Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54167

⸱

29 augustus 2016

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een nieuw model van een gehumaniseerde muizenlever, gegenereerd in Alb-toxinereceptor-gemedieerde cel-knockout (TRECK)/SCID-muizen na de transplantatie van onvolgroeide en uitbreidbare menselijke hepatische stamcellen.

Samenvatting

Een nieuw diermodel met chimerische muizen met gehumaniseerde leveren, gevestigd via transplantatie van menselijke hepatocyten, is ontwikkeld. Deze muizen, waarbij de lever is herbevolkt met functionele menselijke hepatocyten, kunnen dienen als een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van menselijke hepatische celbiologie, geneesmiddelmetabolisme en andere preklinische toepassingen. Een van de belangrijkste factoren die vereist zijn voor succesvolle transplantatie van menselijke hepatocyten in muizen is het elimineren van de endogene hepatocyten om concurrentie met de menselijke cellen te voorkomen en een geschikte ruimte en micro-omgeving te bieden voor het bevorderen van de expansie en differentiatie van donorcellen van mensen. Tot nu toe zijn er twee belangrijke muismodellen met leverbeschadiging gevestigd met behulp van fumarylacetoacetaat hydrolase (Fah) en uroplasminogeen activator (uPA) muizen. Echter, Fah-muizen worden voornamelijk gebruikt met volwassen hepatocyten en de toepassing van het uPA-model wordt beperkt door verminderde fok. Om deze beperkingen te overwinnen, werden Alb-toxine receptor gemedieerde cel knockout (TRECK)/SCID-muizen gebruikt voor in vivo differentiatie van onvolgroeide menselijke hepatocyten en de generatie van gehumaniseerde leveren. Menselijke hepatische stamcellen (HpSCs) hebben met succes de leveren van Alb-TRECK/SCID-muizen herbevolkt die een dodelijke fulminante leverfalen hadden ontwikkeld na behandeling met difterietoxine (DT). Dit model van een gehumaniseerde lever in Alb-TRECK/SCID-muizen zal functionele toepassingen hebben in studies met geneesmiddelmetabolisme en interacties tussen geneesmiddelen en zal andere in vivo en in vitro studies bevorderen.

Inleiding

Muizen worden vaak gebruikt voor farmaceutisch onderzoek omdat biomedisch onderzoek bij mensen beperkt is1; deze modellen zijn echter niet altijd nuttig omdat ze de effecten die bij mensen worden waargenomen mogelijk onnauwkeurig simuleren. De meeste medicijnen die momenteel in de geneeskunde worden gebruikt, worden voornamelijk in de lever gemetaboliseerd. Echter, hetzelfde medicijn kan in de lever van een muis en een mens in verschillende metabolieten worden omgezet vanwege verschillen tussen soorten. Daarom is het vaak moeilijk om tijdens de ontwikkeling vast te stellen of een potentieel medicijn risico's met zich meebrengt voor klinische toepassingen2,3.

Om dit probleem aan te pakken, zijn "gehumaniseerde" muizenlevers ontwikkeld door menselijke levercellen in muizen te laten groeien4-6; deze modellen vertonen drugsreacties die vergelijkbaar zijn met die in de menselijke lever. De belangrijkste muismodellen die momenteel worden gebruikt voor het genereren van een gehumaniseerde lever, zijn uroplasminogene activator (uPA+/+) muizen4,7, fumarylacetoacetaat hydrolase (Fah−/−) muizen6 en de recent gerapporteerde thymidinekinase (TK-NOG) muizen.

Echter, eerdere rapporten hebben aangetoond dat getransplanteerde menselijke onrijpe cellen of stamcellen minder concurrerend zijn dan volwassen menselijke hepatocyten in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) muizenlevers8-10. Bovendien bieden Fah−/− muizen alleen een groeisvoordeel voor gedifferentieerde hepatocyten en niet voor onrijpe levervoorlopercellen11. De transplantatie van menselijke hepatische stamcellen (HpSCs) in TK-NOG muizen in het laboratorium is niet succesvol geweest. Daarom bestaat er momenteel geen nuttig muismodel voor de efficiënte aanplant van menselijke onrijpe levercellen.

Daarom hebben we een nieuwe Alb-TRECK/SCID muismodel ontwikkeld die efficiënt kan worden gerepleept met menselijke onrijpe hepatocyten. Dit transgene muismodel drukt humane heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HB-EGF) receptoren uit onder controle van een levercel-specifieke albumine-promotor. Na toediening van difterietoxine (DT) ontwikkelen deze muizen fulminante hepatitis door conditionele ablatie van hepatocyten, waardoor donorcelresidentie en -proliferatie mogelijk wordt12. Hoewel muizenhepatocyten in eerdere studies met succes zijn getransplanteerd in Alb-TRECK/SCID muizen13,14, is de generatie van een gehumaniseerde lever met behulp van Alb-TRECK/SCID muizen nog niet gerapporteerd.

