Methodenartikel

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54144

⸱

1 oktober 2016

 ,  ,  ,  , 
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2College of Interdisciplinary & Creative Studies, Konyang University, 3Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een snelle en gevoelige kwantificatie van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensorgegevens met een maat draagbare FRET analyzer. De inrichting werd gebruikt voor maltose binnen een kritisch temperatuurtraject dat detectiegevoeligheid maximaliseert, zodat praktische en efficiënte evaluatie van het suikergehalte detecteren.

Samenvatting

Recente verbeteringen in Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensoren gebruik ervan nodig om verschillende kleine moleculen zoals ionen en aminozuren te detecteren. Echter, de aangeboren zwak signaal intensiteit van FRET sensoren is een grote uitdaging dat hun aanvraag voorkomt op diverse terreinen en maakt het gebruik van dure, high-end nodig fluorometers. Eerder hebben we een rendabele en krachtige FRET analyzer die specifiek de verhouding van twee emissiegolflengte banden (530 en 480 nm) kunnen meten hoge detectiegevoeligheid bereiken. Recenter werd ontdekt dat FRET sensoren met bacteriële periplasmatische bindende eiwitten te detecteren liganden met maximale gevoeligheid in het kritische temperatuurgebied van 50-55 ° C. Dit rapport beschrijft een protocol voor het beoordelen van het suikergehalte in de handel verkrijgbare drank monsters met behulp van onze draagbare FRET analyser met een temperatuur-specifieke FRET sensor. Onze resultaten toonden dat de extra voorverwarmingproces van de FRET sensor verhoogt het FRET-ratio-signaal, om meer accurate meting van het suikergehalte in te schakelen. De op maat gemaakte FRET analyzer en sensor werden met succes toegepast op het suikergehalte te kwantificeren in drie soorten commerciële dranken. We verwachten dat een verdere verkleining en de verbetering van de prestaties van de apparatuur het gebruik van hand-held analyzers in omgevingen zal vergemakkelijken, waar high-end apparatuur is niet beschikbaar.

Inleiding

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is op grote schaal gebruikt als een biometrische sensor om kleine moleculen zoals suikers, calciumionen en aminozuren 1-4 detecteren. FRET biosensoren bevatten fluorescerende eiwitten, cyaan fluorescerend eiwit (CFP), en geel fluorescerende eiwitten (YFPs), die zijn gefuseerd aan beide uiteinden van periplasmische bindende eiwitten (PBP's). Suikers binden aan PBP's in het midden van de FRET sensor, waardoor structurele veranderingen in de sensor die vervolgens de afstand en de overgang dipool oriëntatie van de twee fluorescerende eiwitten aan weerszijden van de PBP veranderen. Deze wijziging maakt kwantitatieve analyse van het suikergehalte door meting van de verhouding van de emissie golflengten van EYFP (530 nm) en ECFP (480 nm). Vanwege de hoge gevoeligheid, specificiteit, real-time monitoring capaciteit en snelle responstijd van FRET biosensoren, worden deze sensoren op grote schaal gebruikt in milieu, industriële en medische toepassingen 5. Bovendien ratiometric meting met FRET biosensoren heeft belangrijke praktische voordelen, omdat het kan worden gebruikt om componenten in complexe biologische monsters waarbij de concentratie sensor niet gemakkelijk kan worden gecontroleerd en achtergrondfluorescentie is altijd aanwezig meten.

