Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie

9.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54224

⸱

4 augustus 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In dit artikel

Samenvatting

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Samenvatting

Telomeer is een ribonucleoproteïnestructuur die chromosomale uiteinden beschermt tegen abnormale fusie en afbraak. Telomeerlengte wordt gehandhaafd door telomerase of een alternatieve route, bekend als alternatieve verlenging van telomeren (ALT)1. Onlangs is C. elegans opgekomen als een multicellulair modelorganisme voor de studie van telomeren en ALT2. Visualisatie van repetitieve sequenties in het genoom is cruciaal voor het begrijpen van de biologie van telomeren. Terwijl telomeerlengte kan worden gemeten door telomeer restrictiefragment assay of kwantitatieve PCR, geven deze methoden alleen de gemiddelde telomeerlengte. Daarentegen kan fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) de informatie van de individuele telomeren in cellen leveren. Hier bieden we protocollen en representatieve resultaten van de methode om telomeerlengte van C. elegans te bepalen door middel van fluorescente in situ hybridisatie. Deze methode biedt een eenvoudige, maar krachtige, in situ procedure die geen merkbare schade aan de morfologie veroorzaakt. Door gebruik te maken van fluorescerend gelabelde peptidenucleïnezuur (PNA) en digoxigenine-dUTP-gelabelde sonde, waren we in staat om twee verschillende repetitieve sequenties te visualiseren: telomeer herhalingen en sjabloon van ALT (TALT) in C. elegans embryo's en gonaden.

Inleiding

Telomeer beschermt chromosomale uiteinden van afwijkende fusion en degradatie. Zoogdieren telomeer is samengesteld uit G-rijke hexamere herhalingen, TTAGGG en shelterin complexen. De telomere repeat sequentie van de nematode is vergelijkbaar met die van zoogdieren (TTAGGC). De meeste eukaryoten gebruik maken van telomerase aan telomeer herhalingen toe te voegen aan hun chromosomale uiteinden. Echter, 10-15% van kankercellen gebruik telomerase onafhankelijk mechanisme, bekend als alternatieve Verlenging van Telomeren (ALT) 3. Eerder hebben we gemeld dat telomeer herhalingen en de bijbehorende sequenties, genoemd als Talt, werden versterkt in de telomeren van telomerase mutant lijnen die kritische steriliteit 2 overleefd.

Telomeerlengte werd gemeten door middel van kwantitatieve PCR of Southern blot, dat de gemiddelde lengte van telomeren totale 4,5,6,7 biedt. Lees telling van telomeer repeat in whole genome sequencing data is ook een indicator van de totale inhoud van telomeren 8. Hoewel Single telomeerlengte Analyse (STELA) kan over een lengte van een telomeer, kan geen ruimtelijke informatie telomeren 9 verschaffen. Terwijl POT-1 :: mCherry reportergen bevat de ruimtelijke informatie van telomeren in vivo, kan niet stukken dubbelstrengs telomeren vertegenwoordigen als POT-1 is een enkelstrengs telomeer eiwit 10.

Terwijl genoemde werkwijzen de gemiddelde informatie van repetitieve sequenties, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt het mogelijk om de hoeveelheid en ruimtelijke patroon van afzonderlijke sequenties van belang mbt een chromosomaal gebied. In plaats van zuivering van DNA, weefsels of cellen gefixeerd met de natuurlijke ruimtelijke informatie in FISH behouden. Zo FISH is een zowel kwantitatieve als kwalitatieve tool voor het observeren van de individuele herhaalde sequenties, zoals telomeer herhalingen.

Dit protocol verschaft een efficiënte werkwijze voor het gelijktijdig detecteren van zowel telolouter en andere repeats gebaseerd op verbeteringen van eerder beschreven methoden 11,12. C. elegans larven of volwassenen zijn meercellig organisme met zeer gedifferentieerde cellen. De heterogeniteit van cellen belemmert op de kwantitatieve analyse van een groot aantal telomere spots. Om het aantal geanalyseerde cellen te maximaliseren, embryo geïsoleerd en uitgespreid op de-polylysine gecoate glaasjes voor FISH. Bovendien kan dit protocol ook worden gecombineerd met immunofluorescentie.

