Mucine agarosegelelektroforese: Western blotting voor hoge molecuulgewicht glycoproteïnen

Samenvatting

Mucinen zijn glycoconjugaten met een hoog molecuulgewicht, met een grootte variërend van 0,2 tot 200 megadalton (MDa). Als gevolg van hun grootte dringen mucinen niet door conventionele polyacrylamide gels en hebben ze grotere poriën nodig voor scheiding. We bieden een gedetailleerd protocol voor mucine agarose gel elektroforese om relatieve kwantificering te beoordelen en polymeerassemblage te bestuderen.

Samenvatting

Mucinen, de zwaar-geglycosyleerde eiwitten voering mucosale oppervlakken, hebben zich ontwikkeld als een belangrijk onderdeel van de aangeboren verdediging door het epitheel te beschermen tegen binnendringende ziekteverwekkers. De belangrijkste rol van deze macromoleculen is deeltje trapping en de klaring te vergemakkelijken terwijl het bevorderen van de smering van het slijmvlies. Tijdens eiwitsynthese, mucinen ondergaan intense O-glycosylatie en multimerisatie, die de massa en omvang van deze moleculen sterk te verhogen. Deze post-translationele modificaties zijn cruciaal voor de visco-elastische eigenschappen van mucus. Als gevolg van de complexe biochemische en biofysische eigenschappen van deze moleculen, samen met mucinen biedt vele uitdagingen die niet kan worden overwonnen door conventionele eiwit analysemethoden. Bijvoorbeeld hun hoge molecuulgewicht voorkomt elektroforetische migratie via gewone polyacrylamidegels en hun kleverige aard veroorzaakt adhesie experimentele tubing. Echter, onderzoeken de rol van mucinen in gezondheid(Bijv., Handhaven mucosale integriteit) en ziekte (bv., Hyperconcentration, mucostasis, kanker) onlangs verworven belang en mucinen worden onderzocht als een therapeutisch doelwit. Een beter begrip van de productie en functie van macromoleculen mucine kan leiden tot nieuwe farmaceutische benaderingen, bijvoorbeeld remmers van mucine granule exocytose en / of mucolytische middelen. Daarom, consistente en betrouwbare protocollen te onderzoeken mucine biologie zijn van cruciaal belang voor wetenschappelijke vooruitgang. We beschrijven conventionele methoden mucine macromoleculen scheiden door elektroforese met gebruik van agarose gel, overbrengen eiwit in nitrocellulose membraan en gedetecteerd signaal met mucine-specifieke antilichamen en infrarood fluorescerende gel lezer. Deze technieken zijn breed toepasbaar te bepalen mucine kwantificering, multimerisatie en om de effecten van farmacologische verbindingen op mucinen testen.

Inleiding

Mucines worden gewoonlijk geproduceerd door mucosale oppervlakken die holten blootgesteld aan de buitenomgeving lijn (bijv., Ademhaling, spijsvertering, voortplantingsstelsel, oogoppervlak) en inwendige organen (bijvoorbeeld, pancreas, galblaas, borstklieren). De aanwezigheid van deze glycoproteïnen onderhoudt oppervlak hydratatie en vormt een fysieke barrière tegen ziekteverwekkers. Hoewel mucine productie essentieel voor de gezondheid mucosale, mucine hyperconcentration en / of afwijkende slijm eigenschappen kunnen leiden tot obstructie duct, bacteriële kolonisatie en chronische ontsteking, onomkeerbare weefselschade kan veroorzaken. Een vergelijkbare cascade van gebeurtenissen worden waargenomen in een aantal ziekten, bv., Cystic fibrosis ^1, chronische otitis media ² en cervicovaginal infectie ^3. Daarom is het belangrijk om de rol van mucinen bij gezondheid en ziekte begrijpen en routine protocollen vast te stellen voor proteïne-identificatie.

Daten, 19 mucinen genen geïdentificeerd en coderen voor grote polypeptideketens die variëren van 1200 (bijv., MUC1) tot 22.000 (bijvoorbeeld MUC16) aminozuren. Het mucine genfamilie kan worden onderverdeeld in twee subtypen: de membraan geassocieerde mucinen, betrokken bij cel-signalering en de afscherming, en de gelvormende mucinen, verantwoordelijk voor de visco-elastische eigenschappen van mucus gels. Membraan-geassocieerde mucinen zijn meestal monomere en hechten aan het celoppervlak via een hydrofoob membraan omspannende domein. Daarentegen gelvormende mucinen hebben verschillende von Willebrand factor (vWF) -achtige en cysteïnerijke domeinen die essentieel zijn voor de vorming van dynamische polymère netwerken. Grote glycanen zijn aan serine en threonine residu verdeeld over het apomucin. Deze dichte O-gekoppelde Oligosacchariden kunnen oplopen tot 80% van het molecuulgewicht ^4. Intra- en intermoleculaire disulfidebindingen verbinden mucine monomeren de integriteit van de mucine gel network. Door zware glycosylering en multimerisatie, mucinen tot de grootste moleculen in het dierenrijk en kan niet worden geanalyseerd met standaard gelelektroforese met gebruikelijke SDS-PAGE polyacrylamide gel en standaard eiwit ladders. Deze werkwijzen lossen / de eiwitten met molecuulgewichten lager dan 250 kDa, terwijl mucine monomeren kan oplopen tot 2 MDa bij MUC16. Echter, hoog molecuulgewicht eiwit ladders worden gebruikt om kleine mucine monomeren bestuderen (bijv., MUC1).

