Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van Drosophila Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli In Vivo

Samenvatting

Scherpe micro-elektroden maken nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van fotoreceptor en visuele interneuron-output in levende Drosophila mogelijk. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om hoogwaardige spanningsresponsen van individuele cellen op gecontroleerde lichtstimulatie op te nemen. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van neurale informatieverwerking in samengestelde ogen van insecten.

Samenvatting

Voltageresponsen van insectenfotoreceptoren en visuele interneuronen kunnen nauwkeurig worden opgenomen met conventionele scherpe micro-elektroden. De hier beschreven methode stelt de onderzoeker in staat om langdurige (van minuten tot uren) hoogwaardige intracellulaire reacties van enkele Drosophila R1-R6 fotoreceptoren en Large Monopolar Cells (LMC's) op lichtstimuli te meten. Omdat het opnamesysteem weinig ruis heeft, kan het worden gebruikt om de variabiliteit tussen individuele cellen in het vliegenoog te bestuderen en hoe hun uitgangen de fysische eigenschappen van de visuele omgeving weerspiegelen. We schetsen alle belangrijke stappen bij het uitvoeren van deze techniek. De basisstappen bij het bouwen van een geschikte elektrofysiologische set-up voor opname, zoals het ontwerp en de selectie van de experimentele apparatuur, worden beschreven. We leggen ook uit hoe u zich kunt voorbereiden op opname door geschikte (scherpe) opname- en (blunde) referentie-elektroden te maken. Er worden details gegeven over hoe u een intacte vlieg in een op maat gemaakte vlieghoud kan bevestigen, een klein venster in zijn oog kunt voorbereiden en een opname-elektrode door dit gat kunt inbrengen met minimale schade. We leggen uit hoe u het centrum van het receptieve veld van een cel kunt lokaliseren, de bestudeerde cel donker- of lichtaan kunt aanpassen en de spanningsreacties ervan op dynamische lichtstimuli kunt opnemen. Ten slotte beschrijven we de criteria voor stabiele normale opnames, tonen we kenmerkende hoogwaardige spanningsreacties van individuele cellen op verschillende lichtstimuli, en definiëren we kort hoe u hun signaalprestaties kunt kwantificeren. Veel aspecten van de methode zijn technisch uitdagend en vereisen oefening en geduld om te beheersen. Maar eenmaal geleerd en geoptimaliseerd voor de experimentele doelstellingen van de onderzoeker, levert het uitstekende in vivo neurofysiologische gegevens op.

Inleiding

De fruitvlieg (Drosophila melanogaster) facetoog is een geweldig model systeem om de functionele organisatie van fotoreceptoren en interneuron arrays voor neurale beeld bemonstering en verwerking te onderzoeken, en voor dierlijke visie. Het systeem heeft de volledigste bedradingsschema ^1,2 en vriendelijk genetische manipulaties en nauwkeurige neurale activity monitoring (hoge signaal-ruisverhouding en tijdsresolutie) ^3-10.

De Drosophila oog is modulair, met ~ 750 ogenschijnlijk gewone lens bedekte structuren, genaamd ommatidia, die samen zorgen voor de een panoramisch gezichtsveld dat bijna elke richting rond haar hoofd bedekt vliegen. Primaire informatie van het oog bemonstering units zijn de rhabdomeric fotoreceptoren ^7,8,11. Elke ommatidium bevat acht fotoreceptorcellen (R1-R8), die dezelfde facet lens delen maar zijn afgestemd op de zeven verschillende richtingen. Terwijl de buitenste fotoreceptoren R1-R6 are meest gevoelig voor blauw-groen licht, spectrale gevoeligheden van de binnenste cellen R7 en R8, die op de top van elkaar en wijzen in dezelfde richting liggen, vertonen drie verschillende subtypes: licht, geel en dorsale randgebied (DRA) ^{12- 15.}

Figuur 1. functionele organisatie van de Drosophila Eye. (A) De twee eerste optische ganglia, retina en lamina, worden grijs gemarkeerd in de vlieg oog. Retina R1-R6 fotoreceptoren en lamina Grote Monopolair Cells (LMCS: L1-L3) zijn gemakkelijk toegankelijk in vivo conventionele scherpe micro-elektrode opnames. Het schema elektrode wijst op de normale weg te nemen van R1-R6 in het netvlies. Één pad opnemen LMCS in de lamina te verschuiven gelijktijdig de elektrode naar links. (B) Lamina is een matrix van retinotopically orgelized patronen, die elk verpakt met neuronen die informatie verwerkt van een bepaald klein gebied in de visuele ruimte. Als gevolg van neurale superpositie, zes fotoreceptoren uit verschillende naburige ommatidia sturen hun axonen (R1-R6) naar dezelfde lamina cartridge, de vorming van histaminerge uitgang synapsen aan L1-L3 en een amacrine cel (Am). (C) De verspreiding van neurale informatie tussen R1-R6 axon terminals en de visuele interneuronen (inclusief L4, L5, Lawf, C2, C3 en T1), in een lamina cartridge complex. (D) R1-R6 fotoreceptor axonen ontvangen synaptische feedback van L2 en L4 monopolaire cellen. (B) en (C) gewijzigd ten opzichte van Rivera-alba et al ^2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De Drosophila oog is van de neurale superpositie soort ^16. Dit betekent tpet de neurale signalen van acht fotoreceptoren die tot zeven naburige ommatidia, die gericht zijn op hetzelfde punt in de ruimte, worden samengevoegd in een neurale cartridge in de komende twee neuropils: de lamina en merg. Terwijl de zes buitenste fotoreceptoren R1-R6 project hun axon terminals neurale kolommen in de plaat (figuur 1), R7 en R8 cellen omzeilen deze laag en maakt synaptische contacten met hun overeenkomstige medulla kolom ^17-19. Deze exacte bedradingen produceren neurale substraat voor het in kaart brengen van retinotopische vlieg vroege gezichtsvermogen, waarna elke plaat (Figuren 1A-C) en medulla kolom (patroon) een enkel punt in de ruimte.

In de lamina ^1,2,20 en amacrine Cell (Am): directe input van R1-R6 fotoreceptoren worden ontvangen door de grote monopolaire cellen (L1, L2 en L3 LMCS). Uit deze, L1 en L2 zijn de grootste cellen, bemiddelen belangrijke informatie trajecten (figuur 1D), whilech reageren op on- en off-bewegende randen, en vormen de rekenkundige basis van de bewegingsmelder ^21,22. Gedragsexperimenten stelt op tussenliggende contrast, de twee wegen waarneming van beweging van tegengestelde richtingen te vergemakkelijken: back-to-front in L1 en front-to-back in T2 cellen ^23,24. Connectiviteit impliceert verder dat L4 neuronen cruciale rol kunnen spelen in de laterale communicatie tussen naburige cartridges ^25,26. Wederzijdse synapsen gevonden tussen L2 en L4 cellen in hetzelfde en twee aangrenzende patronen. Stroomafwaarts elke cel L2 en L4 drie geassocieerde cellen hun axonen projecteren van een gemeenschappelijke doelstelling, de Tm2 neuron in de medulla, waarbij ingangen van naburige patronen worden verondersteld te integreren voor de verwerking van voor naar bewegende ^27. Hoewel L1 neuronen ontvangen input van dezelfde cartridge L2S via zowel gap kruispunten en synapsen, zijn ze niet direct verbonden met L4S en dus aangrenzende lamina cartridges.

Synaptic geven aan R1-R6 fotoreceptor axonen alleen worden verleend door neuronen die behoren tot de L2 / L4 circuits, maar niet de L1 pathway ^1,2 (figuur 1D). Terwijl hetzelfde patroon verbindingen selectief van L2 R1 en R2 en van L4 tot R5, alle R1-R6 fotoreceptoren ontvangen synaptische reacties van L4 van beide of beide naburige patronen. Verder zijn er sterke synaptische verbindingen van Am R1, R2, R4 en R5 en gliacellen ook synaptisch verbonden met het netwerk en kan dus deelnemen neurale beeldverwerking ^6. Tenslotte axonale gap-junctions, koppelen aangrenzende R1-R6 en tussen R6 en R7 / R8 fotoreceptoren in de lamina, bijdragen tot de asymmetrische informatieweergave en verwerking in elke patroon ^14,20,28.