Als bewijs dat het protocol werkt, wordt aangetoond dat het mogelijk is om te observeren en te kwantificeren twee verschillende repetitieve sequenties. DNA-probe tegen TALT1 werd gegenereerd met PCR eenvoudige integratie digoxigenine-dUTP. Dan is deze TALT1 probe en fluorescentie-gemerkte telomere PNA probe werden gelijktijdig gehybridiseerd. Vervolgens werd digoxigenine gedetecteerd door immunofluorescentie canonieke werkwijzen. Wij presenteren hier de vertegenwoordiger van de beelden, waar TALT1 colocalized met de telomeer in TRT-1 overlevenden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Labeling Probes met digoxigenine-dUTP door PCR

  1. Voer PCR labeling met 10x dNTP mengsel dat digoxigenine-dUTP zoals eerder beschreven 13.
  2. Zuiver PCR product met spin kolomzuivering volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Als de probe korter dan 200 bp, verwijdert vrije digoxigenine-dUTP spin-kolomchromatografie uit het reactiemengsel plaats van spin-kolomzuivering.

2. Voorbereiden polylysine gecoate glaasjes

Opmerking: De gehele procedure duurt ongeveer 2 uur. Meeste stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur met uitzondering van de droogstap.

  1. Het schoonmaken van de slides
    1. Plaats de objectglaasjes in een plastic container en spoel de glaasjes kort in gedestilleerd water (DW). Verwijder het water en de houder te vullen met DW bevattende 1% glasreiniger.
    2. Schud de objectglaasjes gedurende 15 minuten bij 50 rpm bij kamertemperatuur (RT). Was de dia's met DW 3tijden gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur.
    3. Was de dia's met 70% ethanol gedurende 15 min onder roeren. Gooi 70% ethanol en plaats de dia's op een 65 ° C droge blok en de lucht drogen gedurende 15 min.
  2. Polylysine coating van multiwell-objectglaasjes
    Opmerking: polylysine coating objecthouder is een belangrijke stap, aangezien het de hechting monster gedurende de kleuringsprocedure. Slecht beklede slide zal resulteren in het verlies van het monster.
    1. Verdun de polylysine voorraadoplossing tot 0,01% (w / v) in gedestilleerd water. Voeg 20 ul van de verdunde 0,01% (w / v) polylysine aan de putjes van een schone glasplaatje.
    2. Incubeer het objectglaasje gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Plaats de dia's op een 65 ° C droge blok en de lucht drogen gedurende 1 uur.
    4. Bewaar de polylysine dia's in de stofvrije doos.