Verschillende technieken kunnen worden toegepast op mucine grootte, bouw en interactie te bestuderen. Traditioneel wordt biochemische karakterisering van mucinen bereikt door mucine-isolatie via isopycnische dichtheid-gradiënt centrifugeren in denaturerende buffer, gevolgd door grootte-uitsluitingschromatografie en immunodetectie (bijv., Slot blotting) ^5. Dynamisch en / of multi-angle lichtverstrooiing informatie verstrekken over de oligomere toestand van mucine-rijke monsters ^{1. Bovendien zijn snelheid-zonale centrifugatie gekoppeld immunodetectie en transmissie elektronenmicroscopie gebruikte macromoleculaire conformatie van mucinen 6 bepalen. Massaspectrometrie wordt ook gebruikt om mucinen kwantificeren detecteren proteolytische splitsing en analyseren oligosaccharide samenstelling 1,7,8. Dergelijke technieken zijn duur, tijdrovend en vereisen vaak grote hoeveelheden en / of hoge concentraties van het monster. De werkwijze hierin beschreven, bijv., Mucine scheiding door elektroforese reproduceerbaar, goedkoop en kan worden gebruikt in high-throughput studies om relatieve kwantificering mucine geven en te onderzoeken chemische polymeren. Echter, deze test vereist een hoge affiniteit, hoge specificiteit mucine antilichamen die niet beschikbaar zijn voor zeldzame mucinen kunnen zijn (bijv., MUC19) of bepaalde soorten (bijv., Varken, fret).}

Agarose Western blotting geschikt om allerlei mucine-rijke monsters met concentraties oplossenties die variëren van 50 ug / ml (bijv., cellen wast) tot 5 mg / ml (bijv., sputum). Deze test werd geïntroduceerd in de jaren 1990 en werd alleen uitgevoerd in enkele gespecialiseerde laboratoria ^9,10. Aanvankelijk deze techniek hielp identificeren subpopulaties van mucine in menselijke monomeren sputum ^11,12 en bevestigde het oligomerisatie proces slijmbekercellen, bestaande uit dimeervorming in het endoplasmatisch reticulum, gevolgd door dimeer multimerisatiedomein in het Golgi-apparaat ^13. Meer recent, het genereren van polyklonale antilichamen tegen muizen mucinen vergemakkelijkt studies op kleine diermodellen (bv., Mucine tekort, βENaC, OVA-uitgedaagd muismodellen) en opende een nieuw onderzoeksgebied voor preklinische studies testen van farmacologische verbindingen die gericht zijn op het verwijderen van slijm uit de longen ^14-17. Als gevolg van een toenemende belangstelling mucine biologie en het genereren van nieuwe, meer specifieke mucine antilichamen beschrijven we herein de methodologie mucinen gescheiden door agarose gelelektroforese, vacuümoverdracht naar nitrocellulose en twee-kleuren infrarood fluorescentiedetectie.

Protocol

1. Bereid Buffers voor Mucine Gel Western Blotting

1. Bereid 1 liter 50x TAE (Tris-acetaat-EDTA) buffer.
   1. In 700 ml gedestilleerd water (dH ₂ O) voeg 242 g Tris-base (0,4 M), 57,1 g ijsazijn (gewicht vloeistof) (0,2 M) en 14,61 g ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (50 mM).
   2. De pH instellen op 8,0 en maken het volume tot 1 liter met dH ₂ O.
2. Bereid 10 ml van 10x laadbuffer.
   1. Bereid 5 ml 1 x TAE buffer. Hiervoor voeg 5 ml glycerol (50%), 25 mg broomfenolblauw (0,25%) en 100 mg natriumdodecylsulfaat (SDS) (1%).
3. Bereid 2 liter 20x natrium zoutoplossing citraat (SSC) buffer.
   1. In 1,5 liter dH ₂ O, voeg 350,6 g NaCl (3 M) en 176.4 g trinatriumcitraat (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 M). Stel de pH tot 7,0 en vul aan tot 2 liter met dH ₂ O.
4. Bereid 1 liter 1x TAE-0,1% SDS buffer.
   1. Voeg 20 ml 50 x TAE tot 980 ml ​​dH ₂ O. Voeg 1 g SDS tot een 0,1% SDS-TAE oplossing te maken.

