Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Samenvatting

Adaptieve evolutie en isolatietechnieken worden beschreven en aangetoond dat derivaten van Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 die in staat zijn om snel te consumeren hexose en pentose gemengde suikers in enzym versuikerd undetoxified hydrolysaten en te accumuleren meer dan 40 g / l ethanol opleveren.

Samenvatting

Lignocellulose biomassa is een overvloedig, hernieuwbaar grondstof dat nuttig is voor de productie van brandstofkwaliteit ethanol en andere bioproducten. Voorbehandeling en enzym-saccharificatieprocessen zetten suikers vrij die kunnen worden gefermenteerd door gist. Traditionele industriële gisten fermenteren geen xylose (dat tot 40% van de plantsuikers uitmaakt) en kunnen niet functioneren in geconcentreerde hydrolysaten. Geconcentreerde hydrolysaten zijn nodig om een economische ethanolterugwinning te ondersteunen, maar ze zijn beladen met toxische bijproducten die tijdens de voorbehandeling worden gegenereerd. Terwijl ontgiftingsmethoden hydrolysaten fermenteerbaar kunnen maken, zijn ze kostbaar en genereren ze afvalverwijderingsverplichtingen. Hier worden adaptieve evolutie en isolatietechnieken beschreven en gedemonstreerd om derivaten van de inheemse Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 op te leveren die in staat zijn om hydrolysaten efficiënt om te zetten in economisch herwinnenbaar ethanol ondanks ongunstige kweekcondities. Verbeterde individuen worden verrijkt in een evoluerende populatie met behulp van meerdere selectiedrukken die afhankelijk zijn van de natuurlijke genetische diversiteit van de S. stipitis populatie en mutaties geïnduceerd door blootstelling aan twee verschillende hydrolysaten, ethanol of UV-straling. De uiteindelijke evolutieculturen worden verdund geplaat om de overheersende isolaten te verzamelen, terwijl tussenliggende populaties, bevroren in glycerol in verschillende stadia van evolutie, worden verrijkt op selectieve media met behulp van geschikte stressgradienten om de meest veelbelovende isolaten te herstellen door middel van verdunningsplateren. Isolaten worden getest op verschillende hydrolysaattypen en gerangschikt met behulp van een nieuwe procedure met behulp van dimensieloze relatieve prestatie-index (RPI) transformaties van de xylose-opnamesnelheid en ethanolopbrengstgegevens. Met behulp van de RPI statistische parameter wordt een algemeen relatief prestatiegemiddelde berekend om isolaten te rangschikken op basis van meerdere factoren, waaronder kweekcondities (variërend in voedingsstoffen en remmers) en kinetiek karakteristieken. Door toepassing van deze technieken hadden derivaten van de ouderstam de volgende verbeterde kenmerken in enzym-gesaccharificeerde hydrolysaten bij pH 5-6: verminderde initiële latentiefase voorafgaand aan groei, verminderde diauxische latentie tijdens glucose-xylose overgang, aanzienlijk verbeterde fermentatiesnelheden, verbeterde ethanoltolerantie en accumulatie tot 40 g/L.

Inleiding

Naar schatting jaarlijks 1,3 miljard droge ton lignocellulose kunnen ondersteunen de productie van ethanol en laat de VS om zijn verbruik van aardolie te verminderen met 30%. ¹ Hoewel plantaardige biomassa hydrolyse opbrengst suiker mengsels rijk aan glucose en xylose, fermentatie-remmers worden gegenereerd door de chemische voorbehandeling nodig af te breken hemicellulose en bloot cellulose voor enzymatische aanval. Azijnzuur, furfural en hydroxymethylfurfural (HMF) wordt gedacht dat de belangrijkste onderdelen van de vele remmers die zich vormen tijdens de voorbehandeling zijn. Om de lignocellulosische ethylalcoholindustrie vooruit, onderzoek en procedures voor de ontwikkeling van giststammen staat te overleven en goed functionerende zowel hexose en pentose suikers in aanwezigheid van dergelijke remmende verbindingen nodig mogelijk. Een aanzienlijke extra zwakke traditionele industriële giststammen zoals Saccharomyces cerevisiae, is het onvermogen om efficiënt ferment de xylose in hydrolysaten van plantaardige biomassa.

