Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

Samenvatting

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om Mesodermale Voorlopercellen (MPCs) te isoleren uit menselijk beenmerg (hBM). MPCs werden gekenmerkt door middel van flowcytometrie en nestine-expressie. Ze toonden het vermogen om aanleiding te geven tot exponentieel groeiende MSC-achtige celculturen terwijl ze hun angiogenesepotentieel behielden.

Samenvatting

In een onderzoeksstudie gericht op het isoleren van van menselijk beenmerg (hBM) afgeleide mesenchymale stromale cellen (MSCs) voor klinische toepassingen, identificeerden we een nieuwe celpopulatie specifiek geselecteerd voor groei in met menselijk serum aangevuld medium. Deze cellen worden gekenmerkt door morfologische, fenotypische en moleculaire kenmerken die verschillen van MSCs en we noemden ze Mesodermale Voorlopercellen (MPCs). MPCs zijn rond, met een dikke, sterk lichtbrekende kernregio; ze vertonen een sterke, trypsine-resistente hechting aan plastic. Het falen om MPCs direct te laten groeien, toonde aan dat ze langzaam in de celcyclus zijn. Dit wordt ook gesuggereerd door Ki-67-negativiteit. Aan de andere kant, het kweken van MPCs in standaard medium ontworpen voor MSC-expansie, gaf aanleiding tot een populatie van exponentieel groeiende MSC-achtige cellen. Naast het vertonen van mesenchymatische differentiatiecapaciteit, behielden MPCs angiogeen potentieel, wat hun meervoudige lijn voorlopercellen-natuur bevestigt. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om hBM-MPCs te isoleren en te karakteriseren door middel van flowcytometrie (CD73, CD90, CD31 en CD45), nestine-expressie en F-actine organisatie. Protocollen voor mesengene en angiogeen differentiatie van MPCs worden ook verstrekt. Hier suggereren we ook een meer geschikte nomenclatuur voor deze cellen, die zijn hernoemd als "Mesangiogene Voorlopercellen".

Inleiding

Mesenchymale stromacellen (MSC's) zijn van relevante klinische waarde voor de multi-lijn differentiatie vermogen en hun vermogen om hemopoiesis ondersteunen, groeifactoren / cytokinen uitscheiden en een rol spelen bij immuunregulatie ^1. In de definitie van MSC-gebaseerde therapieën cel productie en toepassing zijn het voorwerp van uitgebreide klinische en pre-klinisch onderzoek ² geweest, met bijzondere aandacht voor specifieke internationale regelgeving voor de veiligheid en de werkzaamheid van cellen gebaseerde geneesmiddelen (CBMP) behandelingen ^3. Menselijke MSCs zijn uitvoerig gekweekt in media die supplementen en reagentia van dierlijke oorsprong, zoals foetaal runderserum (FBS) en runder trypsine. Daarom opzij met besmettelijke risico's celmanipulatie patiënten ook te prion blootstelling en immunologische risico's van eiwitten, peptiden of andere biomoleculen van dierlijke oorsprong die kunnen blijven bestaan ​​na verzamelen van cellen en Transplantatie ^4.

Om het probleem te omzeilen, gekweekt we humaan beenmerg (HBM) afgeleide MSC's in dier-vrij medium, ter vervanging van FBS met gepoolde humaan type AB serum (PhABS). Onder deze omstandigheden Daarnaast groeit MSCs identificeerden we een nieuwe celpopulatie. Deze cellen waren morfologisch en fenotypische verschillen van MSC's en toonde een opvallende genexpressieprofiel evenals kenmerkende teelt / hechting. Ze behield zowel mesengenic en angiogene potentieel en daarom werden genoemd mesodermale Progenitor Cells (MTR) ^5. Vervolgens waren we in staat om selectieve en reproduceerbare kweekomstandigheden definiëren mediterrane partnerlanden bij hoge graad van zuiverheid ⁶ te genereren.

