Methodenartikel

VacuSIP, een verbeterde INEX Methode voor het

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54221

⸱

3 augustus 2016

 ,  ,  , 
1Department of Marine Ecology, Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB-CSIC), 2Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC), 3The School of Marine Science, Ruppin Academic Center

In dit artikel

Samenvatting

We introduceren de VacuSIP, een eenvoudige, niet-invasieve en betrouwbare methode voor schoon en nauwkeurig puntsampling van water. Het systeem werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de gelijktijdige verzameling van het water dat wordt ingeademd en uitgeademd door benthische suspensie-voeders in situ, om de verwijdering en uitscheiding van deeltjes en opgeloste verbindingen schoon op te meten.

Samenvatting

Benthische suspensie-voeders spelen essentiële rollen in het functioneren van mariene ecosystemen. Door grote volumes water te filteren, plankton en detritus te verwijderen en deeltjes- en opgeloste verbindingen uit te scheiden, dienen ze als belangrijke agenten voor benthische-pelagische koppeling. Nauwkeurige meting van de verbindingen die door suspensie-voeders worden verwijderd en uitgescheiden (zoals sponzen, ascidiën, polychaeten, tweekleppigen) is cruciaal voor de studie van hun fysiologie, metabolisme en voedingsecologie, en is fundamenteel om de ecologische relevantie van de nutriëntenstroom gemedieerd door deze organismen te bepalen. Echter, de beoordeling van de snelheid waarmee suspensie-voeders deeltjes- en opgeloste verbindingen in de natuur verwerken, wordt beperkt door de beperkingen van de momenteel beschikbare methodologieën. Ons doel was om een eenvoudige, betrouwbare en niet-invasieve methode te ontwikkelen die schone en gecontroleerde watermonsters vanaf een specifiek punt zou toelaten, zoals de uitstroomopening van benthische suspensie-voeders, in situ. Onze methode maakt gelijktijdige bemonstering van ingeademde en uitgeademde water van het bestudeerde organisme mogelijk door gebruik te maken van kleine buisjes geïnstalleerd op een op maat gebouwd manipulatorapparaat en zorgvuldig gepositioneerd in de uitstroomopening van het bemonsterde organisme. Door een septum op het opvangvat met een spuitnaald te doorboren die aan het uiteinde van elke buis is bevestigd, kan de externe druk het bemonsterde water langzaam door de bemonsteringsbuis in het vat forceren. De langzame en gecontroleerde bemonsteringssnelheid maakt het mogelijk om de inherente ongelijkmatigheid in het water te integreren terwijl een bemonstering vrij van besmetting wordt gegarandeerd. We geven aanbevelingen voor de meest geschikte filterapparaten, opvangvat en opslagprocedures voor de analyse van verschillende deeltjes- en opgeloste verbindingen. Het VacuSIP-systeem biedt een betrouwbare methode voor de kwantificering van ongestoorde suspensie-voedermetabolisme in natuurlijke omstandigheden die goedkoop en gemakkelijk te leren en toe te passen is om de fysiologie en functionele rol van filters in verschillende ecosystemen te beoordelen.

Inleiding

Benthische schorsing feeders spelen een essentiële rol in het functioneren van mariene ecosystemen 1. Door het filteren van grote hoeveelheden water 2,3, ze te verwijderen en scheiden deeltjes (plankton en detritus) en opgeloste verbindingen 1 (en referenties daarin) en zijn een belangrijk middel van benthische-pelagische koppeling 4,5 en voedselkringloop 6,7. Nauwkeurig meten van de deeltjes en opgeloste stoffen verwijderd en uitgescheiden door benthische schorsing feeders (zoals sponzen, ascidians, borstelwormen en tweekleppigen) is fundamenteel voor hun fysiologie, metabolisme en het voeden van de ecologie te begrijpen. Samen met pompsnelheid metingen, maar maakt het ook mogelijk een kwantificering van de nutriënten gemedieerd door deze organismen en de ecologische invloed op de kwaliteit van het water als op het ecosysteem grootschalige processen.

Het kiezen van de juiste methode voor het meten van verwijdering en productiesnelheden van deeltjes en opgeloste compond door ophanging filter feeders is van cruciaal belang voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens over hun voedselopname 8. Zoals opgemerkt door Riisgård en anderen, ongepast methodieken vooroordelen resultaten, vervormen experimentele omstandigheden, produceren onjuiste schattingen van de inname en uitscheiding van bepaalde stoffen, en kan leiden tot foutieve kwantificering van de nutriënten verwerkt door deze organismen.

