Methodenartikel

subtypering van Campylobacter jejuni Ssp. doylei Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

⸱

30 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massa-spectrometrie gebaseerde phyloproteomics (MSPP) werd gebruikt om een verzameling van Campylobacter jejuni ssp typen. Doylei isoleert De stam in vergelijking met multilocus volgorde typen (MLST).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS biedt de mogelijkheid om sommige bacteriën niet alleen op de soorten en ondersoorten niveau, maar ook onder, De stam differentiëren. Allelische isovormen van de detecteerbare biomarker ionen resulteren in isolate-soortelijke massa verschuivingen. Massa-spectrometrische phyloproteomics (MSPP) is een nieuwe techniek die de massaspectrometrische detecteerbare biomarker massa in een regeling die aftrek phyloproteomic relaties uit isolaat specifieke massaverschuivingen vergelijking met een genoom toelaat combineert sequentie referentiestam. De afgeleide aminozuursequenties worden vervolgens gebruikt om MSPP gebaseerde dendrograms berekenen.

Hier beschrijven we de workflow van MSPP door het intikken van een Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolaat collectie van zeven stammen. Alle zeven stammen waren van menselijke oorsprong en multilocus volgorde typen (MLST) toonden hun genetische diversiteit. MSPP-typen resulteerde in zeven verschillende MSPP volgorde types, voldoende als gevolg van hun PHYlogenetic relaties.

De C. jejuni ssp. doylei MSPP regeling omvat 14 verschillende biomarker ionen, vooral ribosomale eiwitten in het massabereik van 2-11 kDa. MSPP kan in principe worden aangepast aan andere massaspectrometrische platforms met een uitgebreid massagebied. Daarom is deze techniek heeft de potentie om een ​​nuttig instrument voor stamniveau microbiële typering worden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens het laatste decennium, heeft-MALDI time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) gevorderd tot een zeer gewaardeerd standaardmethode voor microbiële geslacht en soort identificatie in klinische microbiologie 1, 2 zijn. Soortidentificatie is gebaseerd op de registratie van kleine eiwit vingerafdrukken van intacte cellen of cellysaten. De typische massabereik voor een massaspectrometer gebruikt in routine klinische microbiologie is 2-20 kDa. Bovendien kan de resulterende spectra worden gebruikt om spanningen op de hiernavolgende-species en subspecies niveau beneden-3 discrimineren. Vroege baanbrekende studies hebben specifieke biomarker ionen geïdentificeerd voor een bepaalde subgroep van stammen in Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9 en Escherichia coli 10-12.

De combinatie van verschillende variabele biomarker massa's die overeenkomen met allele isovormen biedt de mogelijkheid voor diepere subtypering. Eerder hebben we met succes een methode om deze variaties in de massa-profielen om te zetten in betekenisvolle en reproduceerbare phyloproteomic relaties genaamd massaspectrometrie gebaseerd phyloproteomics (MSPP) op een C. geïmplementeerd jejuni ssp. jejuni isolatencollectie 13. MSPP kan worden gebruik gemaakt van een massaspectrometrische gelijk aan DNA-sequentie gebaseerd subtypering technieken zoals multilocus reeks typen (MLST).

Campylobacter soorten zijn de belangrijkste oorzaak van bacteriële gastroenteritis wereldwijd 14, 15. Als gevolg van Campylobacteriose post-infectueuze sequela, namelijk Guillain Barré, reactieve artritis en inflammatoire darmziekte kunnen ontstaan 16. De belangrijkste bronnen van infectiebesmet vee vlees van kip, kalkoen, varkens, runderen, schapen en eenden, melk en oppervlaktewater 15, 17. Daarom regelmatig epidemiologische surveillance studies in het kader van de voedselveiligheid zijn noodzakelijk. MLST is de "gouden standaard" in moleculaire typering voor Campylobacter soorten 18. Omdat de Sanger-sequencing-gebaseerde MLST werkwijze is arbeidsintensief, tijdrovend en relatief duur is MLST typen beperkt tot relatief kleine isoleren cohorten. Daarom is er behoefte aan goedkopere en snellere subtypering methoden. Deze behoefte kan worden voldaan door massaspectrometrische methoden zoals MSPP.