We verder onderzocht de morfologische en biologische eigenschappen van de mediterrane partnerlanden. De mediterrane partnerlanden toonde nestin-positief, langzaam in de wielersport te zijn, Ki-67-negatief, en met chromosomen gekenmerkt door lange telomeren ^5. Zij spraken pluripotency-geassocieerde transcriptiefactoren Oct-4 en Nanog plaats van MSC meester toezichthouders Runx2 en SOX9 ^7. Fenotypisch, mediterrane partnerlanden uitgedrukt endoglin (CD105) op een lager niveau dan MSC's, terwijl ontbreekt mesenchymale markers CD73, CD90, CD166. MPL toonde ook een kenmerkend patroon van adhesiemoleculen gekenmerkt door consistente expressie van PECAM (CD31), integrines aL (CD 11), αM (CD11b), ax (CD 11 c) en integrine β2 (CD18) die specifiek ondersteunt de voetjes structuren ⁸ . In standaard MSC expansie media, MTR prompt gedifferentieerd in MSC's via een tussenstap met de activering van Wnt5 / Calmodulin cell signaling ^9. Mediterrane partnerlanden ook behouden angiogene eigenschappen, zoals aangetoond door hun vermogen om te ontkiemen van sferoïden in muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten 3D culturen. De angiogene potentiële werd snel verloren na MPC differentiatie langs de mesengenic lineage.

Hier presenteren we proprotocollen geoptimaliseerd om te isoleren en zeer gezuiverd mediterrane partnerlanden van HBM bloedmonsters te karakteriseren. Reproduceerbare protocollen voor MPC mesengenic en angiogene differentiatie beschreven.

Protocol

NB: Na schriftelijke toestemming, werden HBM monsters verkregen tijdens orthopedische chirurgie voor heupprothese. Direct na femorale hals osteotomie en voor femorale ruimen een 20 ml spuit met 500 UI heparine, werd gebruikt om vers BM zuigen. Het protocol is breed toepasbaar op elke BM bron worden beschouwd.

1. Isolatie van Human Bone Marrow mononucleaire cellen (HBM-multinationals)

1. Verdun 5-10 ml vers BM 50 ml, toepassing Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en meng door omkeren. Verdeel eveneens 25 ml in twee nieuwe 50 ml conische buizen, voeg 25 ml D-PBS aan elke buis en meng door omkeren.
2. Laat de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan, voor het scheiden van minerale botfragmenten en vet uit oplossing.
3. Verwijder voorzichtig drijvende vet met een steriele Pasteur pipet en filter celsuspensie door middel van 70 micrometer filters zonder verstoring van de mineraal bot fragment pellet.
4. Stel vier 50 ml buizen met 15 ml medium voor discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie (1,077 g / ml). Zorg ervoor dat dit medium bij kamertemperatuur.
5. Leg zacht 20-25 ml verdund BM op de top van dichtheidsgradiënt medium. Voer deze operatie zorgvuldig, zodat celsuspensie trickle op de buis muren om het mengen van lagen te voorkomen.
6. Voeren dichtheidsgradiënt centrifugatie bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur met rem uitgeschakeld.
7. Verzamel de witachtige ring van cellen die zich tussen de twee fasen met een steriel pasteurpipet en overgebracht naar een verse 50 ml buis.
8. Was de cellen met vers kweekmedium: fenolrood-vrij, laag glucose (1000 mg / l) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) samengevoegd humaan type AB serum (PhABS), 2 mM L-glutamine en antibiotica (DMEM / 10% PhABS). Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
9. Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 5-10 ml vers DMEM / 10% PhABS.
10. Ga verder met celgetal.Bepaal het aantal witte bloedcellen door 1: 1 verdunning in trypan. Breng dit aan de hemocytometer en observeren onder een fasecontrastmicroscoop. Uitsluiten klein en perfect afgeronde erytrocyten en blauw-gekleurde dode cellen van het aantal cellen.
    LET OP: Het wordt sterk aanbevolen om het scherm PhABS partijen voor hun prestaties in MPC herstel. PhABS uit de VS bronnen hebben het beste resultaat gegeven, terwijl de meeste sera van verschillende afkomst resulteerde in MPC kweken met hogere percentages van MSC-achtige cellen.