Ondanks deze voordelen van FRET-gebaseerde sensoren voor de kwantitatieve visualisatie, kleine structurele veranderingen met onvolledige domein motion-transfer naar de fluorescerende eiwitten te produceren inherent zwak signaal intensiteit. Dit zwakke signaal beperkt de toepassing van FRET-gebaseerde sensoren voor in vitro of in vivo analyse 6. Bijgevolg meeste FRET biosensoren vereisen het gebruik van dure en zeer gevoelige apparatuur. Eerder hebben wij een goedkoop en draagbaar FRET analyzer met mogelijkheden vergelijkbaar met die van de bestaande fluorescentie analysatoren 7. In deze inrichting, goedkope 405 nm-band ultraviolet licht-emitterende diode (LED) werd gebruikt als lichtbron voor excitatie van th veroorzakene fluorescentiesignaal, vervanging van een dure lamp of laser. Het detectiesysteem van de analysator efficiënt richt de dissiperende fluorescentiesignaal op twee fotodetectoren met een silicium fotodiode. In een meer recente studie hebben we aangetoond dat optimalisering van detectie temperatuur op 50 - 55 ° C aanzienlijk kunnen vergroten de ratiometrische FRET signaal 8. Deze temperatuur-specifieke signaalversterking, samen met de op maat gemaakte FRET analyzer, maakt het gebruik van FRET sensoren algemenere diagnostische toepassingen met een snelle en hoge gevoeligheid.

In dit protocol hebben we aangetoond dat de algemene toepasbaarheid van de FRET analyzer onder optimale omstandigheden FRET temperatuur door het kwantificeren van het suikergehalte van de handel verkrijgbare dranken. Dit protocol geeft de details van de werking FRET apparaat, alsook een korte beschrijving van sensor en monstervoorbereiding. We verwachten dat dit verslag van de mogelijke toepassing van de draagbare zal bevorderenanalyzer in kleinschalige laboratorium omgevingen en bieden een basis voor verdere ontwikkeling van een goedkope on-site diagnostisch apparaat met FRET-gebaseerde biosensoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van Biosensor

  1. Construct het plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 door de eerder vastgestelde protocol 2.
  2. Inoculeer 5 ml Luria-bouillon (LB) met een enkele kolonie van een Escherichia coli DE3-stam en incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur onder schudden.
  3. Breng 1 ml van de O / N kweek in een 500-ml kolf die 100 ml LB en geïncubeerd bij 37 ° C in een schudincubator totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) 0,5 bereikt (ongeveer 3 uur).
  4. Oogst de cellen in een 50-ml conische buis door centrifugatie bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  5. Resuspendeer de pellet snel in elke buis met 50 ml ijskoud gedestilleerd water (DW) en gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  6. Resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoude DW met 10% (v / v) glycerol onder voorzichtig schudden totdat de oplossing (elektrocompetente cellen) een OD 600 bereikt 100.
  7. Plaats het mengsel van elektrocompetente cellen (50 ul van de cellen bij een OD 600 van 100) en 10 ng van het plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 in een ijskoude elektroporatie cuvette in een elektroporatie-inrichting en electroporate het mengsel (18 kV / cm, 25 uF).
  8. Voeg snel 1 ml SOC medium aan de cuvet en resuspendeer de cellen zachtjes, gevolgd door terugwinning bij 37 ° C gedurende 1 uur onder zacht schudden in een 15 ml ronde bodem buis.
  9. Spreid de cellen op een LB plaat die 100 ug / ml ampicilline en incubeer bij 37 ° C gedurende 12 uur.
  10. Isoleer een enkele kolonie met een lus en beënt de kolonie in 10 ml LB met 100 ug / ml ampicilline bij 37 ° C in een schudder gedurende 12 uur.
  11. Voeg 5 ml van de zaaikweek om 500 ml LB met 100 ug / ml ampicilline en incubeer de cultuur in een 37 ° C incubator schudden.
  12. Voeg 0,5 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) wanneer de OD 600 bereikt0,5 en incubeer de cultuur in een 37 ° C incubator schudden gedurende 24 uur.
  13. Centrifugeer de cellen bij 4500 xg gedurende 20 minuten (4 ° C) en verwijder supernatant.
  14. Resuspendeer de pellet in 5 ml bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA en 1 mM DTT).
  15. Ultrasone trillingen de cellen op ijs met zes 10-sec uitbarstingen op 200-300 W, na elke burst met 10 sec van de koeling.
  16. Centrifugeer het lysaat bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C om de cellulaire brokstukken te pelleteren. Transfer supernatant (oplosbare proteïne) in een nieuwe collectie buis.
  17. Om affiniteitszuivering van het FRET sensor eiwitten, belasting 4 ml van de geklaarde cellysaat bereikt op een Ni-NTA affiniteitskolom (5-ml volume) en voer een chromatografie-assay met behulp van snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) 18.
  18. Was de kolom eenmaal met vijf kolomvolumes wasbuffer I (50 mM fosfaatbuffer, 300 mM natriumchloride, 10 mM imidazool, pH 7,0).
  19. Herhaal de wasstap met vijf kolomvolumes wasbuffer II (50 mM fosfaatbuffer, 300 mM natriumchloride, 20 mM imidazool, pH 7,0).
  20. Elueer het sensor eiwit met vijf kolomvolumes elutiebuffer (50 mM fosfaatbuffer, 300 mM natriumchloride, 500 mM imidazool, pH 7,0).
  21. Concentreren en ontzouten het geëlueerde monster vullen concentrator (membraan grootte van 10.000 MW) met tot 20 ml monster en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3000 x g. Vullen concentrator met 0,8% fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal deze stap tweemaal, eerst de concentrator vullen met 20 ml van het monster, en vervolgens opnieuw vullen met PBS.
  22. Herstel de geconcentreerde en de gezouten sensor eiwitten en het op -80 ° C.

