Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Telomeer beschermt chromosomale uiteinden van afwijkende fusion en degradatie. Zoogdieren telomeer is samengesteld uit G-rijke hexamere herhalingen, TTAGGG en shelterin complexen. De telomere repeat sequentie van de nematode is vergelijkbaar met die van zoogdieren (TTAGGC). De meeste eukaryoten gebruik maken van telomerase aan telomeer herhalingen toe te voegen aan hun chromosomale uiteinden. Echter, 10-15% van kankercellen gebruik telomerase onafhankelijk mechanisme, bekend als alternatieve Verlenging van Telomeren (ALT) ^3. Eerder hebben we gemeld dat telomeer herhalingen en de bijbehorende sequenties, genoemd als Talt, werden versterkt in de telomeren va....

Protocol

1. Labeling Probes met digoxigenine-dUTP door PCR

1. Voer PCR labeling met 10x dNTP mengsel dat digoxigenine-dUTP zoals eerder beschreven ^13.
2. Zuiver PCR product met spin kolomzuivering volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Als de probe korter dan 200 bp, verwijdert vrije digoxigenine-dUTP spin-kolomchromatografie uit het reactiemengsel plaats van spin-kolomzuivering.

2. Voorbereiden polylysine gecoate glaasjes

Opmerking: De gehele procedure duurt ongeveer 2 uur. Meeste stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur met uitzondering van de droogstap.

1. Het schoonmake....

Results

Eerder werd gemeld dat de ALT overlevende kan ontstaan ​​uit telomerase-deficiënte mutant, TRT-1 (ok410), in een lage frequentie door het repliceren van intern gelokaliseerde 'Template van ALT' (Talt) sequenties voor telomeren onderhoud ^2. Gebruik PNA probe, konden we telomeren in ontleed geslachtsklieren (Figuur 2A) te visualiseren. De zwakke telomeer signaal werd waargenomen zowel in TRT-1 (ok410) en ALT overlevende. De fuzzy signaa.......

Discussion

Het belangrijkste voordeel van ons protocol is de eenvoud van de procedure zonder merkbare schade aan de morfologie van celstructuur. Verschillende stappen werden geoptimaliseerd voor C. elegans FISH in dit protocol. De kritische stappen voor een succesvolle vissen omvatten etikettering van probes, fixatie van embryo's en penetratie. Digoxigenine-dUTP labeling methode biedt een eenvoudig te gebruiken methode labeling met behulp van PCR of nick-translatie. Om lange doelsequentie te labelen, is nick-translati.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2x SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT			2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502