2. Isolatie van mediterrane partnerlanden van HBM-multinationals

1. Set hydrofobe T-75 kolven met 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en laat pH en temperatuur evenwicht door pre-incubatie bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende 30 minuten.
2. Seed 4-6 x 10 ⁷ HBM-MDL per kolf en incubeer bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende 48 uur.
3. Zuig en gooi middelgrote en niet-hechtende cellen uit flessen. Voeg 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en incubeer bij 37 ° Cin _5% CO2. Handhaaf culturen 6-8 dagen, veranderen medium elke 48 uur.
   Optioneel: MPC opbrengst te verhogen, niet-hechtende cellen van 2,3 opnieuw kunnen worden uitgeplaat in een nieuwe kolf en gehandhaafd zoals beschreven voor de primaire kweken.
4. Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse DMEM en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 - 15 min (vermijd verlengde incubatie).
5. Voeg 10 ml vers DMEM / 10% PhABS, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten
6. Zuig en gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers DMEM / 10% PhABS. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10.
   LET OP: Gebruik geen trypsine / EDTA als los reagens. MTR zijn trypsine resistent. Morfologische screening van de culturen vóór verzamelen van cellen, wordt sterk aanbevolen om de aanwezigheid van spoelvormige MSC-achtige cellen te evalueren. Bij aanzienlijke hoeveelheid MSC-achtige cellen detected, verhoging van de zuiverheid van het celproduct door het selectief verwijderen van de besmette cellen. Hiervoor trypsine digestie kan worden uitgevoerd voordat MPC oogsten uitgevoerd door toevoeging van 2 ml trypsine / EDTA 0,05% gedurende 2 minuten. Was de cultures tweemaal met 5 ml DMEM / 10% PhABS, ga dan verder met de behandeling zoals hierboven protease.

3. Cell karakterisering

1. flowcytometrie
   1. Opgericht duplo monsters van 10 ⁵ vers losgemaakte cellen in wasoplossing: D-PBS aangevuld met 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,02% (w / v) natriumazide. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
      LET OP: Natriumazide is giftig.
   2. Resuspendeer pellets in 200 pl wasoplossing en voeg anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 en anti-CD31-antilichamen geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen ( "test"); parallel opgezet isotype controles ( "CTRL").
      LET OP: Bedragen van kleuring antilichamen moet worden bepaald door titratie of According instructies van de fabrikant.
   3. Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
   4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. Re-schorten cellen in 500 pi wasoplossing en het verwerven van ten minste 5 x 10 ⁴ evenementen op multicolor flowcytometer ^{7 9 10.}
   5. Analyseer resultaten op dot-plots en gebruik "CTRL" opgenomen gebeurtenissen te kwadranten te stellen.
      Opmerking: Om de cultuur als MPC cultuur definieert het percentage van CD73 ^{neg neg} CD90 CD45 ⁺ CD31 ⁺ cellen moet meer dan 95%. Voor sommige specifieke toepassingen, dat wil zeggen analyse van genexpressie, het herstel cut-off moet worden verhoogd tot 97-98%.
2. Nestin detectie en F-actine organisatie analyse
   1. Plaat vers geïsoleerde MTR over cultuur kamer dia's (20.000 / ^cm2). Sta cellen hechten door overnacht incubatie bij 37 ° C in _5% CO2.
   2. Was de cellen in wasoplossing en fix in 4% (w / v) paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Voor het verwijderen van fixerende toevoegen wasoplossing, incubeer gedurende 2 minuten en giet.
   3. Herhaal het wassen tweemaal.
   4. Doorlaatbaar cellen in D-PBS aangevuld met 0,05% (v / v) Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Stop reactie door eiwitvrije signaal versterker (30 min bij kamertemperatuur) of standaard blokkerende oplossing (D-PBS gesupplementeerd met 3% (w / v) BSA).
   6. Verwijder signaal versterker / blokkeren oplossing.
   7. Voeg 7 ug / ml (w / v) anti-humaan nestine primair antilichaam en incuberen bij 4 ° C geïncubeerd in een bevochtigde kamer. Daarnaast gebruiken isotype controle antilichamen niet specifiek fluorescentiesignalen evalueren.
   8. Was de dia's door het toevoegen van D-PBS, laat gedurende 2 minuten en giet. Herhaal dit twee keer.
   9. Voeg 2 ug / ml (w / v) van fluorescente kleurstof geconjugeerd secundair antilichaam en incuberen bij 4 ° C gedurende 1 uur in het donker.
   10. Was de dia's zoals hierboven.
   11. Voeg fluorescerende Phalloidin (5 UI / ml), vertrekken bij KT 30 min in het donker en was 3 maal in D-PBS.
   12. Verwijder de kamerwanden en dia monteren montage waterig medium aangevuld met antifade reagens en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) voor detectie kernen. Ga verder met het afbeelden van ^{7 9 10.}