2. TAE-SDS Agarose Gel Voorbereiding

1. (. Dat wil zeggen, 150 ml) - 7 mm dikke gel Giet voldoende volume 1x TAE-0,1% SDS buffer in een microwavable erlenmeyer aan een 5 te maken. Voeg 0,8% (1,2 g) agarose poeder.
2. Magnetron kolf in 30 seconden met periodieke zwenken totdat agarose volledig is opgelost (gewoonlijk 1-3 min). Gebruik heet de hand pads tijdens dit proces. Wees voorzichtig met overkoken terwijl wervelende.
3. Laat de agarose oplossing afkoelen 5-10 min. Opmerking: De agaroseoplossing klaar te gieten wanneer bodem van de fles kan worden overgelaten aan de handpalm 5 sec.
4. Elektroforesegel casting tray (10 x 15 cm) door het afdichten van de randen met tape en het goed kammen in positie.
5. Giet agarose oplossing langzaam in tHij casting lade om de vorming van luchtbellen te vermijden. Verwijder bellen met behulp van een pipet tip. Wacht tot de gel te koelen en volledig te stollen. Eenmaal verhard, verwijder de kam langzaam om te voorkomen dat het instorten van de putten door zuiging en verwijder de tape van de randen van de lade.
6. Plaats agarosegel in de gel doos en de elektroforese-unit vullen met 1x TAE-0,1% SDS buffer totdat de gel volledig gedekt.

3. Sample laden en elektroforese Separation

Opmerking: In ons laboratorium hebben we vaak gebruikt monsters van zowel muis als mens, waaronder bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF; beide soorten), mobiele spoelvloeistof van humane bronchiale epitheelcellen (HBE), en speeksel en sputum stalen. Monsters kunnen worden gedenatureerd in 6 M ureum bij de inzameling of opgeslagen voor een korte periode van tijd (6 uur) door het toevoegen van protease-remmer cocktail.

1. Bereiden monsters voor door toevoegen van 10% van lading kleurstof aan elk monster (bijv., 30 pl monster en 3pl kleurstof). Homogeniseren monsters door en neer te pipetteren. Kort spin down buizen bij 5000 rpm tot druppeltjes te verzamelen.
2. Zorgvuldig belasting gelijk volume van monsters in de putjes.
   1. Pre-nat tips en / of gebruik maken van positieve verplaatsing pipetten om het laden van zeer viskeuze monsters te vergemakkelijken. Langzaam aspireren 80 - 90% van het monster-kleurstof-oplossing (dat wil zeggen, 27-30 pi) aan pipetteren luchtbellen te vermijden.
   2. langzaam geladen op de bodem van de putjes en geleidelijk de pipetpunt boven bewegen. Voor monsters die bevestigd blijven aan de pipetpunt, applicatie onder een hoek van 45 ° en langwerpig recht boven de put of het zachtjes gebruik van het goed aan de draderige slijm breken. Laat de putten niet overbelasten.
3. Sluit de elektroden uit de gel in om de elektroforese stroomgenerator. Zorg ervoor dat de elektroden correct zijn aangesloten (bijv., Rode kabel aangesloten op de positieve uitgang van de generator) negatief staan ​​ten laste mucinen te lopen in de richting van de positieve elektrode.
4. Voer de elektroforese bij 80 Volt gedurende 90 min bij één kam gel of 60-75 min voor een dubbele kam gel om overlap tussen de twee rijen voorkomen.
5. Schakel generator stroom uit en haal de elektroden uit het stopcontact.
6. Verwijder voorzichtig de gel uit de gel doos met een hand aan weerszijden van het gietstuk te waarborgen lade de gel blijft zitten.

4. Verminder Agarose Gel voor Efficient Mucine Transfer

1. Plaats de gel flat zorgvuldig in een glazen container. Spoel de gel met dH ₂ O om sporen van TAE-SDS buffer te verwijderen.
2. Bereid 1 liter 4x SSC buffer door het toevoegen van 200 ml van 20x SSC in 800 ml dH ₂ O. Voeg 200 ml van 10 mM dithiothreïtol (DTT) 4x SSC door toevoeging van 309 mg van vers DTT in 200 ml 4x SSC buffer.
3. Week de gel met DTT-4x SSC buffer en deksel. Schud gedurende 20 min (10 omwentelingen per minuut). Spoel gel met DTT-vrije 4x SSC buffer.