Pichia stipitis type stam NRRL Y-7124 (CBS 5773), onlangs omgedoopt tot Scheffersomyces stipitis, is een inwoner pentose gistende gist die bekend is om xylose fermenteren tot ethanol. ^2,3 De evolutie van de stam NRRL Y-7124 werd hier voortgezet omdat het is gedocumenteerd hebben het grootste potentieel van de inheemse giststammen economisch realiseerbare ethanol accumuleren van meer dan 40 g / l met weinig xylitol bijproduct. ^4,5,6 bij optimale media, S. stipitis NRRL Y-7124 produceert 70 g / l ethanol in 40 uur (1,75 g / l / uur) Opbrengst 0,41 ± 0,06 g / g in hoge celdichtheid cultures (6 g / L-cellen). ^7,8 Resistance gisting remmers ethanol, furfural, HMF en is ook gemeld, ⁹ en S. stipitis is gerangschikt onder de meest veelbelovende inheemse pentose-fermenteren gisten beschikbaar voor commerciële schaal ethanol production uit lignocellulose. ¹⁰ Ons doel was om diverse undetoxified lignocellulose hydrolysaten en ethanol selectie druk van toepassing zijn op de evolutie te dwingen in de richting van een meer robuuste derivaat van stam NRRL Y-7124 geschikt voor industriële toepassingen. Key onder zocht verbeterde functies waren sneller suiker opnamesnelheden in geconcentreerde hydrolysaten, verminderd diauxy efficiënter gemengd gebruik suiker, en hogere toleranties van ethanol en remmers. De toepassing van S. stipitis om undetoxified hydrolysaten was een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek naar de toegevoegde operationele kosten in verband met hydrolysaat detoxificatie processen, zoals overliming elimineren.

Twee industrieel veelbelovende hydrolysaten werden toegepast op de evolutie van kracht:. Enzym versuikerde ammoniak fiber-uitbreiding voorbehandelde maïsstro hydrolysaat (AFEX CSH) en verdunde zuur voorbehandeld switchgrass hydrolysaat drank (PSGHL) ^11,12 AFEX voorbehandeling technologie wordt ontwikkeld omhet minimaliseren van de productie van fermentatie-remmers, terwijl verdund zuur voorbehandeling vertegenwoordigt de huidige laagste kosten-technologie het meest beoefend om cellulosehoudende biomassa bloot voor enzymatische versuikering. PSGHL kan worden gescheiden van de na voorbehandeling cellulose en is karakteristiek rijk aan xylose uit de gehydrolyseerde hemicellulose, maar weinig glucose. AFEX CSH en PSGHL composities van elkaar verschillen op essentiële aspecten die werden benut om de evolutie te beheren. AFEX CSH is lager in furan aldehyden en azijnzuur inhibitoren maar hoger in aminozuren en ammoniak stikstofbronnen opzichte PSGHL (tabel 1). PSGHL presenteert de extra uitdaging van xylose zijn de belangrijkste suiker beschikbaar. Aldus is PSGHL geschikt specifiek verrijken verbeterde xylose gebruik bij hydrolysaten, zwakte voorkomen commercieel gebruik van beschikbare gist. Zelfs onder autochtone pentose gisting gisten, de afhankelijkheid van de suboptimale xylo suikerse celgroei ondersteunen en reparatie wordt nog grotere uitdaging in hydrolysaten vanwege verschillende redenen. voedingsdeficiënties, remmers die grote schade aan structurele integriteit en verstoring metabolisme cel door redox onbalans ⁹ Stikstof suppletie, vooral in de vorm van aminozuren, kan een aanzienlijke bedrijfskosten voor fermentaties vertegenwoordigen. De impact van stikstof suppletie op isolate screening en ranking werd onderzocht met switchgrass hydrolysaten.