4. Mesengenic Differentiatie van MTR

1. Plaat 2 x 10 ⁴ / cm ² vers geïsoleerde MPL in TC behandelde T75 kweekflessen en laat cellen zich overnacht in DMEM / 10% PhABS bij 37 ° C in _5% CO2.
2. Vervang DMEM / 10% PhABS met standaard gereduceerd serum medium, ongeveer 200 pl / ^cm2, ontworpen voor mesenchymale stromale cellen expansie (MSC-RS gemiddeld). Cellen groeien tot confluentie (P1-MSC's), kenmerkend van 7 tot 10 dagen na de inductie. Vernieuwen medium om de 2 dagen.
3. Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse MSC-RS medium en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 3776; C gedurende 5 - 15 min (vermijd langdurige incubatie).
4. Voeg 10 ml van verse MSC-RS medium, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten
5. Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers MSC-RS medium. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10
6. Ga verder met subcultuur hen door zaaien 3-5 x 10 ³ cellen / ^cm2. Cellen groeien tot confluentie (P2-MSC's).
7. Oogst cellen door protease spijsvertering zoals beschreven van stap 4,3 naar stap 4.5 en ga verder met de karakterisering zoals beschreven in paragraaf 3.
   LET OP: Een percentage van CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 ^neg CD31 ^neg cellen lager is dan 95% zou slechts een gedeeltelijke differentiatie aan te geven en om een aanvullend cultuur passage.
8. Plaat P2-MSC's bij 2 x 10 ⁴ / cm ² in zes goed TC-behandelde platen en te groeien tot confluentie in MSC-RS medium.
9. Mark twee putten als "No Diff" en vernieuwen MSC-RS medium.
10. Mark twee goeds als "Osteo" en medium te vervangen door 200 ul / ^cm2 standaard osteogene medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie.
11. Mark twee putten als "Adipo" en medium te vervangen door 200 ul / ^cm2 standaard adipogenic medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie.
12. Handhaaf kweken bij 37 ° C in 5% CO ₂ door het veranderen van het gehele medium elke 48 uur.
    LET OP: Het wordt sterk aangeraden om standaard in de handel verkrijgbare differentiëren media te gebruiken voor de test reproduceerbaarheid. Na 2/3 weken onder differentiërende omstandigheden, kalkafzettingen verschijnen in osteogene geïnduceerde kweken, terwijl intracellulaire vetdruppels accumulatie is duidelijk in adipogenic geïnduceerde cellen.
13. Aspireren en gooi kweekmedium daarna wassen met D-PBS.
14. Bevestig de kweken door toevoegen van 1 ml 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
15. Voor het verwijderen van fixatief toevoegen D-PBS, incubeer gedurende 2 minuten en giet. Herhaal het wassentwee keer.
16. Vlekken op een "No Diff" samen met de twee "Osteo" gemarkeerd putten in hydroxyapatiet specifieke tl-oplossing en een "No Diff" samen met de twee "Adipo" putten in 200 nm Nile Rode oplossing gemarkeerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur ^11,12.
17. Verwijder vlekken oplossingen en wassen in D-PBS twee keer.
18. Verwijder D-PBS, voeg D-PBS gesupplementeerd met 50% (v / v) glycerol en ga naar grafische ^{7 9 10.}