De twee meest gebruikte methoden om deeltjes en opgeloste nutriëntfluxen in filter feeders meten betrekken ofwel incubatie (indirecte technieken) of gelijktijdig verzamelen van omgevings- en uitgeademde water (directe technieken). Incubatie technieken zijn gebaseerd op het meten van de verandering in de concentratie van deeltjes en opgeloste voedingsstoffen in het water geïncubeerd, en het schatten productiesnelheden of verwijdering vergelijking aan afdoende 8. Echter, het omsluiten van een organisme in een incubatie kamer kan zijn feedin verandereng en pompen gedrag als gevolg van veranderingen in de natuurlijke stroming regime door een daling in zuurstof en / of voedselconcentratie of door accumulatie van verbindingen uitscheiding in de incubatie 7,9 water (en referenties daarin). Naast de effecten van de begrenzing en gewijzigd water, een grote voorspanning van incubatie technieken voort uit re-filtratie effecten (zie bijvoorbeeld 10). Hoewel sommige van deze methodologische problemen zijn overwonnen door de juiste omvang en vorm van het incubatievat 11 of de introductie van een recirculerend stolp systeem in situ 12, deze techniek vaak onderschat verwijdering en productiesnelheden. Kwantificeren van de stofwisseling van opgeloste stoffen zoals opgeloste organische stikstof (DON) en koolstof (DOC) of anorganische nutriënten, heeft bewezen bijzonder gevoelig voor vertekeningen veroorzaakt door incubatie technieken 13 worden.

In de late jaren '60 en vroege jaren '70, Henry Reiswig9,14,15 een pionier in de toepassing van de rechtstreekse technieken om de verwijdering deeltjes te kwantificeren door reusachtige Caribbean sponzen, door afzonderlijk bemonstering van de water ingeademd en uitgeademd door de organismen in situ. Vanwege de moeilijkheid om Reiswig techniek toegepast bij kleinere suspensie feeders en meer uitdagende onderwater omstandigheden het grootste deel van het onderzoek op dit gebied was beperkt tot het laboratorium (in vitro) waarin de meeste indirecte technieken 16 incubatie. Yahel en collega's omgebouwd Reiswig directe in situ techniek om te werken in kleinere schaal omstandigheden. Hun methode, genaamd INEX 16, is gebaseerd op de gelijktijdige onderwater bemonstering van het water ingeademd (In) en uitgeademd (Ex) van ongestoorde organismen. De verschillende concentratie van een middel (bijvoorbeeld bacteriën) tussen twee monsters (INEX) een maat voor de retentie (of productie) van die stof door het dier. De Inex techniek maakt gebruik van een open einde buizen enafhankelijk van de excurrent straal door de pompende werking van het onderzochte organisme passief vervangen vaarwater in de verzamelbuis. Terwijl Yahel en collega succesvol deze techniek toegepast bij het ​​onderzoek van meer dan 15 verschillende suspensie feeders taxa (bijvoorbeeld 17), wordt de werkwijze beperkt door de hoge mate van oefening en ervaring nodig door de minuscule omvang van sommige excurrent openingen, en omstandigheden op zee.

Om deze obstakels te overwinnen, ontwikkelden we een alternatieve techniek gebaseerd op gecontroleerde zuiging van de bemonsterde water door minuut buizen (uitwendige diameter van <1,6 mm). Ons doel was om een eenvoudige, betrouwbare en goedkope apparaat dat schoon en gecontroleerd in situ water sampling uit een zeer specifiek punt, zou toelaten zoals de excurrent opening van bodemdieren schorsing feeders te creëren. Om effectief te zijn, heeft de werkwijze niet opdringerig zijn om te voorkomen dat de omgevingstemperatuur stromingsregiem beïnvloeden of wijzigen behavior van de bestudeerde organismen. Het apparaat hier gepresenteerd wordt genoemd VacuSIP. Het is een vereenvoudiging van het SIP is ontwikkeld door Yahel et al. (2007) 18 voor ROV-gebaseerde point sampling in de diepzee. De VacuSIP is aanzienlijk goedkoper dan de originele SIP en het is aangepast voor SCUBA-based werken. Het systeem is ontworpen volgens de principes gepresenteerd en getest door Wright en Stephens (1978) 19 en Møhlenberg en Riisgård (1978) 20 voor het laboratorium instellingen.

Hoewel het VacuSIP systeem is ontworpen voor in situ studies van het metabolisme van benthische feeders suspensie kan ook worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek en waar een gecontroleerde en schoon puntbronnen watermonster vereist. Het systeem is vooral handig wanneer de integratie gedurende langere perioden (min-uur) of in situ filtraties vereist. De VacuSIP is met succes gebruikt bij de Yahel lab sinds 2011, en ooktewerkgesteld in twee recente studies van nutriënten gemedieerd door het Caribisch gebied en de Middellandse Zee sponssoorten 21 (Morganti et al., ingediend).

