylgroep van een stomp eindigende DNA door terminale ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een platform voor het visualiseren van lange DNA-moleculen gebiotinyleerd voor het verankeren op oppervlakken. We hebben een aanpak voor het DNA-moleculen gebonden aan een avidine eiwit gecoate oppervlak met gebiotinyleerd runderserumalbumine. 6 In de eerdere benadering gemeld, vonden we een cruciale kwestie van DNA foto-splitsing veroorzaakt door bis-intercalatie kleurstoffen die DNA-moleculen vlekken vastgebonden op de oppervlak. Aangezien deze voortdurend opgewonden fluoroforen hebben e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Sogang University Research Grant van 201410036.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. DNA Biotinylering
1.1) Biotinylering van blunt-end DNA met behulp van Terminal Transferase (TdT)
Terminal TransferaseNew England BiolabsM0315SWordt geleverd met 10x reactiebuffer, 2,5 mM kobaltchloride
Biotin-11-dUTPInvitrogenR0081Biotin-ddNTP is ook beschikbaar
T4GT7 Fag DNANippon Gene318-03971
Ethyleen-diaminetetraazijnzuurSigma-AldrichE6758EDTA
1.2) Biotinylering van sticky end DNA met behulp van DNA Ligase
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202SWordt geleverd met 10x reactiebuffer
Lambda Fag DNABioneerD-2510Ook beschikbaar bij New England Biolabs
2. Functionele oppervlaktederivatisatie
2.1) Piranha-reiniging
DekglasMarienfeld-Superior010105022 mm x 22 mm, No. 1 Dikte
Teflon rekAangepaste fabricage
PTFE draadverbindingstapeHan Yang Chemical Co. Ltd.3032292Teflon™ tape
ZwavelzuurJin Chemical Co. Ltd.S280823H2SO4, 95% Zuiverheid
WaterstofperoxideJin Chemical Co. Ltd.H290423H2O2, 35% in water
SonicatorDaihan Scientific Co. Ltd.WUC-A02HTafel-ultrasoonreiniger
2.2) Aminosilanisering op glasoppervlak
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethyleendiamine		Sigma-Aldrich104884
Glazuur AzijnzuurDuksan Chemicals41499% Zuiverheid
Methyl AlcoholJin Chemical Co. Ltd.M30031899,9% Zuiverheid
Polypropyleen ContainerQorpakPLC-04907
Ethyl AlcoholJin Chemical Co. Ltd.A30020299,9% Zuiverheid
2.3) PEGylering van het dekglas
Natrium BicarbonaatSigma-AldrichS5761
SpuitfilterSartorius16534----------K
Biotin-PEG-SCLaysan BioBiotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVGLaysan BioMPEG-SVA-5000
AcetonJin Chemical Co. Ltd.A30012999% Zuiverheid
MicroscoopglazenMarienfeld-Superior1000612~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Het samenstellen van een flowkamer
Acrylic OndersteuningAangepaste fabricage
Dubbelzijdig Plakband3MTransparant type
Sneldrogende epoxy3M
Polyethyleen buisCole-Parmer06417-11, 06417-21
Gasdicht 250 µl SpuitHamilton81165
SpuitpompNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
4. Bemonstering laden in de flowkamer
NeutravidinThermo Scientific31000
Tris baseSigma-AldrichT1503-5KGTrizma base
MicroscoopOlympusIX70
EMCCD CameraQ ImagingRolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)OxxiusLBX488
AlconoxAlconox Inc.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA VisualizationSurface tethered DNA MoleculesBiotinylated DNAAvidin Protein LinkersPolyethylene Glycol CoatingMicrofluidic Shear FlowFluorescent MicroscopyDNA StretchingFlow Chamber Assembly

Gerelateerde artikelen