Intracellulaire spanning opnames van individuele fotoreceptoren en visuele interneuronen in bijna intact Drosophila bieden een hoge signaal-ruis ratie gegevens op sub-milliseconde resolutie ^3,5,7-10,29, die nodig zijn voor het begrijpen van de snelle neurale berekeningen tussen de aangesloten neuronen is. Dit niveau van nauwkeurigheid is onmogelijk door de huidige optische beeldvormende technieken, die aanzienlijk luidruchtiger zijn en typisch werken op 10-100 msec resolutie. Bovendien omdat de elektroden erg klein en scherpe punten, de werkwijze is niet beperkt tot cellichamen, maar kan direct opnamen van kleine actieve neurale structuren; zoals dendritische bomen de LMCS of fotoreceptor axonen, die niet toegankelijk is voor veel grotere uiteinden van patch-clamp elektroden. Belangrijk is dat de methode is ook structureel minder invasief en schadelijk dan de meeste patch-clamp-toepassingen, en dus bij minder de bestudeerde cellen intracellulaire milieu en informatie over bemonstering. Zo zijn conventionele scherpe micro-elektrode technieken bijgedragen, en blijven bijdragen, fundamentele ontdekkingen en originele inzicht in de neurale informatie verwerking op het juiste moment schaal; het verbeteren van onze mechanistische begrip van de visie ^3-10.

Dit artikel wordt uitgelegd hoe in vivo intracellulaire opnamen van Drosophila R1-R6 fotoreceptoren en LMCS worden uitgevoerd in de Juusola laboratorium. Dit protocol beschrijft hoe een geschikte elektrofysiologie rig te bouwen, de voorbereiding van de vlieg, en het uitvoeren van de opnames. Sommige representatieve gegevens worden gepresenteerd, en een aantal veelvoorkomende problemen en mogelijke oplossingen besproken die zich kunnen voordoen bij het gebruik van deze methode.

Protocol

Het volgende protocol voldoet aan alle richtlijnen van de Universiteit van Sheffield en de Beijing Normal University Animal Care.

1. Reagentia en apparatuur voorbereiding

1. Opnemen en Light Stimulatie Equipment Setup
   1. Kies ten minste een 2,5 x 2,5 m opname ruimte voor het uitvoeren van elektrofysiologische experimenten in een kamer die airconditioning met geregelde luchtvochtigheid heeft en de middelen om donkere opname-omstandigheden. Zorg ervoor dat dit gebied is groot genoeg om comfortabel te passen in een: (i) 1 x 1 m vibratie-isolatie tafel die herbergt het tuig [vliegen stimulatie en opname-inrichting], stereomicroscoop en een koude lichtbron met twee ganzen halzen, alle afgesloten binnen een grote> 180 cm lang kooi van Faraday; (Ii) een 38U rack-apparatuur voor het onderbrengen van een personal computer met een platte LCD-monitor, micro-elektrode versterker, LED-drivers, filters, temperatuur controle-eenheden, oscilloscopen en andere vereiste elektrische instrumenten; en (iii) eenklein bureau en een stoel voor de onderzoeker.
   2. Plaats het tuig ver weg van elektrische en mechanische geluiden bronnen, zoals koelkasten, centrifuges en liften. Gebruik aparte surge protectors om elektrische apparaten het tuig te beschermen tegen spanningspieken optreden in het lichtnet. Idealiter sluit het tuig om zijn eigen Uninterruptible Power Supply (UPS-batterij) om ruis te minimaliseren.
   3. De bouw van een conische fly-houder van messing en zwarte kunststof (figuur 2). Boor een kleine taps toelopende gat door de koperen unit met haar externe rand vernauwing tot ~ 0,8 mm diameter (matching thorax breedte een typisch vlieg).
      Opmerking: Dit gat moet taps naar de punt van de fly-houder zodat een groter dan gemiddeld Drosophila, die wordt geprojecteerd van onderaf door luchtstroom, geplakt schouder-diep aan de bovenrand zou krijgen.
   4. Ontwerpen en bouwen een mechanisch robuuste en nauwkeurige, vliegen stimulatie en registratieapparaat (figuur 3). Construct uit of aluminium of messing (hoge geleidbaarheid metalen) een vlieg voorbereiding platform paal en eromheen een Cardan-arm-systeem, met geïntegreerde kogellagers, soepele en nauwkeurige x, y-positionering en vergrendeling van het licht stimulans.
      Opmerking: Dit geïntegreerde composiet ontwerp minimaliseert mechanische trillingen, die anders de registratie-elektrode tip uit kon verjagen van de bestudeerde cel. Het kan verder zijn voorzien van een Peltier-element gebaseerde close-loop temperatuurregeling, waarmee onderzoekers om temperatuurgevoelige genetische constructen, zoals shibire ^TS gebruikt, ter beoordeling van synaptische circuit berekeningen ^9,30. Anodiseren het apparaat of Paint It Black aan het licht stimulus scatter minimaliseren.
      1. Fix the fly stimulatie en opname-apparatuur op breadboard de anti-vibratie tafel; bijvoorbeeld door het M6-bouten, met behulp van de metrische schroefgaten. Gebruik een zwarte breadboard of in te pakken met zwarte stof om lichtverstrooiing te minimaliseren tijdens de experimenten.
      2. position en slot (gebruik van het slot schroef) een verticaal verstelbaar voorbereiding fly platform paal in het midden van een Cardan-arm-systeem. Plaats de fly-preparaat (binnen de fly-houder, zie stap 2) op het platform paal, zodat de lichtbron aan de Cardan-arm radiaal wijst op het hoofd van de vlieg. Zorg ervoor dat het centrum van de vlieg ogen is precies op het snijpunt (0, 0) van x- de Cardan-arm en y-assen, want dit maakt een nauwkeurige x, y-positionering van het licht stimulans voor elk punt binnen de vlieg gezichtsveld.
         Opmerking: Deze functionaliteit die nodig zijn voor het in kaart brengen van de respons eigenschappen van individuele cellen aan specifieke oog locaties is, bijvoorbeeld bij het ​​zoeken naar elektrofysiologische bewijs voor structurele aanpassingen, zoals lichte of acute zones, die het verhogen van de gevoeligheid of de resolutie, respectievelijk ³¹ zou laten zien.
   5. Monteer de stereomicroscoop achter de fly stimulatie en opname apparatuur op de anti-vibratie tafel zodatdie het biedt comfortabele hoge vergrotingsfactor bekijken van de vlieg oog.
   6. Monteer de koude lichtbron op de top van de microscoop met de lichtbron dual head halfharde zwanenhals lichtgeleiders naar beneden wijst in de richting van de voorbereiding fly houder. Vrij beweegbaar twee bundelverlichting vergemakkelijkt de opname elektrode zichtbaar wordt bij het rijden door een kleine opening in de vliegenooglens.
   7. Bevestig een geschikte x, y, z-micromanipulator set (grof en fijn) voor de registratie-elektrode en het hoofd-etappe op de anti-vibratie tafel, aan de rechterzijde van de vlieg stimulatie en opname-apparatuur, met behulp van M6-bouten of magnetische staat.
      Opmerking: In de Juusola laboratorium worden verschillende rigs uitgerust met verschillende manipulatoren; voor meer informatie zie de tabel van materialen en reagentia. Deze bieden alle hoogwaardige intracellulaire opnames.
   8. Monteer een kleine handmatige 3-assige micromanipulator voor de referentie-elektrode houder op de hoogte verstelbare fly voorbereiding platform pole. Oriënteren de referentie-elektrode, zodat deze wijst naar de vlieg preparaat.
   9. De bouw van een vrijstaande licht afgeschermde kooi van Faraday van stalen panelen rond de anti-vibratie tafel, rond de vlieg stimulatie en opname-apparatuur, met externe elektromagnetische interferentie te voorkomen. Laat de voorzijde van de open kooi, die toegang tot de vlieg voorbereiding voor de experimenten transporteren. Bevestig zwarte stof gordijnen (met koper- of aluminium-mesh geïmplanteerd in hen te aarden) aan de voorzijde af te schermen lawaai en licht. Verf het inwendige van de kooi zwart naar lichtverstrooiing minimaliseren en grendel de voeten van de kooi op de vloer trillingvrij.
   10. Sluit de spanning en stroom van de uitgangen hoogohmige intracellulaire micro-elektrode versterker aan de ingangen van twee afzonderlijke laagdoorlaatfilters (Bessel of dergelijke) via BNC-kabels. Ook sluit het filter uitgangen in de juiste kanalen van de AD-connector blocks / raden van bestuur van de data-acquisitie systeem (DA / AD-kaarten). Sluit de DA / AD kaart (en) in een personal computer door gespecialiseerde kabels, volgens de leverancier handleidingen.
   11. Installeer de juiste acquisitie software voor de data-acquisitie systeem van keuze op de personal computer. Zorg ervoor dat de data-acquisitie drivers compatibel zijn met het besturingssysteem dat op de personal computer.
   12. Ground elektrisch the fly stimulatie en opname-apparatuur, kooi van Faraday, koper mesh (binnen de gordijnen), microscoop, micromanipulators, koude lichtbron, 38U apparatuur rack met alle instrumenten (de intracellulaire versterker, filters, temperatuur controle-eenheid, PC en LCD monitor etc.) naar één centraal punt grond met behulp van apparatuur aarden draad en M6 krimp ring aarding eindigt. Gebruik een elektrische multimeter om te testen of alle onderdelen zijn in dezelfde grond.
       Opmerking: Om de best mogelijke low-noise opnameomstandigheden te bereiken, de aarding configuraties typisch variëren weerm een ​​set-up naar de andere.
       1. Indien nodig, sluit de centrale grond punt verder aan de bouwgrond en / of centrale grond van de micro-elektrode versterker. Na het testen van de volledig functionerend systeem tijdens echte elektrofysiologische experimenten, bereid zijn om de aarding configuratie te wijzigen als nodig is om ruis in de opnames te minimaliseren.
   13. Configureren software amplificatie (1 - 10x), signaalfiltering (meestal laagdoorlaatfilters ingesteld op 500 Hz, die geschikt is voor zowel R1-R6 en LMC data), en bemonsteringsfrequentie (tenminste 1 KHz). Zorg ervoor dat de instellingen gehoorzamen Nyquist-Shannon sampling theorema ^32; bijvoorbeeld wanneer het verzamelen van gegevens die laagdoorlaat-gefilterd bij 500 Hz, gebruikt een bemonsteringsfrequentie van 1 kHz of hoger om aliasing te minimaliseren.
       1. Zoals kenmerkend spanning reacties van R1-R6 fotoreceptoren zijn 40-65 mV, en die van LMCS 20-45 mV, stelt u de versterking en het display schalen dienovereenkomstig hoge resolutie sampli mogelijk te makenng en data visualisatie.