"> 5. Vacuüm Blotter Vergadering en Sample Transfer naar een nitrocellulosemembraan

1. Bereid vacuüm vloeipapier voor de overdracht.
   1. Knip nitrocellulose membraan afmetingen iets breder dan de gel (bijv., 10 x 15 cm).
   2. Natte poreuze mat met dH ₂ O en plaats het gladde-side-up in het vloeipapier.
   3. Natte nitrocellulosemembraan met DTT-vrije 4x SSC buffer en plaats deze in het midden van de poreuze mat.
   4. Bedek de poreuze mat met een rubberen pakking, waardoor de opening van de pakking juist uitgelijnd met het nitrocellulosemembraan. Als poreuze mat is nog steeds zichtbaar, zorgvuldig aan te passen het membraan om ervoor te zorgen dat er geen opening tussen de pakking en membraan.
2. Plaats de agarosegel voorzichtig bovenop het membraan. Verzekeren gel vormt een afdichting met de pakking en de putjes van de gel staan ​​het membraan voor overdracht.
   1. Het vormen van bellen tussen de membraan en de gel. Om het te minimaliserenblaasvorming, spuiten enkele druppels 4x SSC buffer op het membraan en schuif de gel van boven naar beneden om eventuele luchtbellen gevormd spoelen. Beweeg de gel op het membraan eiwitten begint onmiddellijk blot.
3. Zorgvuldig betrekking hebben op de gel met 4x SSC buffer.
4. Begin mucine overdracht door zuiging.
   1. Zet vacuüm vloeipapier ON en zet druk bij 40 - 50 mbar. Voeg enkele druppels 4x SSC buffer op de gel elke 5-10 minuten om de gel uitdroogt. Run transfer voor 90 min. Optioneel: Na voltooiing, markeer de putten met een potlood voor oriëntatie.
5. Gooi de gel en ophalen nitrocellulosemembraan kunststofleidingen pincet aan de rand van het membraan.

6. Membraan Blocking en Detection

1. Spoel membraan onmiddellijk met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat je niet door het membraan uitdrogen.
2. Dompel het membraan in 50 ml van 3% melk-PBS blokkerende buffer en leg ze op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na incubatie, gooi de blokkerende buffer.
3. Dompel membraan in 1% melk-PBS primaire antilichaam-oplossing. Incubeer het membraan in de primaire antilichaamoplossing gedurende de nacht op een rocker bij 4 ° C. Na incubatie, gooi het primaire antilichaam oplossing. Verdun het primaire antilichamen een 1: 2000 verhouding van antilichaam oplossing blokkerende buffer. Opmerking: Voor monsters afkomstig van muizen, maken we gebruik van UNC 222 konijnen anti-Muc5b en geit anti-Green Fluorescent Protein (GFP). Voor monsters die afkomstig zijn van mensen, maken we gebruik van H300 anti-MUC5B en 45M1 anti-MUC5AC primaire antilichamen.
4. Was membraan 3 maal met PBS gedurende 10 minuten op een rocker.
5. Dompel membraan in 1% melk-PBS secundair antilichaam-oplossing. Verdun de secundaire antilichamen die een 1: 7500 verhouding antilichaamoplossing het blokkeren buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een rocker (bijvoorbeeld 700 anti-konijn en anti-geit 680.). Beschermen tegen licht door incubatie in een niet-transparante container. Gooi de secundaire antilichaamoplossing na 1 uur.
6. Was membraan 3 maal met PBS gedurende 5 minuten. Spoel membraan met dH ₂ O aan zout te verwijderen.
7. Lees de membraan op een infrarood fluorescentie volgens instructies van de fabrikant.

Resultaten

We tonen representatieve resultaten van mucine expressie volgende agarosegelelektroforese in BALF van de longen van muizen (figuur 1). In dit voorbeeld hebben we de agarosegel opwaartse regulatie van mucine volgend op IL-13 behandeling van de Tg-MUC5AC muismodel zien. Het Western blot toont een visuele weergave van mucine expressie, die kan worden gebruikt voor een kwantitatieve analyse van multimeer of monomeer band signaalintensiteit (figuur 2). Deze w...

Discussie

Het protocol van mucine Western blotting beschreven in deze video combineert conventionele technieken van moleculaire biologie gescheiden zijn en breng grote macromoleculen, zoals DNA, met regelmatige technieken voor eiwitdetectie, dwz., Immunoblotting. Dezelfde techniek kan worden toegepast op de biologie van complexe glycosaminoglycanen, zoals de afbraak van hoog molecuulgewicht hyaluronzuur ¹⁸ bestuderen. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt in een groot aantal testen succesvolle agarose Weste...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences

```