3. Fixatie van Worms op de Slide Glass (figuur 1)

  1. De voorbereiding van embryo's voor FISH
    Opmerking: Harvest wormen voordat alle tHij bacteriële voedsel wordt verbruikt door het kijken naar de groei van de media onder de microscoop. Verhongering vermindert de productie van eieren van volwassen wormen en verhoogt ei uitbroeden. Methoden worden beschreven in 14,15.
    1. Groeien de wormen in 50 mm Petri-schaal volgens standaardwerkwijzen 14.
    2. Na al het bacteriële voedsel wordt geconsumeerd, snijd de agar media in het kwartaal af met een spatel. Steriliseer de spatel voor het snijden om besmetting te voorkomen.
    3. Zet al het stukje agar op de 100 mm nematode groei media (NGM) plaat. Draai het agar stuk op zijn kop voor de wormen aan de verse bacteriële voedsel te bereiken.
    4. Na 48 tot 72 uur, het verzamelen van de wormen met M9 buffer. Voeg 3-5 ml M9 buffer op de NGM plaat. Pipetteer M9 buffer op het oppervlak van de NGM wormen wassen.
    5. Verzamel de vloeistof met wormen en toe te voegen aan een 15 ml buis.
      Opmerking: Als er agar puin na de oogst, centrifuge de wormen in een 30% sucrose-oplossing. Terwijl afval gepelleteerd, wormen drijvenhet oppervlak.
    6. Voeg M9 buffer om het volume op 15 ml. Pellet de wormen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 3 minuten en verwijder het grootste deel van de M9 buffer. Herhaal deze stap nog 2 keer.
      Opmerking: Als de wormen nog steeds drijven na het centrifugeren, zet de rem niveau van de centrifuge naar waarde = 1.
    7. Zuig M9 buffer. Voeg bleekoplossing de wormen. Per 0,5 ml wormen, voeg 6,5 ml van DW, 2 ml hypochloriet, 1 ml 5 M KOH.
    8. Incubeer de wormen schommelen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 50 rpm. Vortex wormen gedurende 15 seconden voor het mechanisch afschuiven de wormen en bloot de eieren.
    9. Houd u aan de buis onder een dissectie microscoop tijdens het bleken. Zorg ervoor dat de wormen in de helft worden gesneden en eieren worden vrijgegeven. Wanneer het grootste deel van de volwassen lichaam is opgelost, voeg M9 buffer om het volume op 15 ml.
    10. Centrifugeren bij 300 g gedurende 3 min. Zuig het grootste deel van de M9 en voeg verse M9 buffer om het volume op 15 ml. Herhaal wassen stap 3 keer.
      Notitie:Vermijd het gebruik van overmatige hoeveelheid wormen, omdat ze het bleken proces belemmeren. Houd de totale reactietijd van minder dan 8 min, totdat het wassen. Over-gebleekte eieren produceren sterke autofluorescentie.
    11. Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing met polysorbaat-20 (PBST) tot 200 pl en 200 pl 4% paraformaldehyde (PFA) tot 2% PFA maken.
      Let op: Omdat PFA is kankerverwekkend, dragen beschermende kleding, handschoenen en een schild voor het gebruik van PFA.
    12. Voeg 40 ul van de eieren in 2% PFA op de bron van polylysine gecoate slide.
    13. Plaats de objectglaasjes in een vochtige kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Sluit de vochtige kamer direct na de dia's binnen zijn geplaatst.
      Opmerking: De eieren naar de bodem van de slede terwijl vast.
  2. De voorbereiding van ontleed geslachtsklieren voor FISH
    1. Harvest volwassen wormen gekweekt op 50 mm NGM plaat door pipetteren 1 ml M9 buffer. Harvest wormen voordat bacteriële voedsel is uitgeput.
    2. Was de wormen van alle bacteriën with M9 buffer, 2 keer.
      Opmerking: Resterende bacteriën kan beïnvloeden ontleed gonaden plakken aan polylysine gecoate glaasjes.
    3. Pellet de wormen door centrifugatie bij 300 x g. Verwijder M9 en de wormen naar de lege NGM plaat overzetten door micropipet.
    4. Voeg 30 pl M9 buffer bevattende 2 mM levamisol op een bron van polylysine behandeld slide.
    5. Voeg 500 pl buffer M9 een 1 ml buis. Met deze buffer om de wormen te dragen via de mond pipet.
    6. Vul het uiteinde van de mond pipet met M9 buffer door een capillair in 1 ml buis met het M9 buffer.
    7. Onder ontleden microscoop, zet de punt van de mond pipet vlak voor het hoofd van de volwassen worm en sleep de mond pipet, zodat de kop van wormen komt in de mond pipet. Zodra het hoofd van wormen komt de tip, zal het hele lichaam van de worm worden getrokken in de tip.
    8. Breng de wormen aan de polylysine gecoate dia met behulp van de mond pipet.
    9. Met behulp van een scheermes, afsnijdenf het hoofd of het puntje van de staart van wormen op de dia. Als de worm wordt gesneden, zal de geslachtsklieren eruit springt. Geslachtsklieren zal vasthouden aan de dia's.
      1. Maak minstens 30 wormen in een putje. Meer putjes kan worden gebruikt voor een andere 30 wormen.
    10. Plaats de dia in de vochtige kamer en zuig bij de M9 buffer met de mond pipet.
    11. Bevestig het monster door het toevoegen van 20 pl 2% PFA bij kamertemperatuur gedurende 15 min in vochtige kamer.

4. Fixatie en Permeabilisatie

  1. Plaats een aluminium blok op droog ijs en op te slaan in een diepvriezer (-80 ° C). WINKEL methanol en aceton bij -20 ° C.
  2. Na PFA fixatie stap 3.1.15 of 3.2.11, verwijder fixeermiddel met behulp micropipet verlaten ~ 5 ui van het fixeermiddel.
  3. Zet een andere polylysine gecoate dia op het monster dia. Verwijder het fixeermiddel met een papieren handdoek als de oplossing buitensporig. Laat de dia's niet verplaatsen als ze eenmaal aan elkaar geplakt zitten.
  4. Bevries de slidesop het aluminium blok ten minste 15 min.
    Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard gedurende minstens 2 - 3 dagen.
  5. Terwijl de dia's worden ingevroren, zet de potten met koude methanol en aceton op ijs.
  6. Neem de dia's uit en draai ze te bevriezen-barst het monster. Gooi de bovenste slede. Onmiddellijk genieten van de dia in de ijskoude methanol gedurende 5 minuten.
  7. Breng de objectglaasjes ijskoude aceton gedurende 5 minuten.
  8. Was de dia 3 maal met PBST gedurende 5 minuten om resterende fixeermiddel verwijderen. Naar de volgende stap of de objectglaasjes in 100% ethanol bewaren bij 4 ° C.
    Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard gedurende minstens 2 - 3 dagen.