Figuur 2. Conische Fly-houder De fly-houder bestaat uit twee delen:. De centrale koperen unit en de conische zwarte plastic jas. Het centrale gat in de koperen unit versmalt tot een kleine diameter die nauwelijks laat de fly door. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Overzicht van de elektrofysiologische Rig. De set-up bevat een vrijstaande licht afgeschermde kooi van Faraday, de anti-vibratie tafel, the fly stimulatie en opname-apparatuur, en zwarte stof gordijnen met koper- of aluminium-mesh binnen voor aarding. de instrument rack is elektrisch aangesloten op dezelfde centrale grond met alle apparatuur binnen de kooi van Faraday. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. vervaardigen van micro-elektroden
   1. Trek de referentie micro-elektrode uit filamented borosilicaat (buitendiameter: 1,0 mm; inwendige diameter van 0,6 mm) of kwartsglas (buitendiameter: 1,0 mm; inwendige diameter van 0,5, 0,6 of 0,7 mm) buis met een pipet trekker instrument. Probeer een korte geleidelijke taper bereiken.
      Opmerking: De precieze instellingen van de pipet trekker programma variëren van instrument naar instrument; meer details in de tabel van Materialen en regenten. De poriegrootte aan het uiteinde is niet cruciaal omdat de punt van de referentie-elektrode worden afgebroken voordat ze in de vlieg preparaat wordt ingebracht.
   2. Trek de opname van micro-elektrode filamented borosilicaat (buitendiameter: 1,0 mm; binnendiameter 0,6 mm) of kwartsglas (buitendiameter: 1,0 mm, binnendiameter 0,5, 0,6 of 0,7 mm) buis pipetteren trekker instrument. Probeer een lange bereiken (10-15 mm) prima geleidelijke taper.
   3. Inspecteer met een lichtmicroscoop dat de registrerende elektroden tonen juist afbouwen. Monteer de elektrode op een glasplaatje met vormbaar lijm en gebruiken 40X objectieve lucht om de punt te inspecteren.
      Opmerking: Een goede elektrode taps vlot tot zijn onzichtbaar kleine tip, waarrond continu parallel donkere en lichte interferentie patronen kunnen worden gezien. Sommige puller instellingen genereren grote weerstand elektroden, die een succesvolle cel penetraties niet kan opleveren omdat hun tips lijken "trompetten". Aldus visueel onderzoek van de elektroden is belangrijk.
   4. Bevestig de elektroden horizontaal op een grote Petri-schaal met boetseerklei (of soortgelijke vormbaar lijm) voor de bewaring en het transport naar de elektrofysiologie rig. Zorg ervoor dat de elektrode tips eenre altijd in de lucht en niet per ongeluk iets aan te raken.
   5. Back-vul de opname en referentie-elektroden net voor het experiment met de juiste zoutoplossing. Gebruik een kleine 5 ml spuit verbonden met een kleine deeltjes- filter met een fijne plastic tip (zoals een microloader).
      1. Voor experimenten fotoreceptoren, vul de registratie-elektrode tot volledige (een druppel vormt bij het brede uiteinde) met 3 M KCl oplossing omdat dit het effect van vloeibare junction potentieel om de geregistreerde spanning minimaliseert.
      2. Onderzoeken van de histaminerge LMCS, die reageren op synaptische input van R1-R6 fotoreceptoren door chloride conductantie-veranderingen, vul de registrerende elektroden met 3 M kaliumacetaat en 0,5 mM KCl, omdat deze oplossing minder effect op de cel chloride batterij. Vul het referentie-elektrode met fly Ringer, die in mm: 120 NaCl, 5 KCl, 10 TES (C ₆ H ₁₅ NO ₆ S), 1,5 _CaCl2, 4 _MgCl2 en 30 sucrose ^5.
   6. Weerstand van een nieuw getrokken registratie-elektrode in het registratiesysteem.
      1. Zorg ervoor dat de zilveren draden in de elektrode-houders gelijkmatig zijn bedekt met zilver chloride (die te zien zijn paars-grijs - niet glanzend zilveren) om de opname artefacten (zoals drift in de kruising potentiële) te minimaliseren. Zo niet, vervang ze met de juiste chloridized draden.
      2. Indien nodig, chloridize nieuwe zilveren draden. Reinig de draden (door hen te snel passeren van een vlam), zodat deze helderder in zilver van kleur. Raak ze met de vingers, zodat afzetten op een gelijkmatige laag AgCl. Week de draden in volle kracht bleekmiddel voor 15-30 minuten tot ze paars-grijze kleur verschijnen. Alternatief galvaniseren elke draad (door ze positief ten opzichte van een oplossing die 3 M KCl en een stroom doorheen een snelheid van 1 mA / ^cm2 oppervlak) gedurende 10 - 15 seconden totdat voldoende bekleed.
      3. Sluit de back-gevulde opnemen en referentie-elektroden aan hun elektrode-houders. Plaats een kleine Ringer's oplossing bad op de in hoogte verstelbare voorbereiding fly platform pole. Rijd de elektrode tips in de oplossing van de Ringer's en meet tip weerstand van de registratie-elektrode is.
         Opmerking: Deze stap is alleen nodig wanneer het testen van de resistieve eigenschappen van elektroden die zijn getrokken uit een nieuwe serie glasbuizen of bij het optimaliseren van de micro-elektrode trekker instrument programma's via iteratie.
      4. Voor het uitvoeren van de weerstand metingen, lees de instructies in de versterker vervaardiging van de gebruikershandleiding voor de juiste meting instellingen. Voor een goede registratie-elektrode, een tip weerstand van ~ 100-220 MQ.