2. Meting van Sugar content met behulp van de FRET Analyzer

LET OP: De details van de FRET analyzer bouw werden beschreven in onze eerdere werkzaamheden 7.

  1. Bereid een detectie oplossing van 0,8% PBS bevattende 0,2pM van de sensor eiwitten.
  2. Schakel de FRET analyzer. Druk op de knop "UP" voor 2 seconden om de optimale temperatuur te kalibreren. Stel de temperatuur tot 53 ° C met behulp van de "UP" en "DOWN" toetsen en druk op de knop "SET".
  3. Voor het kalibreren, houdt u de "UP" en "DOWN" knoppen tegelijkertijd voor 2 sec. Controleer of de LED-beeldschermen "CALIB" en druk op de knop "SET".
  4. Plaats een 12,5 x 12,5 x 45 mm (lengte x breedte x hoogte) rechthoekig parallellepipedum vat (cuvette) met alleen PBS buffer in een cuvettehouder van de analyser en druk op de knop "SET".
  5. Vervang de cuvette met één die alleen de detectie-oplossing (zie 2.1) zonder suiker (maltose / sucrose) en druk op de "SET" knop om de basislijn te kalibreren.
  6. Vervang de cuvette met een met de detectie-oplossing met 10 mM suiker en druk op de "SET"knop.
  7. Om het suikergehalte van een drank monster te bepalen, zet 1 ml drank monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 min.
    OPMERKING: FRET sensor gebaseerde fluorescentie metingen is het voordeel dat er geen speciale voorbehandeling van het monster omdat slechts 1% (v / v) van het monster wordt opgenomen in het totale volume. Toch raden we het verwijderen van alle materiaal dat de fluorescentie meting (bijvoorbeeld cellen, onoplosbare deeltjes, lipide, vet, of materiaal met autofluorescentie) van invloed kunnen zijn. Bovendien, als een sterk zuur, sterke base, schoonmaakmiddel (detergent) of emulgator (emulgator) aanwezig is in een hoge concentratie en kunnen hebben op de eigenschappen van de FRET biologische sensor moet worden verwijderd met een organisch oplosmiddel of een neutraliserend. Wanneer bijvoorbeeld melkvet en emulgatoren worden uit bevroren snacks, de monsters worden gecentrifugeerd in een microfuge buis bij 16.000 xg gedurende 30 min, en de vloeibare tun de bodem sediment en de toplaag van melkvet wordt geëxtraheerd. Een gelijke hoeveelheid hexaan wordt vervolgens toegevoegd, gevolgd door centrifugatie bij 15.000 xg gedurende 30 min om lipiden te elimineren.
  8. Verwijder het supernatant met een 1 ml spuit en filtreer door een spuitfilter (poriegrootte 0,2 pm).
  9. Plaats 0,1 ml gefilterd drank monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 0,9 ml PBS en vortex voorzichtig.
    LET OP: Het is cruciaal om de drank monster correct te verdunnen. In dit geval werd 1000-voudige verdunning uitgevoerd dat de suikerconcentratie binnen het dynamische bereik van de inrichting vallen. We raden u aan het schatten van het doel suikerconcentratie van tevoren door te verwijzen naar het suikergehalte in het label van de drank.
  10. Voeg 5 ul van de verdunde drank monster (1%, v / v) aan een cuvet met 0,495 ml van de oplossing detectie.
  11. Plaats de cuvette in een cuvettehouder van de FRET analyser en verwarm het monster oplossing tot 53 ° C.
  12. Druk op de knop "SET" om het suikergehalte te meten.
    Opmerkingen Men kan de FRET-meting met behulp van een plaatlezer multilabel of een fluorescentie spectrofotometer uitgerust met een Peltier-inrichting voor de temperatuurregeling evalueren lezen ratio 488/535 nm 7,8. Voor sucrose detectie, volg de stappen 1,1-2,12 met een CSY-LH sensor 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantitatieve analyse van suikergehalte de FRET-analyse uitvoeren, is het noodzakelijk om een ​​gefitte curve schatten van de beoogde suikerconcentratie van de waargenomen FRET verhouding bouwen. Zij r bepalen de verhouding van de emissie-intensiteit van GFP bij 480 nm en de emissie intensiteit van YFP opgewekt bij 530 nm (vgl. 1).