Dit document presenteert een gedetailleerd protocol voor MSPP-typering met behulp van een verzameling van Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolaten en vergelijking van het potentieel met MLST.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Maak een veilige werkplek door te overwegen Biosafety Voorwaarden

  1. Vertrouwd te raken met het laboratorium en veiligheidsvoorschriften die van belang zijn voor het werken met micro-organismen. De meeste menselijke pathogene micro-organismen moet bioveiligheidsniveau worden behandeld 2 omstandigheden, maar sommige, zoals Salmonella enterica serovar Typhi, vereisen bioveiligheidsniveau 3. Informatie over het niveau van de behandeling van elk pathogeen kan worden geraadpleegd op www.cdc.gov/biosafety.
  2. Ongeacht de biohazard classificatie van de specifieke micro-organisme, beschouwen alle materialen die in contact komen met de ziekteverwekker als infectueus afval dat moet worden geautoclaveerd voorafgaand aan de verwijdering kwam. Respecteer regionale veiligheidsrichtlijnen voor gevaarlijke stoffen en biologische stoffen. Zorg ervoor dat geschikte containers voor onmiddellijke en correcte verwijdering van mogelijk besmette materialen (biohazards) beschikbaar zijn.
  3. Zorg ervoor dat de steriele instrumenten (enting loops), oplossingen en cultuur media (agar platen) zijn verkrijgbaar voor aanvang bacteriecultuur.
  4. Was uw handen met antiseptische zeep en warm water direct na gebruik van besmettelijke micro-organismen.

2. Selecteer Reference en Collection isolaten

  1. Selecteren en een standaard-genoom gesequenced referentie verkrijgen isoleren samen met de sequenties van de gecodeerde proteoom, idealiter in FASTA formaat. Als meer genoom gesequenced stammen beschikbaar, deze opnemen in de analyse.
    Let op: Dit isolaat / deze isolaten zullen later worden gebruikt om de identiteit van de massa pieken waargenomen in massaspectrometrie te voorspellen (zie rubriek 7).
  2. Selecteren en een reeks aan potentieel diverse isolaten op zodanige wijze dat deze de fylogenie van de soort of ondersoort van belang.
    Let op: Deze isolaten zullen later worden gebruikt om de variabiliteit van biomarkers aan te tonen in de bevolking (zie paragraaf 8).
  3. Zorg ervoor dat de gehele collectie en referentie-isolaat (s) zijn proPerly getypt door de respectieve gold voor de betreffende organisme 18-20.
    Opmerking: Dit kan verschillende (sub) -typing werkwijzen omvatten, maar waarschijnlijk toevlucht nemen tot MLST, die nog is de standaardmethode genetische diversiteit van de meeste microbiële species aantonen.
  4. Om de fylogenie binnen de collectie af te leiden, berekenen een phylogram van de typen data, bijvoorbeeld met behulp van de methode ongewogen paar groep met rekenkundig gemiddelde (UPGMA) in MEGA6 software voor MLST data 21. Voor MLST data, ook raadplegen MLST-database en wijs types volgorde en de respectieve klonen complexen 22.
    Opmerking: Dit zal later worden gebruikt om de congruentie van MSPP analyseren met de eerdere gouden standaard typeringsmethode (zie paragraaf 9).

3. Maak een MALDI Target Plate

WAARSCHUWING: TFA een sterk zuur. Onjuist gebruik van TFA draagt ​​het risico van ernstige brandwonden, oogschade en ernstige irritatie of de bovenste luchtwegen bij inademing. Daarom moeten strenge veiligheidsmaatregelen in acht worden genomen en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van veiligheidsbril, gezicht schilden, geschikte handschoenen, laarzen, of zelfs een volledige beschermende kleding nodig is, terwijl de behandeling van TFA. Mogelijke blootstelling aan TFA moeten worden gecontroleerd door het hanteren van de stof onder voldoende ventilatie met een effectieve afzuigsysteem. In geval van onvoldoende ventilatie moet een respirator met goedgekeurde filter worden gebruikt. Daarnaast TFA is schadelijk voor water levende organismen, met langdurige gevolgen. Elke release van TFA in afvalwater in het milieu moet worden voorkomen.