Het gebruik van specifieke samplers, de verlengde bemonstering, en het veld omstandigheden, waarin VacuSIP wordt toegepast, leiden tot een aantal afwijkingen van de standaard oceanografische protocollen voor het verzamelen, filteren, en het opslaan van monsters voor gevoelige analyten. Om het risico van besmetting te verminderen door het VacuSIP systeem of het risico van wijziging van de bemonsterde water door bacteriële activiteit na inzameling, testten we diverse in situ procedures filtratie en opslag. Verschillende filterinrichtingen, opvangbakken en opslaan procedures om de meest geschikte techniek voor het analyseren van opgeloste anorganische (PO 4 3- NO x -, NH4 +, SiO 4) bereiken onderzocht en organische (DOC + DON) verbindingen, en ultra-plankton (<1081; m) en deeltjes organische (POC + PON) sampling. Om het risico van verontreiniging verder te verminderen, vooral onder veldomstandigheden, het aantal behandelingsstappen werd teruggebracht tot een minimum. De visueel formaat waarin de werkwijze wordt aangeboden is gericht op reproduceerbaarheid vergemakkelijken en de tijd die nodig is om de techniek efficiënt gehandeld.

Systeem overzicht

Monsters in situ gepompte water suspensie voeders met exhalant openingen van slechts 2 mm, wordt de pompactiviteit van elk monster eerst gevisualiseerd door het vrijgeven gefiltreerd fluoresceïne gekleurd zeewater naast de inhalatie-opening (en) en het observeren van de stroom vanaf de excurrent opening 16 (zie ook figuur 2B 18). Het water in- en uitgeademde door de studie monster (incurrent en excurrent) worden dan gelijktijdig bemonsterd met behulp van een paar minuten buizen op maat gemaakte manipulator geïnstalleerd of twee van de "arms "van een omgekeerde flexibele draagbare driepoot (figuur 1 en aanvullende Video 1). Het water ingeademd door de studie organisme wordt verzameld door nauwkeurig positioneren van het proximale uiteinde van een buis in of nabij de inhalatie opening van het onderzoek organisme. Een identiek buis wordt dan gepositioneerd binnen het excurrent opening. voor deze functie moet goede zorg contact of verstoring van het dier, bijvoorbeeld door sediment resuspensie voorkomen. de bemonstering beginnen een duiker doorboort een septum in het verzamelvat met een injectienaald aan de distale uiteinde van elke buis, zodat de uitwendige waterdruk in de steekproef er water in het vat door de monsterbuis. de zuiging wordt geïnitieerd door het vacuüm reeds gemaakt in de flacons en het drukverschil tussen de uitwendige water en afgevoerd monsterhouder .

Om te zorgen voor een schone collectie van uitgeademde water en per ongeluk opzuigen van ambi voorkomenent water 16, het water sampling rate heeft op een aanzienlijk lager tarief (<10%) dan de excurrent debiet te worden gehouden. De afzuiging wordt geregeld door de lengte van de buis en de inwendige diameter (ID). De kleine inwendige diameter zorgt ook voor een verwaarloosbaar dood volume (<200 pi per meter buis). Bemonstering gedurende langere tijd (minuten tot uren) kan de inherente patchiness van de meeste stoffen plaats integreren. Opdat voldoende monsters worden bewaard in langdurige onderwater bemonsteringen en voor vervoer naar het laboratorium, een in situ filtratie wordt aanbevolen voor gevoelige analyten. De selectie van de bemonstering schepen, filtratie assemblage, en slangen worden gedicteerd door de studie organismen en de specifieke onderzoeksvraag. De hieronder beschreven protocol veronderstelt dat een volledige metabolisch profiel van belang (voor een overzicht zie figuur 2). Echter, het modulaire karakter van het protocol maakt fof eenvoudige modificatie eenvoudiger of zelfs heel andere bemonsteringsschema's tegemoet te komen. Voor een volledige metabole profiel, moet de sampling protocol omvatten de volgende stappen: (1) Flow visualisatie; (2) Sampling ultra-plankton voeding (plankton <10 pm); (3) Steekproef anorganische voedingsstoffen opname en excretie (met behulp van in-line filters); (4) Sampling opgeloste organische opname en excretie (met behulp van in-line filters); (5) Particulate voeden en excretie (met behulp van in-line filters); (6) Herhaal stap 2 (ultra-plankton voeden als kwaliteitscontrole); (7) Flow visualisatie.

Wanneer het logistiek mogelijk is, verdient het aanbeveling het metabolische metingen worden gecombineerd met pompsnelheid (bijvoorbeeld de kleurstof voorkant snelheid werkwijze, 16) en de ademhaling metingen. Deze metingen worden het best genomen bij het begin en einde van de sessiesteekproeven. Voor de ademhaling meten, onderwater optoden of micro-elektroden de voorkeur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereidende stappen en Cleaning Procedures