In deze studie werden gehumaniseerde leveren in Alb-TRECK/SCID muizen gegenereerd via transplantatie van HpSCs. Deze gehumaniseerde lever biedt een in vivo omgeving voor universele stamceldifferentiatie en de mogelijkheid om menselijke drugsmetabolismepatronen en interacties tussen geneesmiddelen te voorspellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen Animal Protection van Yokohama City University.

1. Generatie van de acute leverschade muismodel

  1. Voeg 1 ml fenol 0,85% NaCl-oplossing (0,6 g fenol in 100 ml van 0,85% NaCl-oplossing) tot 1 mg difterietoxine (DT) van een 1 mg / ml voorraadoplossing DT maken. Noot: DT bij een concentratie van 1 mg / ml kan worden opgeslagen gedurende ongeveer 2 jaar bij 3 ° C tot 8 ° C.
  2. Serieel verdunnen de 1 mg / ml DT stockoplossing aan 0,3 ug / ml DT fenol 0,85% NaCl-oplossing en bereid een hoeveelheid van de 0,3 ug / ml DT-oplossing is als werkoplossing. Opmerking: Deze werkoplossing moet vers worden bereid.
  3. Experimenten met behulp van een subletale dosis (~ 50% sterfte) uit te voeren, te beheren 8 weken oude muizen een 1,5 ug dosis / kg van DT.
    1. Voer een intraperitoneale injectie van DT door het houden van de muis in dorsale decubitus en steek de needle onder de buiging van de knieën, links of rechts van de middellijn. Vermijd de middellijn penetratie van de blaas te voorkomen. Hoek de naald bij ongeveer 45 ° aan het lichaam.
    2. Met een insulinespuit Injecteer de muizen met 100 pl vers bereide 0,3 ug / ml DT per 20 gram muis gewicht. Bijvoorbeeld, zou een 18-g muis 90 pl van het 0,3 ug / ml DT oplossing ontvangt.
  4. Op 48 uur na DT-injectie, het verzamelen van bloed uit de staartader door het plaatsen van de muis in een restrainer en opwarming muis staart van de in een 37 ° C waterbad gedurende ongeveer 10 minuten aan de bloedvaten verwijden. Maak dan een 1-mm inkeping in de staart 2 cm vanaf de punt met een scherp scalpel en het verzamelen van het bloed met een microcapillaire buis.
    1. Centrifugeer de microcapillaire buis met het bloed bij 1500 g gedurende 5 minuten en verzamel het serum door het scheiden van het supernatant en celpellet.
  5. Pipetteer 50 ul van 1:20 verdund muis serum op GOT / AST-PIII glijdt. Meet de absorptie van het reactieproduct (blauwe kleurstof) bij 650 nm onder toepassing van een multifunctionele automatische droge-chemie-analysator volgens het protocol van de fabrikant.
    LET OP: Het uitlezen van aspartaataminotransferase (AST) / glutaminezuur oxaalazijnzuur transaminase (GOT) activiteit wordt automatisch weergegeven. 2 dagen na DT injectie, ongeveer 60% van de muizen vertoonden AST waarden tussen 12.000 - 16.000 IU / L en werden beschouwd te lijden aan acute beschadiging van de lever. Deze muizen werden overgebracht naar een nieuwe kooi en gebruikt als ontvangers celtransplantatie.