Opmerking: Voor het spotten van de monsters op een MALDI doel, het reinigen van de richtplaat grondig als de plaat eerder is gebruikt.

  1. Bereid 100 ml 70% waterige ethanol oplossing met 30 ml gedeioniseerd water en 70 ml pure ethanol.
  2. Bereid 250 ul van een 80% waterig trifluorazijnzuur (TFA) oplossing door 50ui gedeïoniseerd water en 200 pi 100% TFA in een reactiebuis en vortexen de buis gedurende 1 min.
  3. Reinig het MALDI doel door het in een glazen schaal en onderdompeling in 70% waterige ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Spoel het doelwit onder warm water.
  5. Met behulp van een papieren zakdoek, veeg de richtplaat intensief met 70% waterige ethanol oplossing voor alle eerder genomen monsters en andere potentiële vuil te verwijderen.
  6. Als verdere reiniging nodig is, afspoelen onder warm water tijdens het vegen met een papieren zakdoekje.
  7. Resten en mogelijk onzichtbare, verontreinigingen, door het bedekken van het doeloppervlak met een dunne laag van 80% waterig TFA (100 pl per 96 spots ~) en afvegen alle doelposities schoon met een tissue.
  8. Ten slotte, spoel de doelstelling om zuur te verwijderen, veegt u deze droog met een papieren zakdoekje, en laat het gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur om de resterende vloeistof verdampen.

4. Voorbereiding van een45, cyano-4-hydroxy-kaneelzuur matrix bevattende een interne Calibrant

  1. Bereid een verzadigde matrix-oplossing door het oplossen van 10 mg α-cyano-4-hydroxy-kaneelzuur (HCCA) in 1 ml van een mengsel van 50% acetonitril, 47,5% water en 2,5% TFA. Residuele HCCA onopgelost blijven als de oplossing verzadigd is.
  2. Voeg recombinant humane insuline als een interne kalibrant. Hiervoor stelt een voorraadoplossing om een ​​eindconcentratie van 10 pg / ul in 50% waterig acetonitril, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik.

5. MALDI-TOF-massaspectrometrie

Opmerking: Kweekomstandigheden specifiek voor de belangwekkende organismen worden gebruikt. Monsters voor MALDI-TOF MS kan worden bereid hetzij uitstrijkje voorbereiding of extractie, afhankelijk van het organisme (zie paragraaf 8.4.1). Terwijl de ethanol-mierenzuur zuurextractiemethode voldoende inactivatie van pathogenen, uitstrijkje preparaat moet worden uitgevoerd onder Sufficient bioveiligheid situaties zoals voorgeschreven (zie hoofdstuk 1). Meestal is er geen besmettingsgevaar na het aanbrengen van de matrix, maar specifieke pathogenen specifieke inactivatie protocollen vereist. Dus bijvoorbeeld MALDI-TOF MS van Nocardia species vereist previous lysis van de bacteriën in kokend water, gevolgd door ethanol precipitatie van eiwitten 23. EI Khéchine et al. ontwikkelde een methode voor inactivering van mycobacteriën, verwarmen van de bacteriële kolonies bij 95 ° C gedurende 1 uur in schroefdop buizen die water en 0,5% Tween 20 24.