  1. Reinigingsproduct
    1. Draag beschermende kleding, een laboratoriumjas en handschoenen te allen tijde. Uitvoeren van deze voorbereidende stappen in een schone ruimte vrij van stof en rook.
    2. Bereid een zoutzuur 5-10% zuur (HCl) met verse, kwalitatief hoogwaardige, dubbel gedestilleerd water.
    3. Bereid een 5% zeer goed oplosbaar basismengsel van anionogene en niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing (zie Materials List) met verse, hoge kwaliteit, dubbel gedestilleerd water.
    4. Bewaar alle oplossingen in schone, met zuur gewassen containers.
  2. Voorbereidende stappen en schoonmaak procedures (in het laboratorium)
    LET OP: Als fosforverbindingen zijn niet van belang, kan het HCl wassen worden vervangen door een hoge kwaliteit fosforzuur (H 3 PO 4) wassen (8% H 3 PO 4 uiteindelijke concentratie).
    1. Draag beschermende kleding, een laboratoriumjas en handschoenen te allen tijde.
    2. Wassende bemonsteringsapparaten (met uitzondering van de in-line roestvrijstalen Swinney filterhouder) met ruime hoeveelheid zuiver water. Laat het apparaat onderdompelen in 5-10% HCl-oplossing 's nachts. Spoel het apparaat opnieuw met ruime hoeveelheid van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water.
    3. Was het in-line roestvrijstalen Swinney filterhouders met ruime hoeveelheid zuiver water. Laat het filter houders weken in 5% sterk oplosbare basis mix van anionische en niet-ionische oppervlakte-oplossing 's nachts. Spoel ze opnieuw met voldoende hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water.
    4. Droog alle bemonsteringsapparaten, wikkel ze in aluminiumfolie en in een schone doos te houden tot gebruik.
  3. Zuig rate control
    1. Controle van de sampling rate door aanpassing van de lengte en de inwendige diameter van de intake buis volgens de geplande werkzaamheden diepte en de temperatuur van het water. Gebruik de volgende vergelijking (afgeleid van de Hagen-Poiseuille gebruikte vergelijking voor volledig ontwikkeld laminaire pijpstroming) als leidraad: figure-protocol-1 waarin F = stroomsnelheid (cm 3 min -1), AP = drukverschil (bar), r = inlaatbuis binnenradius (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = buislengte (cm ), V = water viscositeit (g cm -1 sec -1). Zie tabel 1 voor meer informatie.
    2. Houd bemonsteringsfrequentie dan 1% van de pompsnelheid van de bestudeerde dieren.
      LET OP: Het gebruik van geëvacueerd containers, soms met onbekende vacuüm stelt extra complicaties. Daarom is een veldtest zeer aan te bevelen. Op 10 meter diepte en ~ 22 ° C zeewater (40 PSU), een 50 cm inlaat slang met een inwendige diameter van 254 urn een gemiddelde schrijfsnelheid aanzuigsnelheid van ~ 26 sec -1 ui (1,56 ml min -1).
  4. sampling schepen
    1. Voor kleine monsters (3-20 ml, bijvoorbeeld ultra-plankton voor stroming cytmetrie) gebruik maken van pre-gestofzuigd steriele plastic buizen.
      OPMERKING: Pre-gestofzuigd steriele plastic buizen worden routinematig gebruikt voor standaard bloedonderzoek bij de mens; zorg ervoor dat de steriele buizen te gebruiken zonder toevoegingen. Deze gezogen steriele plastic buizen best bemonsterd met behulp van steriele eenmalig gebruik buishouder excentrisch Luer. Hoewel dit de meest veilige en efficiënte bemonsteringsapparaten, heeft een iets grotere dode volume in vergelijking met een eenvoudige naald.
    2. Voor grotere watermonsters zoals voedingsstoffen en opgeloste organische stoffen, gebruik maken van 40 of 60 ml glazen flesjes die voldoen aan de Environmental Protection Agency (EPA) criteria voor vluchtige organische analyses. Deze flesjes zijn voorzien van een polypropyleen dop met een PTFE-geconfronteerd met siliconen septum.
    3. Voor nog grotere volumes, gebruiken penicilline flessen met rubberen stop of thermosflessen.
    4. Gebruik high-density polyethyleen flacons (HDPE flesjes) voor silica monsters.
    5. Om monstervolume te verhogen en het risico van de stop losraken verminderentijdens de klim, evacueren (vacuüm) items 1.4.2-1.4.4 voor de duik met een vacuümpomp. Vacuüm handmatig met een handvacuümpomp of zelfs door zuigen de lucht met een spuit. Echter, voor het beste resultaat, een goede vacuümpomp wordt aanbevolen. Standard lyophilizers biedt hoog vacuüm.