2. Drosophila Voorbereiding

1. Verzamel 5-10 dagen oud vliegen (na eclosion) en leg ze in een schone vlieg buis met stAndard voedsel. Het is mogelijk om goede opnames bereiken jongere vliegen ook zelfs de "pasgeborenen"; maar vanwege hun zachtere ogen, het snijden van een hoornvlies opening voor de registratie-elektrode is moeilijker.
2. Construct een vlieg vangen buis en een vlieg voorbereiding staan ​​(figuur 4). Zie figuur 4 voor het algemene idee van hoe deze zelfgemaakte instrumenten bij elkaar werden gezet.
   1. Om een ​​vlieg vangen buis te maken, sneed het topje van conische bodem 50 ml plastic centrifugebuis's. Steek dan en lijm de grote einde van 1 ml pipet tip over deze nieuwe opening.
   2. Tot slot, snijd het smalle uiteinde van pipet tot een grootte die gemakkelijk laat een vlieg te lopen door. Raadpleeg een mechanische werkplaats om een ​​kleine vlieg voorbereidingsfase dat 2-as draaien en de vergrendeling van de fly-houder verschillende posities kunt monteren.

Figure 4. Hulpmiddelen en Devises Nodig voor het maken van de Fly Voorbereiding. Vlieg vangen buis is gemaakt door lijmen een 1 ml plastic pipet tip om een 50 ml plastic centrifugebuis. Bespoke voorbereiding fly stand maakt vrije rotatie en vergrendeling van de fly-houder in een voorkeurspositie voor het bereiden van de vlieg. De vlieg wordt vastgesteld door bijenwas, met behulp van de elektrische wax-kachel. Vaseline is door een kleine applicator gemaakt door het aansluiten van een dikke soort haar op een handvat aangebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Verzamel een vlieg voor het experiment in een 1 ml pipet tip, die nauwelijks in staat stelt een vlieg om door te passen. Bevestig de vlieg vangen buis, met de pipet tip op, om de vlieg buis. In een vlieg vangen, profiteren van hun inherente neiging om omhoog te klimmen (antigravitaxis) in de pipet tip. Bij voorkeur is, selecteert u de grootste vrouwelijke, de grootte materies in elektrofysiologie.
   Opmerking: Hoe groter de vlieg, hoe groter de cellen en hoe groter de kans voor hoogwaardige intracellulaire recordings. Kleinere vliegen (zowel mannen als vrouwen) kunnen ook uitstekende opnames, maar de bereiding is moeilijker te maken. Zodra de vlieg is gevangen in een grote pipet tip, vergeet niet om de vlieg tube sluiten voor andere vliegen te stoppen ontsnappen.
4. Sluit een 100 ml spuit met een flexibele kunststof slang aan de grotere opening van de pipetpunt - met de vlieg er nog in.
5. Plaats het smalle uiteinde aan de grote pipetpunt, die is vergroot maar een Drosophila door te laten, om de opening in de bodem van de fly-houder en knijp een kleine hoeveelheid lucht uit de spuit om de vliegen in de fly-houder uitgeworpen .
   1. Kijk door de stereomicroscoop en voorzichtig beheer van meer lucht totdat het hoofd van de vlieg uitsteekt vanaf het conische einde van de fly-houder. Zorg ervoor dat de vlieg stevig gevangen uit de thorax naar het kleine opening op de bovenkant van de fly-houder.
6. Gebruik een wax heater aan de vlieg met bijenwas vast uit zijn "schouders" om de fly-houder. Regel de temperatuur van de was verwarming zo laag zijn mogelijk nog schoon de was te smelten.
   Opmerking: Wanneer de temperatuur juist is, de was wordt transparant. Een te hoge temperatuur maakt de was "weg te branden"; te laag houdt de was stijf. Bij de vaststelling van de vlieg, waarheidsgetrouw en kort langdurige hitte blootstelling kan beschadigen. Met behulp van licht uitgeharde tandheelkundige lijm is hier niet aanbevolen als de toepassing ervan is te traag.

Figuur 5. De voorbereiding van de Vlieg voor in vivo experimenten. Links, het hoofd 's A Drosophila is rechtstreeks geplaatst in de fly-houder en van zijn slurf, rechter oog en schouders bevestigd aan de fly-houder met verwarmdeswax. Juist, een kleine opening wordt gesneden in het dikste deel van het oog, net boven de evenaar en op slechts een paar ommatidia afstand van de achterkant cuticula, met een scherp scheermes rand. Een stuk van het hoornvlies wordt voorzichtig verwijderd en het gat afgedicht met vaseline om te voorkomen dat het oog van opdrogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Immobiliseren het hoofd van de vlieg. Toepassen bijenwas de slurf (figuur 5) en de hoek van het rechteroog, het vermijden van de cornea, en bevestig de kop van deze punten aan de fly-houder.
8. Maak een micro-mes. Klem een ​​niet-roestvrij stalen scheermesje met twee blade-houders / breakers (beide met flat grip) en crack een kleine strook van zijn scherpe rand. Voor de gezondheid en veiligheid, gebruiken Goggles voor oogbescherming (ook al is het zeer onwaarschijnlijk dat stukken afketsen als het scheermes is gebarsten). Ideaal,produceren een scherp scheermes rand die een spits lijkt. Zorg ervoor dat deze "spits" stevig is bevestigd aan het blad-houder, maar wees voorzichtig om elke zichzelf letsel te voorkomen!
9. Met behulp van de micro-mes, bereiden een kleine opening omvang van de weinige ommatidia in linkeroog van de vlieg - op ongeveer 4-5 ommatidia van de dorsale cuticula net boven de evenaar van het oog om de doorgang voor het opnemen micro-elektrode te bieden. Presteren onder een stereomicroscoop, het bekijken van de voorbereiding met een hoge vergrotingsfactor.
   Let op: Omdat de vlieg oog voelt elastisch en resistieve te sonderen, het gat is het beste model met een "spits" -knife. De snij-techniek is heel uitdagend, dus besteden veel aandacht aan de video demonstratie. Het houden van de fly-houder in bepaalde oriëntaties (in de vlieg voorbereiding standaard) kan de dissectie gemakkelijker te maken. In eerste instantie kan de microchirurgie moeilijk te leren voelen, maar eenmaal gepleegd, neurale aanpassing verbetert trapsgewijs de onderzoeker 3D-waarneming en behendigheid.
10. Remove zorgvuldig het kleine stukje van het hoornvlies van de opening die net werd gesneden, waardoor de retina eronder. Snel dekken het gat in het oog met een kleine klodder vaseline met behulp van de fijne haren van de vaseline applicator.
    Opmerking: Vaseline bedient meerdere rollen hier. Het voorkomt weefsel dehydratie en coagulatie van de hemolymfe van de ingebrachte registratie-elektrode zou breken. Ook overigens bedekt de micro-elektrode, waardoor de intramurale capaciteit. Dit kan de frequentierespons van het opnamesysteem verhogen en daarmee de temporele resolutie van het opgenomen neurale signalen. Vermijd vegen vaseline over de rest van het oog als deze vervaagt de optiek.

3. Opnemen van R1-R6 Fotoreceptoren of LMCS

1. Altijd geaard bent als het bedienen van de micro-elektrode versterker (bijvoorbeeld door het aanraken van het metalen oppervlak van de kooi van Faraday of trilling tabel), omdat deze zich verzet tegen een per ongeluk te leverening een statische lading op het hoofd-fase, die de schakelingen zouden kunnen beschadigen.
2. Verlichten de voorbereiding vlieg platform pole van bovenaf door twee zwanenhals lichtgeleiders (figuur 6A) (met de koude lichtbron in de kooi van Faraday), zodat de fly-houder kan worden op de paal in de gewenste positie onder nauwgezette visuele controle geplaatst .