5. Hybridisatie van gefixeerde cellen

  1. Voeg 20 gl RNase-oplossing (PBST dat 10 ug / ml RNase A). Incubeer de schuif in de vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  2. Was de dia tweemaal in 2x zoutoplossing en natriumcitraat met polysorbaat-20 (2x SSCT) gedurende 15 minuten elk.
  3. Voeg 20ul hybridisatieoplossing en zet de vochtige kamer in de 37 ° C incubator. Na 1 uur, verwijder de hybridisatie-oplossing door pipetteren.
  4. Voor het verwijderen van hybridisatie-oplossing, de voorbereiding van de sonde. Als de sonde wordt dubbele DNA denatureren de probes door verwarming bij 95 ° C gedurende 5 min op een droog blok. Na verwarmen, koelen van de sonde op het ijs in het kort.
  5. Voeg 10 ul hybridisatieoplossing bevattende probes aan het monster. Voor PNA probe gebruiksconcentratie in een verhouding van 1: 2000 en dig-gelabelde probe, gebruiksconcentratie in een verhouding van 1: 200. Bedek het monster met deksel glas.
  6. Plaats een papieren handdoek gedrenkt in water op het verwarmingsblok (80 ° C). Zet een plastic deksel op het verwarmingsblok de vochtigheid en temperatuur te behouden.
  7. Nadat de temperatuur van het verwarmingsblok gestabiliseerd (bij 80 ° C), plaats het monster dia op de verwarmde keukenpapier en bedekken de monsters met kunststof deksel. Denatureren van het monster voor 3 min.
  8. IncUbate de objectglaasjes in een vochtige kamer gedurende de nacht bij 37 ° C.

6. Wast en immunofluorescentie

  1. Warm de hybridisatie- wasoplossing (2 x SSC, 50% formamide) bij 37 ° C.
  2. Was het monster in PBST tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het deksel glas.
  3. Was het monster in hybridisatie- wasoplossing bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  4. Was het monster dia in PBST 3 maal bij kamertemperatuur. Opmerking: Voer alle volgende stappen in vochtige kamer bij kamertemperatuur.
  5. Voeg 20 ul van blokkeeroplossing en incubeer 1 uur bij KT in de vochtige kamer.
  6. Verwijderen blokkeeroplossing en voeg FITC geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaamoplossing (1: 200) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.

7. Montage en Observation

  1. Was het monster dia met PBST 2 keer voor 15 minuten elk.
  2. Voeg 10 ul van bevestigingsoplossing met DAPI. Leg het deksel glas en druk zachtjes. Verwijder eventuele overtollige oplossingmet een papieren handdoek.
  3. Verdamping van bevestigingsoplossing voorkomen, sluit de randen van het dekglaasje met nagellak.
  4. Observeer onder confocale microscoop. Uitsluiten embryo's met een hoge achtergrond. Focus op een veld met 4-20 kernen.
  5. Maak opnamen volgens de instructies van de fabrikant met 100X objectief.
    Opmerking: Excite monster met 405 nm laser voor DAPI, met 555 nm laser voor Cy3, met 488 nm laser voor FITC.

8. Kwantificering van Telomere Signal

Opmerking: Kwantificering werd uitgevoerd zoals eerder 16 beschreven. Alle beelden die moeten worden vergeleken geboden bij dezelfde instelling zoals belichtingstijd en lichtbron.