5. MPC Sferoïde Sprouting Assay

1. 3D sferoïden produceren lag 20 ul druppels vers geïsoleerde MPC suspensie (1,5 x 10 ⁴ cellen / drop) op het binnenoppervlak van een petrischaal deksel.
   LET OP: Als handling druppels zou kunnen leiden tot hun breuk, is het zeer aan te bevelen om ze lag in overmaat.
2. Gebruik het deksel voorzichtig naar een petrischaal met D-PBS om te voorkomen dat hangende druppels verdampen recapituleren. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO ₂'s nachts om cellen te aggregeren in 3D bolletjes.
3. Stel een dikke gel van muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten door toevoeging van 300 ul aliquots van standaard ECM eiwitten in een voorgekoelde 24 putjes kweekplaat, en incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
4. tip voorzichtig over de petrischaal deksel en voorzichtig pak de bolletjes met behulp van een steriele Pasteur pipet.
5. Leg sferoïden op de ECM eiwitgel, voeg 700 ul aliquots van standaard VEGF-rijke endotheliale celgroei medium en incubeer bij 37 ° C in _5% CO2.
6. Na 24 uur en 7 dagen cultuur, nemen foto's van de 3D kweken bij 4X vergrotingsfactor. Evalueer ontspruit uit bolletjes toepassing van beeldanalyse software door het meten van de radiale afstand tussen de laatste invasie cel en de bolvormige rand. Herhaal maatregelen langs ten minste 20 verschillende richtingen. De gemiddelde afstand wordt beschouwd als positief als 50 urn of meer.

Resultaten

De hier beschreven selectieve kweekomstandigheden hebben de isolatie van een nieuw hechtende en bijna monomorphic celpopulatie toegelaten 1,0% van de HBM-multinationals (0,5-2,0 x 10 ⁶ HBM-multinationals 5-10 ml vers BM monsters) ^5,6 . We identificeerden deze grote (40 - 60 micrometer in diameter), afgerond, rustige, Ki-67-negatieve cellen als MTR ^5. Morfologisch, worden ze gekenmerkt door een opvallende gebakken ei-vorm met een dikke kerngebied omgeven door een vlakke dunne periferie blijkt veel filopodia bij een hogere vergrotingsfactor (witte pijlen in figuur 1 A.1). Polaire verlenging van de buitenste celbegrenzing wordt vaak waargenomen (zwarte pijlen in figuur 1 A.1). Dergelijke morfologie duidelijk verschilt van de typische spoelvormige mesenchymale stromale cel verschijning gerapporteerd in standaard MSC-culturen. Flowcytometrie toonde meer dan 95% van de vers geïsoleerde mediterrane partnerlanden aan CD31 en CD45, terwijl m uitdrukkenesenchymal geassocieerde merkers CD90 en CD73 ¹³ niet detecteerbaar (Figuur 1 A.2). Wij beschouwen deze beperkte set van vier antigenen als indicatief voor MTR. Verdere onderscheidende kenmerken van MPL zijn bezaaid F-actine distributie onthullen een aantal van de voetjes structuren (rood in figuur 1 A.3) en intense expressie van nestin (groen in figuur 1 A.3), die niet gedetecteerd in de cellen gekleurd met isotype controle antilichaam (gegevens niet getoond).