Figuur 6. Plaatsing van de Fly-houder en de elektroden voor de experimenten (AB) De fly-houder wordt gelegd op de opname platform dat levert ook temperatuurregeling via een Peltier-element (A: witte ronde platform in het midden).. De Cardan-arm maakt nauwkeurige positionering van de lichtstimulus op gelijke afstand (via x, y-rotatie) rond de vlieg, met de lichtbron (een vloeistof of kwarts vezeloptische bundel end) wijst direct naar zijn oog. In veel van our rigs wordt licht gegenereerd door stimulatie LEDs (met lineaire stroom-drivers) of door een monochromator. Zo hun stimuli dragen een specifiek (-band gepasseerd) spectrale inhoud, geselecteerd tussen 300-740 nm en bedek 4-6 log intensiteit unit bereik (zoals verzwakt door afzonderlijke neutrale dichtheid filters). (C) twee micro-elektroden, bestuurd door afzonderlijke micromanipulators, zijn gepositioneerd in de vlieg hoofd: de referentie-elektrode (boven) door de ocelli; de registratie-elektrode (links) door de kleine opening in het linkeroog. (D) Voor het verkrijgen van een maximum aantal fotoreceptor opnamen, wordt de opname micro-elektrode gedreven in het gat, evenwijdig aan de slurf ocellus-as. Wanneer de elektrode doordringt en afdichtingen een fotoreceptor, de vrij draaibare lichtbron is bevestigd aan de positie waar de cel produceert de maximale spanning tot een potentieel lichtstimulus. Dit punt in de ruimte ligt in het centrum van receptieve veld van de cel. Als het gat is dichtbij de cuticula, LMC doorvoeringen kunnen verder worden bereikt met dezelfde hoek elektrode (links). Als het gat verder van de cuticula, een andere nuttige elektrode benadering hoek ten opzichte van LMC opnames te verkrijgen is ook te zien (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Monteer de fly-houder (met de vlieg in het!) On the fly voorbereiding platform pole. Draai de fly-houder, zodat linkeroog van de vlieg direct wordt geconfronteerd met de onderzoeker (figuur 6B).
4. Steek de botte referentie-elektrode zachtjes door Occelli van de vlieg in het hoofd capsule met een kleine grove micromanipulator met inachtneming van de voorbereiding door de stereomicroscoop (figuur 6C). Druk niet op de elektrode te diep, omdat dit de vlieg hersenen kunnen beschadigen.
   1. Als alternatief, plaatst u de referentie-elektrode in de achterkant van de thorax. Altijd, ervoor te zorgen dat de vlieg verschijnt heathy (beweegt zijn antennes) en zijn ogen zijn intact; niet per ongeluk beschadigd. Indien het preparaat minder dan onberispelijk uitziet, bereidt een nieuwe fly voor de experimenten.
5. Rijd de scherpe opname micro-elektrode in het linker oog door de vaseline bedekt kleine opening eerder voorbereid. Gebruik een sterke vergroting van de stereomicroscoop en beweeg de lichtgeleiders en de focal plane, zodat de elektrode tip locatie wordt duidelijk in 3D door de reflectie patronen.
   Opmerking: Figuur 6D toont hoe het hoofd van de vlieg iets anders moet worden geplaatst (met betrekking tot de hoek de opname micro-elektrode in het oog) voor fotoreceptor en LMC opnamen. Besturen van de elektrode in het oog zonder dat het de moeilijkste fase van het experiment. Als de elektrode mist de kleine opening in het oog, het raken van de cornea, het meestal breekt.
6. Zet de micro-elektrode versterkerzodra beide elektroden stevig in de voorbereiding, in elektrisch contact met lichaamsvloeistoffen van de vlieg.
7. Schakel de koude-lichtbron (in de kooi van Faraday) en de stekker uit het stopcontact. Sluit de stekker aan op de centrale grond te minimaliseren ground-loop opgewekte elektrische ruis, en verplaats de zwanenhals lichtgeleiders weg, zodat de Cardan-arm-systeem vrij rond-the-fly kan worden verplaatst. Schakel de kamerverlichting zodat de vlieg preparaat nu relatief donker.
8. Meet de weerstand van de registratie-elektrode in het oog (volgens de instructies in de versterker handleiding). Gebruik alleen het opnemen van elektroden waarbij weerstand 100-250 MQ.
   Opmerking: Het is vrijwel onmogelijk om een ​​hoge kwaliteit intracellulaire recordings bereiken door <70 MQ elektrode. Als de weerstand <80 MQ, is het waarschijnlijk dat de elektrode wordt verbroken. In dit geval schakelt u de versterker en verander de registratie-elektrode.
   1. Zodra de elektrodekomt en in het oog, de versterker inschakelen om de weerstand te meten. Soms kan de elektrode worden geblokkeerd door een afval omdat het weefsel binnengaat. Dit kan worden verholpen door het gebruik van capacitieve buzz en stroomstoot functies van de versterker die typisch duidelijk dat het door de snelle resonantie of afstoting.
9. Stel de versterker om de huidige-klem (CC) of bridge opnamemodus. Teniet willekeurige spanningsverschil tussen de opname- en referentie-elektroden, als beiden rust nu in de elektrisch verbonden extracellulaire ruimte, door de signaalcompensatiepotentiometer (opname spanning) naar nul. Volg het signaal te compenseren veranderingen met behulp van de versterker display-uitlezing of een oscilloscoop scherm.
10. Wacht 2-3 min voor de vlieg oog te donker aan te passen.
11. Rij de registratie-elektrode tip geleidelijk aan dieper in het oog met een kleine 0,1 tot 1 micron stappen. Doe dit met een x-as piëzo-stepper van een op afstand bestuurbare micromanipulator of by voorzichtig draaien van de fijne resolutie knop van een handleiding manipulator.
12. Het stimuleren van de vlieg oog met korte (1-10 msec) knippert als de registratie-elektrode wordt gevorderd in het weefsel.
    Opmerking: Als de registratie-elektrode is gepositioneerd in het netvlies en het oog normaal functioneert, zal elke lichtflits een korte en kleine daling in de spanning veroorzaken (0,2-5 mV hyperpolarisatie), genaamd de electroretinogram (ERG). Deze verandering in het gebied potentieel van de extracellulaire ruimte wordt veroorzaakt door gezamenlijke reactie van de retinale cellen aan licht. Echter, zodra de elektrode tip komt in de lamina, het sluiten van de LMCS, de ERG keert, het tonen depolariserende reacties.
13. Verplaats de lichtbron om de fly oog met behulp van de Cardan-arm-systeem en vind de positie waar het licht doet denken aan de grootste ERG respons.
    Opmerking: Deze positie markeert het kleine gebied in de visuele ruimte waar de fotoreceptoren (of LMCS), die naast zijn gelegen aan het uiteinde van de registratie-elektrode, Proeven van hun licht-ingang.
14. Penetreren een cel met de registratie-elektrode.
    Opmerking: De penetratie kan spontaan optreden of wanneer de elektrode micro-naar voren. Het kan verder worden vergemakkelijkt door voorzichtig de micromanipulator systeem aftappen of door de drukte-functie van de versterker; deze acties resoneren de elektrode tip in het weefsel. Wanneer de elektrode doorboort de fotoreceptor membraan betreden de intracellulaire ruimte, het spanningsverschil tussen de opname- en referentie-elektrode plotsel- van 0 mV tot -65 mV ~ (tussen -55 en -75 mV); terwijl tijdens LMC penetraties, deze daling is meestal minder (tussen -30 en -50 mV). Deze spanningsverschillen vertegenwoordigen de negatieve rust mogelijkheden van de gegeven cellen. Afhankelijk van de kwaliteit van de registratie-elektrode (de scherpte) en de celprocessen drong, kan de spanning van de registratie-elektrode snel of langzaam stabiliseren de rustpotentiaal, de celmembraanafdichtingen aan de buitenste laag van de elektrode. Maar als de penetratie slechts gedeeltelijk of arm, de elektrode glijdt gewoonlijk uit de cel met de opgenomen potentiële klimmen terug naar nul.
15. Lokaliseren het midden van receptieve veld de doorgedrongen cel wanneer de elektrode correct weergegeven afgesloten, waaruit blijkt stabiel membraanpotentiaal (donker rust potentiële). Verplaats de knipperende licht stimulus rond de vlieg oog, met behulp van de Cardan-arm-systeem, tot op het punt in de visuele ruimte, waar het licht flits roept de cel van de maximale spanning antwoord te vinden. Zet de Cardan-arm wanneer het licht stimulus direct geconfronteerd met (wijst naar) de receptieve veld centrum.
    Opmerking: In het donker, Drosophila fotoreceptoren reageren op fel licht pulsen met 40-65 mV depolariserende spanning reacties ^4,5, terwijl stabiel LMC-opnamen laten zien 20 tot 45 mV hyperpolarizing ^9,10,14 reacties. Glia penetraties kan in zeldzame gevallen gebeuren, aangegeven door <-80 mV rust mogelijkheden en veel langzameren kleinere (~ 5 mV) verzadigde licht geïnduceerde depolarisaties. Fotoreceptoren met verschillende Drosophila oog pigmentations, zoals witte ogen ⁷ en vermiljoen, vertonen vergelijkbare reactie maten wildtype.
16. Met behulp van de huidige-klem (CC) mode van de versterker, compenseren capaciteit van de registratie-elektrode door het injecteren van kleine 0,1 nA en korte (100-200 msec) stroompulsen in de bestudeerde cel om de opname artefacten te minimaliseren tijdens de membraan opladen.
    Opmerking: Deze belangrijke procedure wordt toegelicht in de versterker gebruikershandleiding en moet worden uitgevoerd met een elektrische celmodel voor de eigenlijke experimenten.
17. Record spanning reacties op lichtpulsen en andere stimuli van belang, met variërende statistische of fysieke kwaliteiten (zoals naturalistische lichtintensiteit tijdreeksen of willekeurige contrast patronen). Test, bijvoorbeeld hoe de opgenomen reacties veranderen met de licht- of donker-adaptatie.
    Opmerking: Men kan nauwkeurig light-passen de bestudeerde cel door continu licht van de vooraf geselecteerde intensiteit door toevoeging van neutrale dichtheid filters op het lichtpad ^4,5. Als alternatief voor langere dark-aanpassing het licht uit stimulus voor een vooraf ingestelde tijd. Vanwege de mechanische stabiliteit van het opnamesysteem, de kwaliteit van de registrerende elektroden en de intactheid van het preparaat, stabiele opnameomstandigheden kan soms nog vele uren. Dus op een goede dag, is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid gegevens te verzamelen bij verschillende condities aanpassing van een enkele cel. Wanneer de elektrode glijdt uit de cel, het opgenomen reacties verminderen en de gemiddelde spanning begint te benaderen nul.
18. Vooraf zorgvuldig de registratie-elektrode met fijne x-as besturing van de micromanipulator totdat de elektrode contact maakt en dringt de volgende cel (Doorgaans de dichtstbijzijnde buur neurale). Niet bewegen de elektrode langs y of z-as als deze manoeuvres de elektrode zou maken "pldoorgedreven het weefsel "zijwaarts, beschadigen eye structuren!
    Opmerking: Bij een goede elektrode en een gezonde preparaat kan men hoge kwaliteit reacties opnemen van vele fotoreceptoren (maar zelden uit vele LMCS) in dezelfde fly gedurende vele uren zo nu en dan over de gehele werkdag (> 8 uur), zonder duidelijk signaal verslechtering.
19. Gegevens opslaan van bestanden periodiek met het identificeren van informatie, zoals datum, genotype, en de opgenomen celtype. Vanwege de grote hoeveelheid gegevens die kan worden opgevangen in een succesvolle opnamesessie, houdt goede geschreven records in een lab-boek voor toekomstige gegevensanalyse.