      LET OP: Let vooral bij het gebruik van grote kolven gestofzuigd om ervoor te zorgen dat de snellere initiële zuigkracht tarief niet de uitgeademde watermonsters zouden vervuilen.
  5. Vessel schoonmaak procedures
    1. Voor opgeloste organische stoffen en NH4 + analyse, met nieuwe pre-gereinigde EPA flesjes.
    2. Spoel de flacons (glas en HDPE) voor analyse van andere voedingsstoffen als volgt:
      1. Spoel de injectieflacons (glas en HDPE) en polypropyleen dop met een hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water. Installeer een nieuwe silicium septum.
      2. Week de flacons (glas en HDPE) in 10% HCl gedurende ten minste 3 dagen en spoel met voldoende hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water.
      3. Verbranden het glazen flesjes bij 450 ° C gedurende 4 uur en laat afkoelen in de oven. Installeer de dop, en wikkel in aluminiumfolie tot gebruik.
  6. filters
    1. Gebruik bindmiddelvrije glasvezelfilters voor filtratie van opgeloste biologische monsters (bijvoorbeeld DOC, DON) en voor het verzamelen van deeltjesvormige organische (bijv POC, PON). Pak elk glas filter in een aparte aluminiumfolie envelop. Verbranden bij 400 ° C gedurende 2 uur om organische resten en op te slaan in een schoon en droog vat vervluchtigen tot gebruik.
    2. Gebruik of een bindmiddelvrije glasvezelfilters hierboven of 0,2 um polycarbonaat membranen voor het bemonsteren van anorganische nutriënten (bijv PO 4 3- NO x -, NH4 +). Maak de laatste eenmaal geïnstalleerd in de filterhouder zoals hieronder beschreven (1.7.3).
    3. Gebruik 0,2 um polycarbonaat membranen filters voor silica bemonstering. Reinig ze eenmaal installed in de filterhouder hieronder (1.7.3) toegelicht.
  7. Bereiding van filtratie samenstel
    1. Filter de sterk oplosbare basische mengsel van anionogene en niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing en de hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water door een 0,2 um filter alvorens ze naar de filtratie samenstel reinigen.
    2. Filtratie samenstel voor nutriënten en dan siliciumdioxide opgeloste organische stoffen:
      1. Plaats een verbrand bindmiddel-vrije glasvezel filters binnen de gereinigde in-line roestvrijstalen Swinney filterhouder.
      2. Gebruik een zuur gereinigde spuit 100 ml 5% sterk oplosbare basische mengsel van anionische en niet-ionische surfactant-oplossing en vervolgens 100 ml van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water doorheen het hele samenstel.
    3. Filtration assemblage voor SiO 4:
      1. Plaats het polycarbonaat filter in het gereinigde polycarbonaat filterhouder (PC filterhouder).
      2. Gebruik een zuur schoongemaakt spuit run 30 ml 5% HCl en 30 ml van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water door het gehele samenstel.
  8. System assembly
    1. Monteer het systeem voor onderzeese werken middels PEEK (polyetheretherketon) buis met een buitendiameter (OD) van 1,6 mm en een binnendiameter (ID) van 254 urn of 177 urn.
    2. Met een scherp mes of PEEK mes aan de buizen daarna tot de gewenste lengte.
    3. Bij het distale uiteinde (monsterhouder kant), past elke buis met een mannelijke Luer verbindingsstuk bevestigd aan een injectienaald. Zorg ervoor dat u de instructies van de fabrikant te volgen en lijn de platte kant van de blauwe flangeless ferrule met het einde van de buis voor het aandraaien van de groene noot.
    4. Bevestig de PEEK slang aan op het statief "armen" of custom-built manipulator met behulp van een isolerende tape.
    5. Bevestig een disposable injectienaald om de mannelijke Luer connector. Houd de naald met een beschermkapje om blessures te voorkomen.
    6. Het is duidelijk dat het etiket van de bemonstering vistuig en kleurcode alle ingeademd en uitgeademde componenten (bijvoorbeeld groen = In, rood = Ex).
    7. Op dezelfde kleurcode de sampling schepen met sets van gepaarde steekproeven schepen opeenvolgend genummerd.