  1. Exporteer de afbeelding in .tif-formaat.
  2. Download en installeer de software voor beeldanalyse.
  3. Voer de beeldanalyse-software en klik op de knop eens.
  4. Klik op te drukken. Open de beelden met telomeer FISH door te dubbelklikken op het beeldbestand.
  5. Klik[Bewerken] - [select verwerking regio], selecteer gebied van belang door links te klikken en te slepen. Uitsluiten alle niet-specifieke kleuring.
  6. Klik [maatregel] - [spot extincties], selecteer het kanaal met een telomeer signaal en voer de bestandsnaam om de resultaten in .txt bestand op te slaan.
    Opmerking: De kolom resultaten zijn in de volgende volgorde: Fluorescentie spot, achtergrondintensiteit spot en gebied van vlek.
  7. Kopieer de waarden en aftrekken achtergrond intensiteit van de spot van de fluorescentie van spot. De waarden kunnen nu statistisch geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Eerder werd gemeld dat de ALT overlevende kan ontstaan ​​uit telomerase-deficiënte mutant, TRT-1 (ok410), in een lage frequentie door het repliceren van intern gelokaliseerde 'Template van ALT' (Talt) sequenties voor telomeren onderhoud 2. Gebruik PNA probe, konden we telomeren in ontleed geslachtsklieren (Figuur 2A) te visualiseren. De zwakke telomeer signaal werd waargenomen zowel in TRT-1 (ok410) en ALT overlevende. De fuzzy signaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het belangrijkste voordeel van ons protocol is de eenvoud van de procedure zonder merkbare schade aan de morfologie van celstructuur. Verschillende stappen werden geoptimaliseerd voor C. elegans FISH in dit protocol. De kritische stappen voor een succesvolle vissen omvatten etikettering van probes, fixatie van embryo's en penetratie. Digoxigenine-dUTP labeling methode biedt een eenvoudig te gebruiken methode labeling met behulp van PCR of nick-translatie. Om lange doelsequentie te labelen, is nick-translati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Mutatiestam van wormen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het Caenorhabditis Genetics Center. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI14C1277).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PNA probePANAGENEcustom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragmentsRoche11207741910gebruik 1:200 verdund in PBST
Digoxigenin-dUTPRoche11573152910
Bovine serum albumineSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP-6148bereid 4% paraformaldehyde door te verwarmen in DW met een paar druppels NaOH. voeg 0,1 volume van 10x PBS toe.
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
Hybridisatieoplossing3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextransulfaat, 50 μg/ml heparine, 100 μg/ml gist-tRNA, 100 μg/ml gesoniceerde zalmsperma-DNA
Hybridisatiewasoplossing2x SSC, 50% formamide
FormamideBIONEERC-9012toxisch
MethanolCarlo Erba
AcetonCarlo Erba
HeparineSIGMA-ALDRICHH3393maak 10 mg/ml voor voorraadoplossing
DextraansulfaatSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSVoor 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2,4 g KH2PO
PBST1x PBS, 0,1% tween-20
Polysorbaat 20SIGMA-ALDRICHP-2287Commerciële naam is Tween-20
Poly-L-Lysine oplossing (0,1% w/v)SIGMA-ALDRICHP-8920bereid vers 0,01% w/v oplossing voor gebruik
M93 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O tot 1 L
Bleekoplossing20% natriumhypochloriet, 0,5 M KOH
Antilichaambuffer1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Natriumazide (toxisch)
BlockingoplossingAntilichaambuffer met 5% bovien serumalbumine (BSA)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSCOm 1 L te maken, 175,3 g NaCl, 88,2 g natriumcitraat, H2O tot 1 L, breng pH op 7,0
2x SSCT2x SSC, 0,1% tween-20
10x digoxigenine-dUTP mix1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP
PCR zuiveringskolommenCosmo genetechCMR0112
Glasreiniger / ULTRA CLEANDukssan pure chemicals8AV721
Multi-well glazen plaatjeMP biomedicals96041205
Nematode groeimediaOm 1 L te maken, 3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton, H2O tot 974 ml. Autoclaveer en koel de flacon. Voeg 1 ml 1 M CaCl2 toe, 1 ml 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KPO4.
LevamisolSIGMA-ALDRICH196142
VuilnismesFeathermesje Nr. 11
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Confocal microscoopZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X werd gebruikt als objectieflens.
VochtigheidskamerKunststof doos gevuld met papieren handdoek gedrenkt in DW
Beeldanalysesoftware Dr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502

Referenties

  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189(2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30(2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790(1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019(2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Telomeer-FISHC. eleganstelomeerlengtealternatieve telomeerverlengingtelomeerkwantificeringfluorescentiemicroscopieprobe-hybridisatieantilichaamskleuring
Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.