  1. smear Voorbereiding
    1. Verspreid een speldenknop kleine hoeveelheid van een bacteriële kolonie direct op een MALDI richtplaat stand ( 'spot').
    2. Overlay elke plek met 1 pl van HCCA reguliere matrix of matrix met de interne kalibrant en laat kristalliseren bij kamertemperatuur. Voor de bepaling van de exacte massa van de kalibratie piek, bedekken controle spot met 1 pl Test Standard en 1 pl HCCA matrix die de interne kalibrant.
      Opmerking: Hier, zoals Test Standard een extract van Escherichia coli DH5 alpha wordt gebruikt die een goede illustratie van een karakteristiek eiwit vingerafdruk in MALDI-TOF MS. Het wordt verrijkt met twee eiwitten die de bovengrens van het detecteerbare massa uit te breiden.
  2. extractiemethode
    1. Harvest ongeveer vijf kolonies van een agar plaat cultuur met een inenting lus en grondig op te schorten in 300 ul tweemaal gedestilleerd water in een 1,5 ml reactie buis. Voeg 900 pi absolute ethanol en meng goed door herhaaldelijk pipetteren totdat de bacteriekolonies volledig gestopt zijn.
      Opmerking: In deze stap is het mogelijk en gevestigde de monsters opgeslagen bij -20 ° C. Bovendien kan inactivatie van pathogenen worden getest door uitstrijken 1-10 pi van het extract op een geschikte agarplaat na incubatie met optimale groeiomstandigheden. succesvol inactivering wordt aangegeven door de afwezigheid van microbiële groei.
    2. Centrifugeer het monster bij 13.000 xg gedurende 1 min, gooi het supernatant en droog de pellet bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet zorgvuldig door pipetteren en neer in 50 ui 70% mierenzuur.
    3. Voeg 50 ul acetonitril en meng. Verwijderen afval door centrifugatie bij 13.000 xg gedurende 2 minuten. Overdracht 1 ul van supernatant op een steekproef positie op een MALDI richtplaat en laten drogen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Overlay elke vlek met 1 pl HCCA matrix met interne kalibrant en laat kristalliseren bij kamertemperatuur.
  3. Registratie van Mass Spectra
    Opmerking: Piek-picking uit massa spectra wordt gedaan met behulp van de standaard procedures aanbevolen (Zwaartepunt algoritme; S / N ratio:. 2; rel Intensity drempel: 2%; piekbreedte 3 m / z, aftrekken van de basislijn: TopHat)
    1. Kalibreren van het instrument volgens protoc de fabrikantol.
    2. Voor elke plek, verzamel 600 spectra in 100-shots stappen.
      1. Ga naar het tabblad "AutoXecute" van de configuratiesoftware van de massaspectrometer. Open de "Methode" door met de linkermuisknop te klikken op de "Methode" knop en kiezen van de methode bijvoorbeeld, "MBT_AutoX" uit het pulldown menu.
      2. Links-klik op de "Bewerken ..." knop rechts van het menu "Methode" om de "AutoXecute Method Editor" te openen. Ga naar het tabblad "accumulatie". Stel de "Som" waarde naar "600" en de "goede schoten in" value _X_ "schot stappen" naar "100".
  4. Internal Spectrum Kalibratieprocedure
    Opmerking: Minute meetfouten zijn inherent aan massaspectrometrie. Afhankelijk van intermitterende instrument gebruik, instrument temperatuur en re-kalibratie, kan de verkregen meetwaarden variëren tussen de experimenten. Na pre-meetinstrument kalibratie en nameting spectrum kalibratie naar een interne kalibrant is de meest nauwkeurige manier om inter-spectrum vergelijkbaarheid te garanderen.
    1. Voer de volgende procedures voor iedere ijking peak lijst:
      1. Start spectrum browser (bijvoorbeeld flexAnalysis open spectrum:. Menu "Bestand" → "Open ...")
      2. Maak massacontroleprogramma lijst met kalibrant peak: menu "Method" → "Open ...".
      3. Kies methode: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Open".
      4. Bewerken Mass Control List: Schakel alle ijkmiddelen.
      5. Voeg Calibrant piek onderaan: Peak Label: "Insulin_HIStag [M + H] + _ gem"; m_z: "5808,29"; Tolerantie [ppm]: "50"; Controleer Calibrant checkbox.
      6. Opslaan als, bijvoorbeeld, "MSPP kalibrant lijst".
    2. Voor elk spectrum, kiest u de kalibrant piek in de lijst, klikt u op "Automatisch toewijzen" en druk op "Ok".
ove_title "> 6. Controleer of de Kalibratieprocedure Internal