2. Voorbereiding van de humane lever stamcellen

  1. Isoleer humane lever stamcellen uit menselijke primaire foetale levercellen met een mobiele sorter met behulp van de CDCP1, CD90 en CD66 cel antigenen aan een CDCP1 + CD90 + CD66- subpopulatie te krijgen, dan is het zaad van de geïsoleerde cel populatie op collageen IV-gecoate cultuur gerechten, zoals eerder vermeld 15. Gebruik primaire foetale levercellen van een embryonale menselijkeleeftijd tussen week 14 en 18.
  2. Verzamel humane lever stamcellen gekweekt tot 80% - 90% samenvloeiing op 100-mm cultuur gerechten, zuigen het kweekmedium, was de cellen met 10 ml PBS, en verwijder de PBS. Trypsinize de cellen met 2 ml 0,05% trypsine / EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Cellen groter dan 90% confluentie zijn niet geschikt voor celtransplantatie sinds celdifferentiatie hun proliferatieve vermogen kunnen beïnvloeden muizen.
  3. De status van de cel dispersie onder een microscoop. Wanneer de cellen lijken te zweven of vrij stromende, stopt de enzymatische digestie door het toevoegen van 8 ml van DMEM / F12 met 10% FBS.
  4. Hang de cellen langzaam met behulp van een 10-ml serologische pipet en overdracht van de cellen in een 15-mL conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 100 xg en 4 ° C.
  5. resuspendeer voorzichtig de cel pellet in 10 ml DMEM / F12 met 10% FBS en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een microscoop telkamer.
  6. Verdeel de cellen in 1,0 x 10 6 cellen per 50 pl PBS porties voor elke individuele muis en opgeslagen op ijs tot transplantatie.

3. milt Transplantatie van humane lever stamcellen

  1. Plaats een schone kooi op een 37 ° C elektrische verwarming pad.
  2. Verdoven de muis met behulp van isofluraan inhalatie (1-1,5% (vol / vol) in 2 L zuurstof per min) door deze onder het mondstuk. U kunt ook gebruik maken van buizen met gaas doordrenkt met isofluraan.
    1. Zorg ervoor dat de muis wordt verdoofd door licht te knijpen de achterste voetzool. Als een knie ruk wordt opgewekt, plaatst u de muis terug in de kamer. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
  3. Scheren de operatieplaats via tondeuse en toepassen 70% (vol / vol) ethanol en povidonjood te steriliseren. maak dan 1 cm huidincisie in de linker flank net onder de ribben rand van de ribben, gevolgd door een insnijdingde buikwand en het peritoneum.
  4. bloot de milt zorgvuldig. Gebruik een 100-gl microinjectie spuit met een 32 G-1/2-inch naald direct te injecteren 1,0 x 10 6 humane lever stamcellen in 50 pi PBS in de milt van elke muis. Kantel de naald in een 5 ° hoek voor injectie.
    1. Waarborgen dat de diepte van de injectie minder dan de helft van de dikte van de milt. De naald moet de milt voeren aan één uiteinde (het hoofd) en de cellen aan het andere uiteinde (de staart) te deponeren.
  5. Om lekkage van de cellen na de injectie te voorkomen, voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een vinger gedurende 2 minuten en verwijder de naald.
  6. Plaats de milt terug in de muis lichaam en sluit de holte met een normale doorlopende draad voor de spieren en de huid.
  7. Breng de muizen in een 37 ° C voorverwarmde kooi onmiddellijk na transplantatie. Om de muis te waarborgen is in staat om comfortabel te ademen, plaatst u de muis op zijn kant in de kooi, eenvoiding contact tussen de aanwezige kooi en de plaats van de operatie.
  8. Bewaken van de muizen tot de verdoving is uitgewerkt om ervoor te zorgen de hechtingen gesloten blijven en de muizen terug te keren naar pre-operatie omstandigheden.
  9. Zorg ervoor dat de muizen worden geleverd met een normale drinkwater en voedsel. Na 1 uur terug de kooi om de muis ruimte van het dier centrum en dagelijks toezicht op de muizen.

4. Detectie van getransplanteerde humane lever stamcel-afgeleide hepatocyten in de muizenlever

Opmerking: Voor de volgende procedures, euthanaseren alle dieren met behulp van een overdosis van ketamine en xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie.

  1. Op 4-6 weken na transplantatie, euthanaseren de muizen en open de buikholte door tegelijkertijd het snijden van de cutis en fascia met behulp van chirurgische schaar.
  2. Ontleden het bindweefsel boven het peritoneum, met de schaar als spreader, en snijd het buikvlies langs de linea alba de peritoneale openenholte.
  3. Til het borstbeen met een tang, doorboren het membraan en doorsnijden weerskanten van het borstbeen omhoog door de baarmoederhals gordel.
  4. Scheidt de vena cava de thoracale zijde van de lever en trek de slokdarm door de lever in de voorste richting. Verwijder het membraan om de lever te verwijderen.
    Opmerking: Wees voorzichtig te houden van de uiteinden van de schaar wees naar boven om eventuele schade aan de thoracale organen eronder te voorkomen. De thymus heeft de neiging om af vasthouden aan de dorsale zijde van het borstbeen en dit moet zorgvuldig worden vermeden.
  5. Met het membraan als handgreep, beginnen trekken van de lever uit de buikholte. Het interieur vena cava zal worden met de lever op zijn plaats. Snijd het interieur vena cava; wees niet te vroeg te bevrijden van de juiste bijnier.
    Let op: Muizen hebben een vier-lobbig lever, bestaande uit een mediane kwab, links kwab, rechter kwab, en de Spiegelse kwab. De galblaas hangt in kleine vertakking vande mediaan kwab.
  6. Scheid de lobben van elkaar op de kruispunten en insluiten in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding volgens protocol van de fabrikant. Bevriezen van de LGO met het leverweefsel in de metalen roosters op de cryostaat.
  7. Cut-5 urn dikke secties monster met behulp van een cryostaat bij -18 ° C en brengen ze op RT objectglaasjes. Bewaar de voorraad bij -80 ° C. Bereid de dia's hematoxyline en eosine (H & E) en immunofluorescentie kleuring volgens eerder beschreven procedures 16.