Resultaten

De scherpe micro-elektrode opnamemethode, zoals hier ingericht voor het Drosophila oog, kan worden gebruikt om op betrouwbare wijze te kwantificeren neurale informatie en -verwerking in de retina en lamina cellen en onderlinge communicatie ^{4,5,7,8,10,33.} Door het gebruik van het aan codering in verschillende wild-type aandelen, mutanten of genetisch gemanipuleerde vlieg stammen te bestuderen, heeft de methode zijn waarde bewezen; niet alleen in het kwantificeren van de effecten van een mutatie, temperatuur, voeding of gekozen expressievector ^{3,4,6,9,10,14,30,34,} maar ook in het openbaren mechanische redenen veranderde visuele gedrag ^14,34. De methode is ook goed toepasbaar op andere insecten voorbereidingen ^35,36, empowerment neuroethological visie studies. Volgende presenteren we een paar voorbeelden van zijn succesvolle toepassingen.

Figuur 7. VoltageReacties van een Fruitvlieg R1-R6 fotoreceptorcellen een lichtpuls bij 20 en 25 ^° C. Door de scherpe micro-elektrode doorvoeringen vaak zeer stabiel, is het mogelijk om spanning reacties van dezelfde R1-R6 fotoreceptor opnemen op een bepaalde lichtstimulus bij verschillende omgevingstemperaturen door opwarmen of afkoelen van de vlieg. In onze set-ups, is de fly-houder geplaatst op een close-loop Peltier-element op basis van temperatuur-control-systeem. Dit stelt ons in staat om het hoofd temperatuur van de vlieg in enkele seconden te veranderen. Hogere temperaturen versnelt de spanning reacties en karakteristiek verlaagt de rustpotentiaal van R1-R6 fotoreceptoren (zoals aangegeven door rode pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het bestuderen van het effect van temperatuur op fotoreceptorcellen Output

Met een goed ontworpen en trillingen geïsoleerd opname-systeem, kan de werkwijze worden gebruikt voor het meten van het effect van de temperatuur op de neurale uitvoer van een individuele cel door verwarmen of koelen van de vlieg. Het gegeven voorbeeld toont spanning responsies op een heldere 10 msec lange puls, welke over een zelfde R1-R6 fotoreceptor bij 20 en 25 ^° C (Figuur 7). Zoals gekwantificeerd voor ^4,9, van de aarde verlaagt een fotoreceptor's rustpotentiaal in het donker, en versnelt de spanning reacties.

Figuur 8. Signalering optreden een Fruit Fly R1-R6 fotoreceptorcellen Verbetert met Light Intensity (A) fotoreceptorcellen output naar (onder) gedimd en helder. (Boven; 10.000 keer helderder licht) herhaalde naturalistische lichtintensiteit tijdreeksen opgenomen door dezelfde micro-elektrodein dezelfde cel bij 20 ^oC Reacties op de lichte prikkel zijn groter, omdat ze meer samples, elementaire reacties (hobbels) tot enkele fotonen ^4,5,7,8 integreren. (B) 20 opeenvolgende één-seconde-lange voltage reacties worden gelegd. Individuele reacties (lichtgrijs) werden genomen na de adaptieve trends (pijl in A) had teruggetrokken (gestippelde vakje in A). De overeenkomstige reactie middelen (signalen) zijn de donkere sporen. Het verschil tussen het signaal en de individuele reacties is het lawaai. (C) De cellen 'signalering prestatie werd gekwantificeerd door de opnames' signaal-ruisverhouding (SNR) met behulp van de standaardmethoden ^4,5,7,8. Fotoreceptor uitgang heeft ongeveer 64 Hz breder scala van betrouwbare signalen naar de heldere stimulatie (SNR _'Bright ≥1, tot 84 Hz) dan aan de dim (SNR' _Dim ≥1, tot 20 Hz), met signal-ruisverhouding sterk verbeteren; van SNR _Dim ^MAX = 87 tot SNR _Bright ^MAX = 1868. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Studeren Adaptation and Neural Encoding door Repetitive Stimulation

De noninvasiveness van de werkwijze, waardoor relatief weinig schade aan het netvlies en lamina structuren, maakt het ideaal voor het bestuderen van signalering functioneren van individuele cellen aan verschillende lichte stimuli in hun natuurlijke omgeving fysiologische toestand in vivo. Figuur 8 toont een spanning reacties van R1 R6 afdrukband naar een donker en helder herhaald naturalistische lichtintensiteit tijdreeksen stimulus bij 20 ^o C, terwijl figuur 9 toont responsen van een R1-R6 fotoreceptor en LMC een andere naturalistische prikkel bij 25 ^oC De pre- en postsynaptische opnamen werden afzonderlijk uitgevoerd vanuit twee verschillende vliegen omdat gelijktijdige intracellulaire opnamen van twee scherpe micro-elektroden in dezelfde vlieg, een in de retina en de andere in de lamina, te moeilijk haalbaar ³⁰ zijn.

Figuur 9. Voltage Reacties van een Fruitvlieg R1-R6 fotoreceptorcellen en LMC herhaalde Naturalistic Stimulatie bij 25 ^o C. (A) R1-R6 (grijs) en LMC (zwart) uitgangen opgenomen door verschillende micro-elektroden van verschillende vliegen. (B) volledig licht aangepaste 20 opeenvolgende pre- (boven) en postsynaptische (hieronder) reacties op dezelfde stimulus naturalistische patroon met individuele reacties, weergegeven in een lichtgrijsd de bijbehorende reactie middelen (de signalen) als de donkere sporen. Het verschil tussen het signaal en de individuele reacties is het lawaai. (C) De cellen 'signalering prestatie werd gekwantificeerd door de opnames' signaal-ruisverhouding (SNR). LMC-uitgang heeft ongeveer 10 Hz breder scala van betrouwbare signalen (SNR _'LMC ≥1, tot 104 Hz) dan R1-R6-uitgang (SNR' _R ≥1, tot 94 Hz). Beide signal-to-noise ratio's zijn hoog (SNR _LMC ^MAX = 142, SNR _R ^MAX = 752), en als de opname geluid was laag, hun verschillen weerspiegelen echte encoding verschillen tussen de cellen. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.