  1. Experimenteel Bepaal de exacte massa van de Calibration Peak.
    1. Bereid twee vlekken met 1 pi Test Standard elke (stap 5.1.1). Overlay de eerste met 1 pl reguliere HCCA matrix, de tweede met 1 pl-kalibrant spiked matrix.
    2. Verkrijgen massaspectra vanaf elke plek (paragraaf 5.3), en intern kalibreren van de Test Standard pieken (paragraaf 5.4).
    3. Overlay beide spectra door ze te openen met het spectrum (Bijvoorbeeld, flexAnalysis open spectrum: menu "File" → "Open ...") en het vinden van de piek bij de verwachte massa (insuline m / z = 5,808.29), dat in moet de kalibrant spiked spectrum, maar niet in het spectrum verkregen de vaste matrix.
  2. Controleer of de Calibrant Peak niet wordt verduisterd door Any Other Biomarker van het organisme of Interest.
    1. Bereid twee plekken (paragraaf 5.1) met de referentie-stam en overlay de eerste met 1 pl reguliere matrix, de tweede met 1 pl-kalibrant spiked matrix.
    2. Acquire massa spectra van beide plekken (paragraaf 5.3) en overlay de resulterende spectra door ze te openen met het spectrum browser (bijvoorbeeld flexAnalysis open spectrum: menu "Bestand" → "Open ..."). Controleer of de kalibrant piek is duidelijk zichtbaar in het spectrum verkregen met de puntige matrix en niet verduisterd door andere naburige signaal. Indien dit niet het geval is, kiest een kalibratiepunt voor dit organisme.
      Opmerking: Met behulp van een puntige interne kalibrant aanzienlijk verhoogt de nauwkeurigheid van variaties van biomarker massa te bepalen. Met deze methode kan massaverschillen naar 1 Da gedetecteerd. Als alternatief kan ook invariante massa's afkomstig van de organismen worden gebruikt als ijkmiddelen. Per definitie, all-organisme afgeleide massa moet worden beschouwd potentieel variabele tegendeel.

7. Identificeer Biomarker ionen in de Reference Strain

  1. Meet de Massaspectrum van de Reference Strain, met behulp van Matrix Spiked met de interne Calibrant.
    1. Verspreid een speldenknop kleine hoeveelheid van een bacteriële kolonie (paragraaf 5.1) of 1 ul van bacteriële eiwitten extract (paragraaf 5.2) direct op een MALDI richtplaat stand ( 'spot').
    2. Overlay elke plek met 1 pl HCCA matrix die de interne kalibrant en laat de richtplaat te kristalliseren bij kamertemperatuur (paragraaf 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Record massaspectra van de referentie-stam (paragraaf 5.3).
  2. Inwendig kalibreren het referentiespectrum de kalibratieoplossing massa (hier: insuline bij m / z = 5,806.29) en vervolgens pre-proces aftrekken van de basislijn (TopHat) en glad (parameters: SavitzkyGolay; breedte: 2 m / z, 10 cycli).
    1. Start spectrum browser (bijvoorbeeld flexAnalysis open spectrum: menu "Bestand" → "Open ...; ").
    2. Kies methode: pulldown menu "Method" → "Open ...", Links op de methode van keuze, bijvoorbeeld "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Open".
    3. Kalibreren spectrum door te kiezen voor "Internal ..." in het menu pulldown "Calibrate". Een venster opent een opsomming van de kalibrant piek (s) (paragraaf 5.4). Klik met de linkermuisknop de kalibrant piek (insuline) → Links-klik op "OK". Kies "Process spectra" van het "proces" pulldown menu.
    4. Voor baseline aftrekken activeert het spectrum in het spectrum lijst aan de rechterkant. Kies "Trek Mass Spectrum Baseline" van het "proces" pulldown menu.
    5. Om het spectrum glad, activeert het spectrum in het spectrum lijst aan de rechterkant. Kies "Smooth Mass Spectrum Baseline" van het "proces" pulldown menu.
  3. Uit het genoom sequencing gegevens van de referentie-stam, het berekenen van de theoretical monoisotoop molecuulgewicht van elk van de gecodeerde eiwitten door het vertalen van de DNA-sequentie in de overeenkomstige aminozuursequentie met een sequentie-alignment editor. Copy-paste dit eiwit sequentie in het invoerveld aan de ExPASy Bioinformatics Resource Portal (http://web.expasy.org/compute_pi/). en druk op "Klik hier" om pi te berekenen / Mw. Bij C. jejuni ssp. doylei het berekenen van de massa van 14 detecteerbare biomarkers.
  4. Kopieer de resultaten in een spreadsheet, met een kolom met het gen identificator en vervolgens het molecuulgewicht. Sorteer de rijen door berekende molecuulgewicht gemakkelijker opzoeken van de massa's te vergemakkelijken. Opmerking: andere kolommen zijn optioneel; functionele annotatie kan vooral handig zijn later voor interpretatie.
  5. Plaats een tweede kolom in de spreadsheet van het molecuulgewicht van-de methioninated vorm aftrekken 135 Da van de mono-isotopische molecuulgewicht. Let op: Dit is omdat sommige eiwitten na ondergaantranslationele modificatie door proteolytische verwijdering van de N-terminale methionine.
  6. Laat iedere belangrijke biomarker gemeten massa en de berekende massa van de referentiestam van het opzoeken van de gemeten massa van het genoom bovenstaande tabel (tabel 1) bereid.
  7. Als de biomarker ionen niet voorspeld genproducten kunnen worden toegewezen, overwegen andere posttranslationele modificaties (methylatie, acetylatie, prenylering, enz., Zie http://www.abrf.org/delta-mass voor een compilatie van wijzigingen en de bijbehorende massa veranderingen ). Voor elk ander bekend posttranslationele modificatie die vaak wordt waargenomen in de belangwekkende organismen voeg een andere kolom aan de tabel en herberekent het molecuulgewicht analoog aan de werkwijze voor de de-methioninated vorm.
  8. Opzetten van een ander tabblad spreadsheet, en neem voor elke biomarker ion de massa en identifier in een aparte kolom van de tabel.