Het kweken van MTR in standaard RS medium ontworpen voor MSC expansie resulteert in een snelle differentiatie in exponentieel groeiende MSC-achtige cellen (Figuur 1 B.1). Na twee passages cellen uiteindelijk schakelen hun fenotype van CD73 ^neg CD90 ^neg CD45 ⁺ CD31 ⁺ aan CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 ^neg CD31 ^neg (figuur 1 B.2). In het proces, MTR re-organize F-actine in stress-vezels terwijl nestin expressie beperkt wordt tot enkele zeldzame cellen (figuur 1 B.3). MPC mesengenic differentiatie tot een bepaalde MSC-fenotype ontstaat door twee afzonderlijke stappen blijkt uit andere cel morfologie. Na een week in MSC RS medium een resterende populatie van MPC-achtige cellen is nog steeds waarneembaar binnen een confluente laag van platte, veelhoekige multi-vertakte cellen (P1-MSC's in figuur 2 A). Een verdere doorgang moet bijna monomorfisch cultuur van spoelvormige MSC-achtige cellen te verkrijgen (P2-MSC in figuur 2 A). Deze exponentieel groeiende cellen kan gemakkelijk differentiëren tot osteoblasten of adipocyten wanneer overgebracht in selectief medium gedurende ten minste 2 weken, waardoor hun MSC aard bevestigd. In osteogene geïnduceerde kweken, kan kalkaanslag worden gedetecteerd door ofwel colorimetrisch alizarine-S vlek of specifieke fluorescente kleurstoffen (groen in figuur 2 B). Na adipogenic inductie cellentonen lipide droplet accumulatie blijkt uit ofwel colorimetrisch of fluorescent Oil Red Nile Red kleuring (rood in figuur 2 B).

MPC typering werd bevestigd door kiemen angiogenese assay. Mediterrane partnerlanden toonden hun vermogen om binnenvallen (meer dan 50 micrometer) muizen ECM eiwit gel van 3D bolletjes na 24 hr VEGF-stimulus (figuur 2 C). Na één week binnendringende cellen werden gedetecteerd bij 300-600 urn afstand. Omgekeerd werd invasie capaciteit verloren in P2-MSC's na mesengenic differentiatie (figuur 2 D).

Aanleiding tot een populatie van rustende MTR (A) gemakkelijk te onderscheiden van MSC's (B) Figuur 1. vers geïsoleerde MTR hebben onderscheidende kenmerken. Het kweken HBM-multinationals in DMEM / 10% PhABS zeven dagen geeft op het vlak van de morfologie (A.1, B.1, schaal bars = 100 pm), fenotype (A.2, B.2), F-actine distributie (rood in A.3, B.3), en nestin expressie (groen in A.3, B.3, schaal bars = 20 pm). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. mediterrane partnerlanden differentiëren naar Standard MSC's en Show Kiemen Angiogenese in vitro. Vervanging van DMEM / PhABS met commercieel verkrijgbare RS medium ontworpen voor MSC expansie triggers mesengenic inductie van de mediterrane partnerlanden. Na een week in de cultuur paar resterende MTR nog aantoonbaar (P1-MSC's), terwijl een verdere passage in MSC-RS medium leidt tot een populatie van confluente MSC-achtige cellen (P2-MSC, A schaal bars = 100 pm). P2-MSC's terminaal differentiëren in osteocytes of adipocyten onder de juiste stimuli zoals blijkt uit calcium afzetting (groen in B) en lipide-druppel accumulatie (rood in B, schaal bars = 200 pm), respectievelijk. Mediterrane partnerlanden tonen consistente ontspruit uit sferoïden in muizen ECM eiwit gel (C) bij een verschil met P2-MSC's (D, schaal bars = 1,0 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In de afgelopen decennia zijn MSC's uitgebreid onderzocht en pre-klinisch geëvalueerd voor mogelijke toepassing bij de behandeling van verschillende bot-/articulaire, immunologische, neurologische, cardiovasculaire, gastro-intestinale en hematologische aandoeningen^14,15. Het gemakkelijke en goedkope isoleren van multipotente MSC's, uit vele verschillende weefsels, samen met hun gebrek aan significante immunogeniciteit¹⁶, draagt ertoe bij dat deze cellen een van de meest interessante celpopulaties zijn om te worden toegepast in celgebaseerde therapieën. Niettemin vertegenwoordigt de zeer lage frequentie in het oorspronkelijke weefsel een grote beperking voor de toepassing van MSC's in de kliniek, waardoor de expansie van deze cellen wordt gedwongen, in vitro, vóór de infusie of transplantatie.