5. Detectie van humaan albumine secretie en berekening van de chimere Rate

  1. Lever reconstitutie menselijke meten uitvoeren humaan albumine ELISA met serum en humaan albumine ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Bereken het gehumaniseerde lever chimere rente met real-time PCR-analyse van expressie niveaus in de hele-gehumaniseerde lever. Bepaal de relatieve expression hoogte verhouding van humaan-specifieke actine mens-muis kruis actine (verhouding 1) en de verhouding van muisspecifieke actine mens-muis kruis actine (verhouding 2). Het chimere wordt berekend als verhouding 1 / (verhouding 1 + verhouding 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alb-treck / SCID-muizen hepatocyten uiten het menselijk DT-receptor HB-EGF-gen onder de controle van een albumine promoter en cytotoxische effecten vertonen na toediening DT 12. Om de effecten van DT behandeling op leverbeschadiging evalueren, werden DT doses van 1,5 gg / kg geïnjecteerd in 8 weken oude Alb-treck / SCID-muizen en aandoeningen van lever 48 uur na toediening DT werden histologisch beoordeeld. Vergeleken met controlemuizen (niet behandeld met DT), de DT-behandeld...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Recente studies hebben aangetoond dat de muizenlever kan worden herbevolkt met menselijke hepatocyten, met inbegrip van volwassen hepatocyten en proliferatieve hepatische stamcellen 17. Deze bevolkt levers zijn gebruikt als preklinische experimentele modellen voor geneesmiddelmetabolisme testen en geneesmiddelen en ontwikkeling 18; bovendien hebben zij voorzien in een in vivo omgeving voor cellen rijping en differentiatie 19. Het belangrijkste doel van dit onderzoek was om een ​...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

We wensen het Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, te danken voor het verstrekken van de muizen. We danken ook S. Aoyama en Y. Adachi van het ADME (Absorptie, Distributie, Metabolisme, Uitscheiding) & Toxicology Research Institute, Sekisui Medical Company Ltd., Japan, en K. Kozakai en Y. Yamada voor hun hulp bij de LC-MS/MS analyse. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Grants-in-Aid van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan aan Y-W.Z. (18591421, 20591531 en 23591872); door het Jiangsu innovatieve en ondernemende project voor de introductie van hoogwaardig talent en het Jiangsu wetenschap en technologie planning project (BE2015669); en door subsidies aan H.T. voor Strategische Bevordering van Innovatieve Onderzoek en Ontwikkeling (S-innovatie, 62890004) van de Japan Science and Technology Agency.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Human albuminSigmaA6684Muis
Human CK19DakoM088801Muis
Human nucleiMilliporeMAB1281Muis
Human CK8/18ProgenGP11Mare
CDCP1Biolegend324006Muis
CD90BD559869Muis
CD66BD551479Muis
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0.05% Trypsin-EDTA Gibco25300-054
Diphtheria ToxinSigmaD0564-1MG
Human Albumin ELISA KitBethyl LaboratoriesE88-129
Spuit (1 ml)TerumoSS-01T
32G 1/2" naaldTSKPRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)Sakura Finetek Japan4583
MoFlo hoge snelheid celsorteerderBeckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Referenties

  1. Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
  2. Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
  3. Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
  4. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
  5. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
  6. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
  7. Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
  8. Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
  9. Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
  10. Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
  11. Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
  12. Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
  13. Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
  14. Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
  15. Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
  16. Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
  17. Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
  18. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
  19. Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
  20. Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
  21. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
  22. Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Alb TRECK SCID muizenbehandeling met difterietoxinegehumaniseerd levermodelmiltinjectietechniekceltransplantatieproceduremenselijke albuminesecretieniveau van leverrepopulatiechimeer muismodelstudies naar geneesmiddelmetabolisme
Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.