8. Assess Biomarker variabiliteitin het bevolkingsregister

  1. Kalibreren massa spectra verkregen uit de collectie isoleert, zoals voor het referentie-stam (s) (paragraaf 5.4.2).
  2. Identificeer variant biomarkers in de massa spectra. Een variant massa wordt gekenmerkt door de afwezigheid van een massa bekend uit het referentiespectrum en het uiterlijk van een nieuwe massa niet in de referentie. Het massaverschil moet overeenstemmen met één aminozuuruitwisseling (tabel 2), of een combinatie daarvan.
  3. Bij één isolaat per rij, noteer de gemeten massa voor elke biomarker en de voorspelde isovorm in de respectieve tabel kolommen.
    Noot: In zeldzame gevallen kunnen sommige massaverschuivingen toegeschreven aan verschillende aminozuur uitwisselingen, bijvoorbeeld, beide N uitgewisseld D en Q uitgewisseld E, en vice versa, leidt tot een massaverschuiving van 0,985 Da (tabel 2). Deze intrinsieke probleem niet kan worden opgelost met behulp van massaspectrometrie alleen. Daarom verschillende isovormen op de eiwitsequentie niveau met dezelfde massamoeten worden behandeld als één MSPP type. Parallel Sanger sequentiebepaling van het bepaalde biomarker ion genen bevestigd dat dit probleem niet optreden tijdens het MSPP-typen van het C. jejuni ssp. doylei verzameling in deze studie isoleren.
  4. Bevestig roman MSPP soorten door middel van PCR-amplificatie en sequentiebepaling van de respectievelijke biomarker genen. Op zijn beurt, dit dient ook als een bevestiging dat de biomarker identiteit correct is toegewezen.
    1. Cultuur bacteriële isolaten onder optimale groeiomstandigheden. Cultuur C. jejuni ssp. doylei spanningen op Columbia agar aangevuld met 5% schapenbloed bij 37 ° C onder microaërofiele omstandigheden (5% O2, 10% CO2, 85% N2). Incubeer gedurende ca. 48 uur. Gebruik een apart agarplaat voor elke te isoleren om kruisbesmetting te voorkomen.
    2. Extract genomisch DNA van de bacteriële isolaten met een geschikte DNA extractie kit / geautomatiseerde machines volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Amplify de respectieve biomerkergenen gebruikmaking van de in tabel 3 vermelde primers Voer alle PCR reacties onder de volgende omstandigheden:. denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden; hybridisatie bij 55 ° C gedurende 30 seconden; verlenging bij 72 ° C gedurende 30 sec.
    4. Bepaal de DNA-sequentie van elke amplicon door Sanger sequentiebepaling met gebruikmaking van een geschikte hoeveelheid genomisch DNA (meestal 600-700 ng DNA volstaat bij een concentratie van ongeveer 100 ng / ul) en een van de amplificatieprimers (meestal gebeurt door gebruik van een service provider).
  5. In een aparte tabel (zie tabel 4), de afgeleide eiwitsequentie voor elke nieuwe isovorm opnemen via een geschikt vertaalhulpmiddel (bijv Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Bereken een MSPP-gebaseerde Fylogenie en vergelijk naar de Gold Standard