2. Werken Onderwater

  1. Werk bouwrijp maken
    1. Vooronderzoek en de selectie van specimens
      OPMERKING: Als gevolg van de complexe aard van de onderwaterwereld bemonsteringsprotocol, besteedt de nodige tijd voor de voorbereiding zal zorgen voor een efficiënte sampling duik.
      1. De enquête van de werkplek en de nodige voorbereidingen van tevoren.
      2. Selecteer en markeer geschikt doelwit organismen die relatief gemakkelijk kunnen worden benaderd. Aangezien niet alle organismen per se actief kunnen zijn op het moment van de bemonstering duik, voor te bereiden meer werkstations dan je verwacht te proeven.
    2. Installatie van de basis ondersteuningen
      1. when werken aan genivelleerd substraat:
        1. Monteer de oorspronkelijke release clip van de flexibele statief op 1 kg duiken gewichten snel en eenvoudig te positioneren het naast het doel dier.
      2. Bij het werken aan verticale wanden:
        1. Mount base steun platen voor de VacuSIP systeem, haken voor accessoires spullen en hangers voor de opvangbak Het dragende dienblad tijdens de werkplek voorbereidingsfase (2.1.1).
        2. Wanneer flexibele draagbare statieven zijn gebruikt, gebruik bouten of twee-componenten epoxy hars om 10x10 cm PVC platen vast te stellen naast elke doeldier. Elke plaat moet een gat om de quick release clips van de flexibele draagbare driepoot hechten hebben.
        3. Wanneer de hars is uitgehard en de basisplaten zijn stevig bevestigd aan de wand, draai de snelkoppeling bevat, die als een stevige bevestiging voor de flexibele draagbare driepoot voor het VacuSIP systeem.
  2. Het installeren van de VaCUSIP
    1. Controleer of het monster pompt door het vrijgeven van gefilterde fluoresceïne kleurstof naast de inhalatie-opening en bevestigen dat de kleurstof aan het ontstaan ​​is door de exhalent opening zoals beschreven in Yahel et al. (2005) 16.
    2. Installeer de VacuSIP apparaat en plaats de inhalatie (IN) bemonstering buis binnen de inhalatie-opening of gewoon ernaast (binnen ~ 5 mm). Zorg ervoor dat de inhalatie-buis is niet in de nabijheid van een ander exhalant opening.
    3. Zorgvuldig richt de exhalant (EX) bemonstering buis in de richting van de Osculum / exhalant sifon en steek deze heel voorzichtig in, totdat het is gepositioneerd 1-5 mm binnen de Osculum / exhalant sifon (zie figuur 1 en aanvullende Video 1). Neem grote zorg niet om contact te maken met of de bemonsterde organisme anders verstoren.
    4. Voor en tijdens de bemonstering double-check de locatie van beide buizen.
    5. Na de bemonstering controleren of het monster is nog steeds pompen als described hierboven (2.2.1).
      OPMERKING: Omdat de beweging van de ene arm van het statief bij het manipuleren van de andere zou kunnen voorkomen, zorg ervoor dat je in de eerste plaats zet de inhalatie bemonsteringsleiding en in de tweede plaats de exhalant buis, die nauwkeuriger manipulatie vereist. In deze volgorde, zelfs als het manipuleren van de exhalant bemonsteringsbuis de beweging van de buis inhalatie kunnen veroorzaken, zal het geen invloed op de bemonstering.
  3. Modulaire onderwater bemonsteringsprocedure
    Opmerking: Afhankelijk van de vraagstelling, elk van de volgende experimentele stappen worden uitgevoerd als een stand-alone experiment. De volledige metabole profiel sampling protocol hieronder beschreven is een langdurig proces, waarbij tot 8 uur per monster (voor een overzicht zie figuur 2 en tabel 2). Zoals duiken voorwaarden en regels verschillen tussen bemonstering sites, regio's en instellingen, zijn duiken plannen niet opgenomen in dit protocol. Toch besteden uiterste zorg en METIculous planning aan het duiken plan. Besteed speciale zorg aan verzadiging en yoyo duikprofielen te voorkomen. Indien mogelijk, is het raadzaam deze experimenten op geringe diepte (<10 m) voeren. Gesloten circuit rebreathers kan erg handig zijn voor een dergelijke langdurige bemonsteringsplannen zijn.
    1. Voor het eigenlijke bemonstering begint, zorg ervoor dat er geen zichtbare sporen van fluoresceïne residu blijven en dat opgeschort sedimenten zijn voldaan of zijn weg wafted.
    2. Ultra-plankton, (geen filter wordt geïnstalleerd in deze stap!)
      1. Gebruik de naald op de IN (inhalatie) en EX (uitgeademde) gestofzuigd steriele plastic buizen septa doorboren. Controleer dat het water druipt in op de geplande koers en het verzamelen van 2-6 ml watermonsters.
      2. Op retrieval, houdt monsters in een koelbox op ijs. In het lab, te behouden met 1% paraformaldehyde + 0,05% EM graad glutaaraldehyde (eindconcentratie), of 0,2% EM leerjaar glutaaraldehyde. Freeze cryovials in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 &# 176; C tot analyse.
    3. Silicaat bemonstering en opslag
      1. Installeer de voorgereinigde inline roestvrij PC filterhouder met een 0,2 micrometer polycarbonaatmembraan tussen de naald en de Luer male connector aan het distale einde van de buis.
      2. Doorboren het septum dop van de voorgereinigde hogedichtheidspolyethyleen flesjes (HDPE flesjes) steekproeven starten. Controleer of beide samplers druipen en het verzamelen van 15 ml water in elk flesje.
      3. Houd de gekoelde monsters (4 ° C) tot analyse. Indien analyse niet kan beginnen binnen twee weken, op te slaan bij -20 ° C. Voor analyse ervoor zorgen dat de monsters ontdooid bij 50 ° C gedurende ten minste 50 min silica gels lossen.
        OPMERKING: Het membraan kan worden bewaard voor microscopie of DNA analyse nodig.
    4. Opgeloste anorganische stoffen (PO 4 3-, NO x -, NH4 +)
      1. Vervang tHij PC filtersamenstel met een vooraf gereinigd lijn roestvrijstalen filterhouder die een vooraf verbrand glasfilter bevat.
      2. Voordat de monsterneming, toe dat ten minste 20 ml zeewatermonsters door het gehele filtersysteem werden doorgegeven door EPA, HDPE flesjes of andere vacuümvat om de afzuiging te starten. Meet het volume van het verzamelde water voordat ze worden verwijderd.
      3. Doorboren het septum dop van de juiste EPA glazen flesjes te samplen te starten, controleer dan of beide samplers druipen, en het verzamelen van 25-30 ml voor nitraat en fosfaat analyse.
      4. Overschakelen naar nieuwe EPA glazen flesjes voor ammoniak analyse controleren of beide samplers druipen, en het verzamelen van 20 ml in elk flesje.
      5. Houd de monsters in een koude ruimte op ijs en bewaar bij -20 ° C tot de analyse.
        LET OP: Als slechts het filtraat van belang is, kan wegwerpspuit filters worden gebruikt voor de stappen 2.3.3 en 2.3.4.
    5. Opgeloste organische stoffen (DOC + DON) bemonstering en storing
      LET OP: Houd de monsters zo rechtop mogelijk gedurende het hanteren, zodat monster water niet in contact komt met het silicium septa.
      1. Ga door met de roestvrijstalen filtersamenstel en laat 20 ml zeewatermonsters in nieuwe EPA glazen flesjes, zoals hierboven beschreven.
      2. Bij het ophalen, houdt de monsters in een koelbox op ijs. In het lab, gebruik maken van een pre-verbrand glas Pasteur pipet de monsters met orthofosforzuur lossen (voeg 5-6 druppels 25% trace metal graad zuur in een 20 ml monster, uiteindelijke concentratie 0,04%) of zoutzuur (2 druppels van sporen metalen graad geconcentreerd zuur in een 20 ml monster, uiteindelijke concentratie 0,1%) en koel bewaren.
      3. Houd de gekoelde monsters (4 ° C) tot analyse. Indien monsters niet binnen een week verzameld, geanalyseerd opslag bij -20 ° C tot de analyse.
    6. Particulate organisch materiaal (POC, PON, POP)
      1. Ga verder met behulp van de stainless stalen filter assemblage en filter ten minste 500 ml van zeewater in een geëvacueerde 250 ml thermoskan. Vervang kolven indien nodig.
      2. Op retrieval, maken gebruik van een met lucht gevulde injectiespuit aan alle resterende zeewater te evacueren uit de filterhouder, wikkel het in aluminiumfolie, en op te slaan in een koelbox op ijs. In het laboratorium, de filter verwijderd uit de filterhouders en bewaren bij -20 ° C tot de analyse.