Uitgebreide MSC-culturen hebben een hoge mate van heterogeniteit en variabiliteit^17-19 aangetoond, waardoor het moeilijk is om een consensus te bereiken over protocollen voor MSC-productie en -karakterisering. Bovendien suggereerden recente onderzoeken de aanwezigheid van meerdere in vivo MSC-voorouders in een breed scala aan weefsels, die bijdragen aan cultuurheterogeniteit^10,20. In feite is voorgesteld dat specifieke kweekcondities mogelijk specifieke subpopulaties van MSC-voorlopers selecteren of eenvoudigweg bevorderen die aanwezig zijn in verschillende percentages in "ruwe" en onbewerkte monsters zoals beenmerg (hBM-MNCs) of vetweefsel (stromale vasculaire fractie)². Dus, de variabiliteit in MSC-initiërende celpopulaties samen met het grote aantal verschillende verrijking/isolatie en kweekprotocollen die worden toegepast, vormen een groot obstakel voor de definitie van haalbare MSC-gebaseerde therapieën.

Een cruciale factor die de heterogeniteit van MSC-culturen beïnvloedt, is serumsuppletie²¹. In onze handen leidde de vervanging van FBS door PhABS in primaire culturen van hBM-MNCs, gecombineerd met hoog dichtheidszaaien op hydrofobe kunststoffen, tot de isolatie van een nieuwe zeer hechtende celpopulatie met verschillende biologische kenmerken genaamd MPCs^5,6. We observeerden dat de toevoeging van kleine percentages van PhABS aan primaire culturen van FBS ook MPC-isolatie toestond, wat duidt op de aanwezigheid van MPC-inducerende agentia in het menselijk serum⁶. Op dit moment is het MPC-isolatie/karakteriseringsprotocol een unieke methode die beschikbaar is om bijna pure MPC's te verkrijgen. Het protocol is zorgvuldig aangepast en is zeer reproduceerbaar voor kwaliteitsscreening van MPC-preparaten vóór verdere toepassingen.

MPC's kunnen worden gebruikt als bron voor MSC-productie, waardoor de variabiliteit die wordt geïntroduceerd door het gebruik van niet-gefractioneerd uitgangsmateriaal wordt beperkt. De precieze definitie van de meerdere stappen die de mesengenetische differentiatie van MPC rapporteren⁹ zou gesynchroniseerde mesenchymale celexpansie mogelijk maken. Niettemin kan deze laatste voorwaarde uitsluitend worden gerealiseerd door toepassing van een hoog gezuiverde MPC-populatie, als gevolg hiervan zijn de karakterisering van de celproducten die worden verkregen door het hier beschreven protocol, van cruciaal belang. Deze isolatiemethode heeft aangetoond dat MPC-herstel met een zuiverheid van over het algemeen ongeveer 95% mogelijk is. Echter, donor/patiëntvariabiliteit samen met de variabiliteit gerelateerd aan de verschillende batches van menselijk gepoold serum die worden toegepast, kan leiden tot een significant percentage van MSC-achtige cellen dat samen met MPC's wordt meegeïsoleerd, onder selectieve omstandigheden.

Het is niet duidelijk of deze "contaminante" MSC-achtige cellen kunnen voortkomen uit de andere verschillende in vivo voorlopers die in beenmerg zijn beschreven²² of uit ongecontroleerde en spontane MPC-differentiatie. In elk geval vernietigt een consistent percentage van MSC-achtige cellen in de MPC-producten de mogelijkheid om deze cellen toe te passen als homogene uitgangsstof voor de MSC-expansie. Dus hier is een eenvoudige en goedkope methode voorgesteld, gebaseerd op de MPC-resistentie tegen trypsine-digestie, waardoor de zuiverheid van de MPC-producten wordt verhoogd. Soortgelijke of zelfs betere resultaten bij het zuiveren van MPC-culturen kunnen worden bereikt door middel van fluorescente of magnetische celsortering door CD73 en/of CD90-depletion, maar waardoor het procestijd aanzienlijk wordt verlengd en de kosten toenemen.