Nadat de stimulus onset, de opnames typischely tonen snelle aanpassing van trends die grotendeels binnen 5-6 sec verdwijnen. Vanaf dat moment, de cellen produceren zeer consistente antwoorden op elke 1 sec lang stimulus presentatie (elke gestippelde doos omsluit 20 van deze). De herhaalbaarheid van de antwoorden wordt duidelijk wanneer deze worden gelegd (figuur 8B en figuur 9B). Individuele reacties zijn de dunne grijze sporen, en hun betekenen de dikkere donkerder spoor. De gemiddelde respons wordt beschouwd als de neurale signaal, terwijl de neurale geluid is het verschil tussen de gemiddelde en elke individuele respons ^4,5,9,37,38. De respectieve signaal-ruisverhouding in frequentiedomein (figuur 8C en figuur 9C) werden verkregen door Fourier-transformatie van het signaal en geluidsgegevens brokken in vermogensspectra en verdelen van het gemiddelde signaalvermogen spectrum met de overeenkomstige gemiddelde ruisvermogen spectrum ^{4, 5,9,37,38.} Kenmerkend is het maximale signaal-ruisverhoudingen of de opgenomen neurale uitgangen naturalistische stimulatie hoog (100 - 1000), en in de meest stabiele preparaten zeer lage opname ruis kan waarden bereiken >> 1000 (bijvoorbeeld, figuur 8C.). Merk ook op dat de opwarming breidt de cellen 'bandbreedte van betrouwbare signalering ⁴ (SNR' _Bright ≥ 1); bijvoorbeeld het relatieve verschil tussen de twee R1-R6s in figuren 8 en 9, respectievelijk 10 Hz (84 bij 20 ^° C en 94 Hz bij 25 ^o C).

Men kan verder schatten snelheid van informatieoverdracht van de signaal-ruisverhouding elke cel met de Shannon formule ^32, of door berekening van het verschil tussen de antwoorden "entropie en lawaai entropie tarieven via triple extrapolatie methode ^39. Meer details over de informatie die de theoretische analyses, en het gebruik ervan en de beperkings specifiek met deze methode worden gegeven in de vorige publicaties ^7,8,39.

Figuur 10. Spanning Reacties van een Killer Fly R1-R6 fotoreceptorcellen en LMC herhaalde Naturalistic Stimulatie bij 19 ^o C. (A) R1-R6 (grijs) en LMC (zwart) uitgangen opgenomen door dezelfde micro-elektrode van dezelfde vlieg; Eerst postsynaptisch en later presynaptisch, de elektrode gevorderd in het oog. (B) 20 opeenvolgende pre- (boven) en postsynaptische (hieronder) reacties (lichtgrijs sporen) dezelfde naturalistische stimuluspatroon werden gevangen na initiële aanpassing (gestippelde box aan A). Overbrengingsmiddelen zijn de signalen (de donkere sporen geplaatst), terwijl de respectieve verschillen de individuele reacties geven het geluid. (C) De overeenkomstige Signal-ruisverhouding (SNR) werden berekend zoals in de figuren 8C en 9C. LMC-uitgang heeft ongeveer 100 Hz breder scala van betrouwbare signalen (SNR _'LMC ^MAX ≥1, tot 234 Hz) dan R1-R6-uitgang (SNR' _{R ^MAX} ≥1, tot 134 Hz). Beide signaal-ruisverhouding hoog (SNR _LMC ^MAX = 137, SNR _R ^MAX = 627), en als dezelfde micro-elektrode werd gebruikt in de opnames, hun verschillen weerspiegelen werkelijke verschillen in pre- en postsynaptische neurale uitgangen. Deze resultaten impliceren dat het opnamesysteem had lage ruis, en de invloed daarvan op de analyses was marginaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Neuroethological Vision Studies

De werkwijze kan ook worden gebruikt voor pre- en postsynaptische voltage reacties opnemen van de verbinding ogen van verschillende insectensoorten ^7,8,35,36 (figuur 10), waardoor vergelijkende studies neuroethological visuele informatieverwerking. Voor de gepresenteerde opnamesysteem, de enige vereiste aanpassing is nieuw preparaat houders, elk met een voldoende omvang opening voor de onderzocht. Deze voorbeeldige opnames uit van een vrouwelijke moordenaar vliegen (Coenosia attenuata). Ze tonen spanning intracellulaire responsen van een R1-R6 fotoreceptor en LMC identieke repetitieve lichtstimulatie, als voor de Drosophila tegenhangers in figuur 9, maar bij 19 ^oC In dit geval van de pre- en postsynaptische gegevens werden geregistreerd van dezelfde vlieg; na elkaar, met dezelfde registratie-elektrode (gevuld met 3 M KCl) eerst het doorlopen van de laterale lamina voor invoerening de frontale netvlies. In vergelijking met de Drosophila gegevens bij 25 ^° C, de Coenosia data - zelfs in het koelere temperatuur - toont antwoorden met snellere dynamiek; uitbreiding van het bereik van betrouwbare signalen (signaal-ruisverhouding >> 1) over een breder frequentiegebied. Dergelijke functionele aanpassingen in neurale codering van naturalistische stimuli zijn consistent met Coenosia 's roofzuchtige levensstijl ^36, die hoge precisie spatiotemporele informatie nodig hebben om snel vanuit de lucht jagen gedrag te bereiken.

Discussie

We hebben de belangrijkste stappen gepresenteerd van hoe conventionele scherpe microelektroden te gebruiken om intracellulaire reacties van R1-R6 fotoreceptoren en LMC's in intacte vliegenogen op te nemen. Deze methode is samen met op maat gemaakte hardware- en softwaretools de afgelopen 18 jaar geoptimaliseerd om hoogwaardige, langdurige opnames te leveren om een breed scala aan experimentele vragen te beantwoorden. Door tijd en middelen te investeren in het bouwen van robuuste en precieze experimentele setups, en het produceren van microelektroden met gunstige elektrische eigenschappen, kunnen hoge kwaliteit opnames de norm worden in elk laboratorium dat werkt aan Drosophila visuele neurofysiologie. Hoewel goed ontworpen opname- en lichtstimulatiesystemen belangrijk zijn voor de snelle uitvoering van verschillende experimentele paradigma's, zijn er drie procedurele stappen die nog belangrijker zijn voor het behalen van succesvolle opnames: (i) het maken van de vliegvoorbereiding met minimale oogschade, (ii) het trekken van microelektroden met de juiste elektrische eigenschappen, en (iii) het indrijven van de opname-elektrode in het oog zonder de punt te breken. Uiteindelijk, om zinvolle gegevens op te nemen, moet de onderzoeker de fysische basis van elektrofysiologie begrijpen en hoe geschikte microelektroden voor de doelcelltypen te fabriceren.

Daarom worden de beperkingen van deze techniek voornamelijk bepaald door de geduld, ervaring en technische vaardigheid van de onderzoeker. Omdat deze techniek lang kan duren om te beheersen voor kleine Drosophila cellen, is het raadzaam voor beginnende elektrofysiologen om eerst te oefenen met grotere insectogen, zoals de zweefvlieg³⁶ of sprinkhanen³⁵, met behulp van dezelfde rig. Zodra het uitvoeren van hoogwaardige intracellulaire opnames van de grotere fotoreceptoren en interneuronen routinematig wordt, is het tijd om door te gaan naar het Drosophila oog. Een andere beperking van de techniek betreft cellulaire identificatie. Gepenetreerd Drosophila cellen kunnen elektroforetisch worden geladen met kleurstoffen, inclusief Lucifer geel of neurobiotine. Maar vanwege de kleine puntgrootte van de microelektroden, werkt elektroforese minder efficiënt dan met lagere weerstandselektroden, zoals patch-elektroden. Verder hebben de kleurstofgevulde microelektroden kenmerkend minder gunstige elektrische eigenschappen, waardoor het veel moeilijker wordt om hoogwaardige reacties met hen op te nemen van Drosophila fotoreceptoren en LMC's.