figure-protocol-2
Figuur 1. Een voorbeeld van een correcte installatie van de VacuSIP: (A) het bemonsteren van de ascidian Polycarpa mytiligera (Golf van Aqaba, Rode Zee) met behulp van een op maat gemaakte manipulator met de kleur code die wordt gebruikt groen voor ingeademd en geel voor uitgeademde watermonsters (foto door Tom Shelizenger en Yuval Yacobi); (B) het bemonsteren van de spons Agelas oroides (NW MiddellandseSea) met een Osculum breedte van 3 mm, met de VacuSIP apparaat. De kleurcode gebruikt is geel voor inhalatie en rood voor uitgeademde watermonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 2. Overzicht van de VacuSIP techniek in de sectie protocol beschreven. Het lab werk is vertegenwoordigd in gele vakken, het veldwerk in blauwe dozen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Tabel 1. De totale gemiddelde bemonsteringsfrequentie (ml min -1) verkregen met verschillende containersgebruikt voor water collecties en verschillende vacuüm niveaus: de kolven werden niet gestofzuigd (geen); EPA glazen flesjes en HDPE flesjes werden gestofzuigd de helft van hun volume (½ volume); steriele plastic buizen werden reeds gezogen door de fabrikant. Werken bij 5-8 meter diepte, watertemperatuur van 18-22 ° C, met behulp van PEEK buizen van 79 cm lengte en 25 urn inwendige diameter.

figure-protocol-5
Tabel 2. Overzicht van het bemonsteringsvat, fixeermiddel, inline filterconstructie, opslag en analysemethoden voor de sectie protocol beschreven. De geanalyseerde verbindingen zijn: ultra-plankton overvloed (plankton <10 pm), silicaat (SiO 4), fosfaat (PO 4 3-), nitriet + nitraat (NO 2 - + NO 3 -), opgeloste organische stof (DOM) ammonium (NH4 +) en fijn organisch materiaal(POM). Alle sampling schepen hebben silicium septum cap en worden gestofzuigd vóór de bemonstering. De fixeermiddelen zijn: paraformaldehyde + glutaraldehyde (Glut + Parafor) orthofosforzuur (H 3 PO 4) en zoutzuur (HCl). De in-line filter samenstellingen, gebruikt zijn: polycarbonaat filterhouders en polycarbonaat membraan 0,2 urn filters (PC filterhouder + PC membraan) en roestvrij staal filterhouders en bindmiddel-vrije glasvezelfilters GFF.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Optimalisatie van zeewater collectie methoden