figure-results-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol maakt een snelle en efficiënte kwantificatie van het suikergehalte in drank monsters, met een maat FRET analysator 7 bij een optimale temperatuur voor FRET sensoren. De analyser is ontworpen met een recent ontwikkelde, goedkope 405-nm-band ultraviolet-LED als lichtbron en twee fotodetectoren met een silicium fotodiode. Dit apparaat is kosteneffectiever dan andere vergelijkbare fluorometers. De inrichting vertoonde hoge detectiegevoeligheid, bijzonder bij het meten van de verhouding van twee golfl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van de Intelligent Synthetic Biology Center van Global Frontier Project (2011-0031944) en de KRIBB Research Initiative Program.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LBBD#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)SigmaI6758
AmpicillinSigmaA9518
Tri-HClBioneerC-9006-1
PMSFSigma78830
EDTABioneerC-9007
DTTSigmaD0632
NaClJunsei19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)Gibco70011-0440,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4
SOC2% trypton, 0,5% Gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glucose
Resource QAmersham Biosciences17-1177-016 × 30 mm anion-exchange chromatography kolom 
HisTrap HP1Amersham Biosciences29-0510-21
Quartz cuvetteSigmaZ802875
AKÄKTAFPLCAmersham Biosciences18-1900-26een fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary EclipseVarianInceen fluorescentiespectrofotometer
VICTOR  PerkinElmer2030-0050een multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)PromegaElectrocompetente cellen
A (Drank)Korea Yakult Co. (Korea)BirakGefermenteerde dranken
B (Drank)Lotte Foods (Korea)EproFrisdrank
C (Drank)Lotte Foods (Korea)GetoraySportdrank

Referenties

  1. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  2. Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
  3. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  4. Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  5. Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
  6. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  7. Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
  8. Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
  9. Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
  10. Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
  11. Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
  12. Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
  13. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
  14. Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
  15. Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
  16. Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
  17. Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
  18. Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FRET sensorsuikerdetectietemperatuuroptimalisatiebiosensorzuiveringmaltosekwantificeringdrankanalyseemissieverhoudingkalibratieprotocol

Gerelateerde artikelen