Een technisch probleem dat soms optreedt is onstabiele input signaal, of een volledige gebrek daaraan. Dit wordt vaak geassocieerd met het voltage signaal dat constant afdrijft of hoger/lager is dan het opnamebereik van de versterker. In de meeste gevallen, wordt dit gedrag veroorzaakt doordat de opname-elektrode geblokkeerd is (of dat de punt te fijn is - met een te hoge weerstand of intramural capaciteit - om snelle signaalveranderingen goed te geleiden). Hoewel men kan proberen de punt te ontblokkeren door de elektrodecapaciteit te buzzen, wat soms werkt, wordt de situatie vaak het beste opgelost door simpelweg de opname-elektrode te vervangen. Dit kan verder parameteraanpassingen vereisen in het microelektrode trekgereedschap om de puntweerstand van de nieuwe elektroden te verlagen. De elektrodepunt kan ook geblokkeerd raken in preparaten, waarvoor het te lang duurde om het hoornvormig gat te bedekken met vaseline. Verlengde contact met lucht kan het vers verstelde retinale weefsel drogen, waardoor de oppervlaktelaag in een lijm-achtige substantie verandert. Als dit het geval is, ziet de onderzoeker doorgaans een rode klodder weefsel op de opname-elektrode vastzitten wanneer deze uit het oog wordt getrokken. De enige oplossing hier is om een nieuwe voorbereiding te maken. Vaseline kan veel voordelen bieden voor elektrofysiologische opnames: (i) het voorkomt de coagulering van de hemolymfe die de elektrodepunt zou kunnen breken; (ii) het coat de elektrodepunt waardoor de intramural capaciteit wordt verminderd, wat de tijdconstante van de elektrode verlaagt, en dus het potentieel heeft om de temporele resolutie van de opgenomen neurale signalen te verbeteren^40,41; (iii) het houdt de elektrodepunt schoon, wat penetraties vergemakkelijkt; en na penetratie, (iv) het kan zelfs helpen om de elektrodepunt af te sluiten op de celmembraan⁴².

Het signaal kan verder onstabiel of verloren gaan wanneer de zilverchloridedraad van de elektrodehouder gebroken of dechloride is; in welk geval het oude draad gewoon moet worden vervangen of gedechloride. Het ontbrekende signaal kan ook het gevolg zijn van een (of beide) van de elektrodehouders niet veilig verbonden zijn aan hun aansluitingen. Het is echter uiterst ongebruikelijk dat een stuk apparatuur defect zou zijn. Als het signaal ondetecteerbaar is en alle andere mogelijkheden zijn uitgeput, test dan dat elk onderdeel van het opnameapparaat, inclusief de headstage, versterker, laagdoorlaatfilters en AD/DA-converters, correct zijn aangesloten en normaal functioneren. Een manier om dit te bereiken is om elk instrument te vervangen door een ander van een rig die bekend is om normaal te werken. Als alternatief, gebruik een signaalgenerator om de prestaties van de elektronische componenten één voor één te controleren.

Maar misschien is het meest voorkomende technische probleem dat de elektrofysioloog tegenkomt, dat van opnameruis. In grote lijnen, is opnameruis de waargenomen elektrische activiteit anders dan de directe neuronale reactie op een bepaalde stimulus. Omdat de vliegvoorbereiding, wanneer goed gedaan, zeer stabiel is, komt het waargenomen ruis (voorbij de natuurlijke variatie van de reacties) meestal voort uit grondlussen in de opnameapparatuur, of wordt opgepikt van nabijgelegen elektrische apparaten. Dergelijk ruis is typisch 50/60 Hz hoofdnetbruis en zijn harmonischen; maar soms samengesteld uit meer complexe golfvormen. Om de oorsprong van het ruis te achterhalen, verwijder de vliegvoorbereidinghouder van de setup, verbind de opname- en referentie-elektroden door een druppel vliegen Ringer (of plaats ze in een kleine Ringer's

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22	Geschikt voor ~150X vergroting met lange werkafstand; op maat gemaakte zware stalen tafelmontagestandaard
Stereomicroscoop in de intracellulaire set-up	·  Olympus	Olympus SZX7; oculaires: WHN30x-H/22	30X oculaires zijn nodig om de reflecties van de elektrodenpunt goed te zien wanneer deze door het kleine hoornvliesgat in het oog wordt geleid
Nikon microscoop	Nikon SMZ645; oculaires: C-W30x/7
Vibratievrije tafel	Melles Griot	Met metrische M6 gaten op de broodplank	Onze op maat gemaakte rigs hebben een groot gat geboord door de dikke broodplank dat de vliegvoorbereidingsplatformpool (huisvest een koperwarmtesink met elektronica) van onderaf laat doordringen
Newport
Micromanipulatoren	Narishige	Narishige NMN-21	In onze intracellulaire set-ups worden verschillende micromanipulatorsystemen gebruikt om de shap-opname-elektroden in het vlieg-oog te drijven. Alle genoemde manipulatoren bieden met succes langdurige stabiele opnamen van Drosophila-fotoreceptoren en LMC's.
Huxley Bertram	Huxley xyz-as met fijne handmatige bediening
Sensapex	Sensapex drie-assige
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K met extra x-as piezo-stepper en MS 314 controller
Magnetische stands	Elke magnetische basis met aan/uit-schakelaar is voldoende		Bijvoorbeeld om kabels binnenin de Faraday-kooi te beheren
Elektrodehouders	Harvard Apparatus	ESP/W-F10N
Zilverdraad	World Precision Instruments	AGW1510	0,3 - 0,5 mm diameter; moet worden gechloriseerd voor de elektrodehouders
Vezeloptische lichtbron	Veel verschillende, inclusief Olympus
Vezeloptische bundels	UltraFine Technology		Om de LED-lichtstimulus naar het Cardan-armsysteem te leveren. We gebruiken zowel vloeibare als kwarts lichtgeleiders (variërend van UV tot IR)
Thorn Labs
Vliegvangbuis		P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs	Snij de conische bodem van de 50 ml kunststof centrifugeerbuis af en lijm er een 1 ml pipettentip op.
Digitaal acquisitiesysteem	National Instruments
Micro-elektrode-versterker voor enkel-elektrode stroom-/spanningsklem	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html	Uitstekende performer!
Hoofdfas	Standaard (+/- 150 nA)	Voor npi SEC-10LX
LED-lichtbronnen en -drivers	2-kanaals OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)		Veel van onze stimulussystemen zijn zelf gebouwd
Zelf ontworpen en gebouwd
Acquisitie- en analysesoftware	Veel bedrijven om uit te kiezen		Biosyst; op maat geschreven Matlab-gebaseerd systeem voor experimenteel en theoretisch werk in het Juusola-laboratorium
Persoonlijke computer of Mac			Zorg ervoor dat PC of Mac compatibel is met data-acquisitiesysteem en software
Cardan-armsysteem	Zelf ontworpen en gebouwd		Biedt nauwkeurige x, y, z-positionering van de lichtstimuli
Peltier-temperatuurregelsysteem	Zelf ontworpen en gebouwd
Faraday-kooi	Zelf gebouwd		Electromagnetische ruisscherming
Gefilamenteerde borosilicaatglas capillaire buizen		Buitendiameter: 1 mm
Binnendiameter: 0,5 - 0,7 mm
Gefilamenteerde kwartsglas capillaire buizen		Buitendiameter: 1 mm
Binnendiameter: 0,5 - 0,7 mm
Pipettrekker	Sutter Instrument Company	Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipettrekker	Voor borosilicaat referentie-elektroden, gebruik het voorinstellingsprogramma #11 (patch-elektroden): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). Voor borosilicaat opname-elektroden, gebruik het voorinstellingsprogramma #12 (trekt typisch goede conventionele punten  voor fotoreceptoropnamen): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. Voor LMC-opnamen, die elektroden met fijnere uiteinden vereisen, moeten deze waarden worden aangepast. Voor het trekken van kwarts capillaire buizen, suggereert het P-2000 handboek programma's voor fijne gepunte micro-elektroden. Deze programma's' voorinstellingen dienen als nuttige startpunten voor systematische wijzigingen om elektroden met goed penetratiesucces en lage opnameruis te genereren.
Extracellulaire Ringer-oplossing voor de referentie-elektrode	Chemische stoffen van Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose	Zie het recept in de protocolsectie
3 M KCl-oplossing voor het vullen van de gefilamenteerde opname micro-elektrode	Zouten van Fisher Scientific	10010310, KCl
Petroleumgelei	Vaselin
Niet-roestvrijstalen scheermesjes
Meshouder/breker	Fine Science Tools By Dumont	10053-09	9 cm
Blu-tack	Bostik		Alternatief, gebruik modelleerklei
Pincet	Fine Science Tools By Dumont	11252-00	#5SF (superfijne uiteinden)