Selectie van de collector flesjes en reiniging

VacuSIP-compatibele opvangbakken zou een septum die het mogelijk maakt de bemonstering te worden geïnitieerd door piercing met een injectienaald te hebben. Ze moeten de verhoogde onderwater druk (2-3 bar bij typische scuba werkdiept...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

voorbereidende stappen

Collector flesjes voor DOM en nutriëntenanalyses

Sinds collector schepen kunnen interageren met opgeloste micro-bestanddelen en de sampler muren kan een substraat voor de groei van bacteriën 30-34, verschillende flesjes voor DOM en voedingsstoffen collectie werden getest zijn. Borosilicate wordt niet aanbevolen voor silica kwantificering 33,35, omdat glazen flessen de aanvanke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Manel Bolivar voor zijn hulp bij het veldwerk. We zijn dankbaar voor de "Parc Natural del Montgrí, les Illes Medes i el Baix Ter" voor hun steun aan ons onderzoek en bemonstering permissies. De onderwaterwereld manipulator is ontworpen door Ayelet Dadon-Pilosof en gefabriceerd door Mr. Pilosof. Dit werk werd ondersteund door de Spaanse regering project CSI-Coral [subsidie ​​aantal CGL2013-43106-R RC en MR] en door een FPU beurs van "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" naar TM. Dit is een bijdrage van de Marine biogeochemie en Global Change onderzoeksgroep gefinancierd door de Catalaanse regering [subsidie ​​nummer 2014SGR1029] en ISF subsidie ​​1280-1213 en BSF subsidie ​​2.012.089 G. Yahel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GorillaPod, OriginalJobyGP000001flexible portable tripod 
Flangeless FerruleIDEX Health & Science P-200X1/16" in Blue/pk
Male NutIDEX Health & ScienceP-205X 1/16" in Green/10 pk
Female to Female LuerIDEX Health & Science P-658
Female-Male LuerIDEX Health & Science P-655
Peek Tubing (254 µm ID)IDEX Health & Science 15311/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft lengte. Alternatieve ID kan worden gebruikt.
Two component resin epoxyIVEGOR9257Meng de twee componenten van de hars goed door elkaar voor gebruik
(TOC) EPA VialsCole -Parmer03756-2040 ml glazen flacons. Ook gemaakt door Thomas Scientific (referentienummer 9711F09).
HDPE VialsWheaton986701 (E78620)20 ml hoge dichtheid polyethyleen flacons
Vacuette Z no additiveGreiner bio-one455001Voorverlucht door de fabrikant 
Septum Sample BottlesThomas Scientific1755C01250 ml glazen flessen 
Septum Cap 1WheatonW240844SP (E7865R)22-400 voor HDPE flacons 
Septum Cap 2WheatonW240846 (1078-5553)24-400 voor glazen flacons en flessen. Ook gemaakt door Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holdersPall516-906713 mm diameter
PTFE Seal WasherPall 516-8064ring voor roestvrijstalen filterhouders
TCLP Glass FiltersPall 516-9126binder-vrije glasvezelfilters, 13 mm diameter, poriëngrootte 0.7 µm
Polycarbonate Filter HoldersCole -Parmer1729513 mm diameter
Isopore Membrane FiltersMilliporeGTTP0130013 mm diameter, poriëngrootte 0.2 µm
Contrad 70 Solution Decon Labs1002zeer goed oplosbaar basismengsel van anionisch en niet-ionische oppervlakte-actieve stofoplossing 
Sterile Syringe FiltersVWR International Eurolab S.L.514-0061P25 mm diameter, poriëngrootte 0.2 µm
FluoresceinSigma-Aldrich(oude ref.28802) 46955-100G100 g
Holdex, disposable,sterileGreiner bio-one450263steriele, wegwerpbuishouder met afgecentreerde luer voor Vacuette
Sterile NeedlesIcoGammaPlus51600.7 mm x 30 mm
Cryovials NalgeneNalgeneV5007(Cat. No.5000-0020)2 ml
Cryobox carton RubilaborM-600145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric AcidSigma79617 of Gebruik alternatief Ultra-Pure Hydrochloorzuur, uiteindelijke concentratie 0,1%
ParaformaldehydeSigmaP6148500 g
GlutaraldehydeMerck8,206,031,00025%, 1 L
Hand Vacuum Pump Bürkle 5620-2181 of Gebruik alternatief standaard laboratoriumvacuümpomp

Referenties

  1. Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
  2. Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
  3. McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
  4. Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
  5. Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
  6. De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
  7. Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
  8. Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
  9. Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
  10. Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
  11. Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
  12. Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
  13. Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
  14. Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
  15. Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
  16. Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
  17. Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
  18. Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
  19. Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
  20. Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
  21. Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152(2014).
  22. Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
  23. Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
  24. Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
  25. Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
  26. Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
  27. Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
  28. Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
  29. Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
  30. Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
  31. Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
  32. Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
  33. Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
  34. Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
  35. Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
  36. Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
  37. Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
  38. Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
  39. Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
  40. Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
  41. Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569(2012).
  42. Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Benthische suspensievoedersparticulaire verbindingenVacuSIP methodewaterbemonsteringfiltervoedersflowcytometrieEPA buisjesPEEK buizen

Gerelateerde artikelen