Bovendien vertoonden MPC's expressie van pluripotentie-geassocieerde markeren en Nestin, die allemaal snel verloren gaan tijdens mesengenetische differentiatie⁷. Sprouting-assay onthulde MPC-capaciteit om muis ECM-eiwitgel te invaderen. Alles bij elkaar genomen geven deze resultaten aan dat MPC's moeten worden beschouwd als een meer onvolwassen voorloper, die angiogeen potentieel behoudt. Niettemin neemt de initiële enthousiasme over het mesodermale differentiatiepotentieel van MPC's daadwerkelijk af. In feite, na meer dan 7 jaar onderzoek naar MPC's, zijn mesengenetisch en angiogeen potentieel uitgebreid beschreven^5-9, maar differentiatie naar andere cellen van mesodermale oorsprong ontbreekt nog steeds. Dus, hier stellen we een nieuwe, en meer rigoureuze, definitie van deze cellen voor als "Mesangiogene Voorloper Cellen", met behoud van de afkorting MPC's.

We geloven ook dat de meeste controverses over het angiogeen potentieel van MSC's kunnen worden gerelateerd aan de heterogene samenstelling van uitgebreide culturen die bestaan uit subpopulaties van MPC's en MSC's in variabele percentages²³.

Ten slotte kunnen MPC's ook een cruciale rol spelen voor de implementatie van CBMP's die toepasbaar zijn voor weefselreconstructie, aangezien deze cellen ook de neo-vasculatisatie kunnen ondersteunen. In feite, toekomstig onderzoek naar regeneratie zou in aanmerking moeten nemen dat de groei van nieuw gevormd weefsel moet

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Murine ECM proteins Stock Concentratie: 100% (9 - 12 mg/ml) Eindconcentratie: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 μm Filters	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Sweden)	17-5442-03	medium voor discontinu densiteitsgradientcentrifugering
Pooled human AB type serum (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Eindconcentratie: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	Gestabiliseerde L-Glutamine Stock Concentratie: 100x Eindconcentratie: 2 mM
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Stock Concentratie: 7,5% Eindconcentratie: 0,5%
Sodium Azide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Eindconcentratie: 0,02%
Penicillin/Streptomycin (Pen Strep)	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063	Antibiotica Stock Concentratie: 5.000 UI/ml penicilline, 5.000 μg/ml Streptomycine Eindconcentratie: 50 UI/ml penicilline, 50 μg/ml Streptomycine
T-75 kweekkolf voor suspensiekweek	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658 190
T-75 kweekkolf TC behandeld	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Germany)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12563-011	Diervrije proteases losmaakmiddel Stock Concentratie: 1x Eindconcentratie: 1x
Trypsin/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	15400-054	Fenol rood vrij Stock Concentratie: 0,5% Eindconcentratie: 0,25%
anti-CD90 APC antilichaam  (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-402	Eindconcentratie: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antilichaam (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-609	Eindconcentratie: 1:40
anti-CD73 PE antilichaam (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-095-182	Eindconcentratie: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antilichaam (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-105-260	Eindconcentratie: 1:40
Mouse IgG1 APC antilichaam	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-846	Eindconcentratie: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antilichaam	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-096-637	Eindconcentratie: 1:40
Mouse IgG1 PE antilichaam	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-845	Eindconcentratie: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 antilichaam	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-098-563	Eindconcentratie: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Fenol rood vrij minimaal essentieel medium Stock Concentratie: 1.000 mg/L glucose
Fetal Bovine Serum  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Stock Concentratie:0,2 mg/ml Eindconcentratie: 2 μg/ml
Prolong Gold antifade reagens met 4’,6-diamidino-2-fenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	P-36931	Waterige montagemedium + DAPI Eindconcentratie: 1x
Paraformaldehyde	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Fixeermiddel Eindconcentratie: 4%
LAB-TEK tweekamerkamer slides	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Anti-Nestin antilichaam [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, UK)	ab2035	Stock Concentratie: 1 mg/ml Eindconcentratie: 7 μg/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Stock Concentratie: 200 UI/ml Eindconcentratie: 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milan, Italy)	EMR237500	Eindconcentratie: 0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS medium)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 anti-muis SFX kit	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Geit anti-muis secundair antilichaam + Signaalversterker Stock Concentratie: 2 mg/ml Eindconcentratie: 2 μg/ml
Pasteur Pipette	Kartell Labware  (Noviglio (MI), ITALY )	329
StemMACS AdipoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)	130-091-67