  1. Aaneenschakelen de specifieke biomarker aminozuursequenties die van thij MSPP aard van de isolaten in één ononderbroken reeks met behulp van een sequence alignment editor, zoals BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 of de biomarker spreadsheet.
  2. Bereken fylogenie door clustering zoals voor de gouden standaard typen data, bijvoorbeeld UPGMA clustering 21.
  3. Vergelijk de MSPP gebaseerde fylogenie aan die verkregen met de gouden standaard 4, 13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerder hebben we met succes een MSPP regeling voor C. jejuni ssp. jejuni 13. Hier, hebben we geprobeerd om de methode uit te breiden tot de broer of zus ondersoort C. jejuni ssp. doylei. In deze specifieke setting, zeven C. jejuni ssp. doylei isolaten werden uit de Belgische collectie van micro-organismen / Laboratorium voor Microbiologie UGent BCCM / LMG Gent, België verworven. Alle zeven isolaten gebruikt voor de analyses...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest kritische stap in de oprichting van een MSPP regeling is de ondubbelzinnige genetische bepaling van biomarkers ion identiteiten. Als het niet mogelijk is om een biomarker ongetwijfeld identificeren, dan moet worden uitgesloten van de regeling 13.

De C. jejuni ssp. doylei project omvat 14 verschillende biomarker ionen. Dit zijn 5 minder in vergelijking met de C. jejuni ssp. jejuni MSPP regeling 13 .De belangrijkste verschil tu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn Hannah Kleinschmidt dankbaar voor uitstekende technische ondersteuning. Dit artikel werd gefinancierd door het Open Access-ondersteuningsprogramma van de Deutsche Forschungsgemeinschaft en het publicatiefonds van de Georg August Universität Göttingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
acetonitrileSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany34967
Autoflex III TOF/TOF 200 systemBruker Daltonics, Bremen, GermanyGT02554 G201Mass spectrometer
bacterial test standard BTSBruker Daltonics, Bremen, Germany604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Germany263564Software Package
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, Bremen, Germany82901905 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8843ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG7790ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8870NCTC A613/87
Columbia agar base Merck, Darmstadt, Germany1.10455.0500500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Germany251419Software Package
defibrinated sheep blood Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, GermanySR0051
ethanolSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany02854 Fluka
formic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyF0507
HCCA matrixBruker Daltonics, Bremen, Germany604531
Kimwipes paper tissueKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyZ188956
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Bremen, Germany259935Software Package
Mast Cryobank vialsMast Diagnostica, Reinfeld, GermanyCRYO/B
MSP 96 polished steel targetBruker Daltonics, Bremen, Germany224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany51304
recombinant human insulinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI2643
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyT6508
water, molecular biology-gradeSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyW4502

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247(2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004(2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924(2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MALDI TOF MStypering op stamniveaubiomarker ionanalysefyloproteomische relatiesribosomale eiwittenbereiding van matrixoplossingcentrifugatieprotocolacquisitie van massaspectra

Gerelateerde artikelen