Verbeterde individuen werden verrijkt in een zich ontwikkelende bevolking met behulp van meerdere selectie druk afhankelijk van natuurlijke genetische diversiteit van de S. stipitis bevolking en mutaties geïnduceerd door blootstelling aan twee verschillende hydrolysaten, ethanol of UV-straling. Selectiedruk werden parallel en in serie toegepast om de evolutie voortgang van S. staand stipitis in de richting van de gewenste derivaten kunnen groeien en efficiënt te gisten in hydrolysaten(Figuur 1). Het repetitieve kweken van functionele bevolking in toenemende mate uitdagende hydrolysaten werd bereikt in microplaten gebruik van een verdunningsreeks van een van beide 12% glucan AFEX CSH of anders PGSHL bereid bij 20% vaste stof belading. De toepassing van ethanol uitgedaagd groei op xylose in continue kweek verder verbeterd AFEX CSH deze populaties door verrijkend fenotypen tonen minder gevoeligheid voor onderdrukking van xylose gebruik ethanol. Deze laatste functie werd onlangs problematisch pentose gebruik getoond door stam NRRL Y-7124 na glucose fermentatie. ⁸ Verrijking op PSGHL werd vervolgens onderzocht om hydrolysaat functionaliteit uit te breiden.

Vermeende verbeterde derivaten van S. stipitis NRRL Y-7124 werd geïsoleerd uit elke fase van het evolutieproces via gerichte verrijking onder stressomstandigheden en verdunningsuitplatingstechniek kolonies kiezen de meest voorkomende populaties. dimensieloze relatievekengetallen (RPIs) werden gebruikt om stammen te scoren op basis van prestaties, waarbij kinetisch gedrag werd beoordeeld op verschillende hydrolysaat en voedingssupplementen toegepast. Hoewel het succes van verschillende procedures aangepast om de functionaliteit van S. verbeteren stipitis in lignocellulose hydrolysaten zijn eerder beschreven, stammen waaruit economische ethanolproductie op undetoxified hydrolysaten niet eerder gerapporteerd. ^13-17 De evolutie procedures gevisualiseerd in meer detail hier Slininger et al. ¹⁸ ontwikkelde stammen die significant verbeterd de stam NRRL Y-7124 en kunnen produceren> 40 g / l ethanol in AFEX CSH en enzym versuikerde hydrolysaat vingergras (SGH) aangevuld met geschikte stikstofbronnen. Deze nieuwe stammen zijn van toekomstige belang zijn voor de ontwikkeling van lignocellulose ethanol industrie en onderwerpen van extra genomics studies gebouwop die van eerder gesequenced stam NRRL Y-11545. ¹⁹ A genomics onderzoek van top stammen geproduceerd tijdens de verschillende fasen van de evolutie diagramed in figuur 1 zou de geschiedenis van de genetische veranderingen die zich hebben voorgedaan tijdens de ontwikkeling als een prelude op stam verbetering onderzoek verder te ontrafelen.

Protocol

1. Bereid Uitgangsmaterialen en Apparatuur voor Testen

1. Bereid hydrolysaten gebruikt 18-20% aanvankelijke biomassa drooggewicht in de voorbehandelingsvloeistof reactie voor gebruik in de evolutie, isolatie en ranking procedures. Zie Slininger et al. 2015 ¹⁸ voor de gedetailleerde methoden om AFEX CSH, PSGHL en SGH bereiden met stikstof aanvullingen N1 of N2 gebruikt in de evolutie, isolatie of ranking. Zie tabel 1 voor samenstelling van elke hydrolysaat type.
   LET OP: SGH-N1 = SGH versterkt om 42:: 1 mol koolstof stikstof-verhouding (C: N) met stikstof bronnen, waaronder ureum, vitamine-free amino stikstof vestingwerken van SGH werden als volgt aangeduid als SGH-N1 of SGH-N2 gedefinieerd zuren uit caseïne, D, L-tryptofaan, L-cysteïne en vitaminen uit bepaalde bronnen (zodat ~ 15% molaire stikstof N primair amino stikstof (PAN) en ~ 85% N is uit ureum); SGH-N2 = SGH versterkt om 37: 1 C: N met ureum en sojameel als de laagste kosten commerciële bron of aminozuren en vitaminen, die ~ 12% stikstof van PAN en 88% ureum.
2. Schaf een gevriesdroogde cultuur van de stam, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) uit de ARS Culture Collection (National Center for Agricultural Research Utilization, Peoria, Illinois), en voor te bereiden glycerol voorraad culturen zoals aangegeven. Handhaaf stock kweken van de ouder gist en zijn derivaten in 10% glycerol bij -80 ° C.
   1. Streak glycerol voorraden mout gist pepton dextrose (YM) agarplaten (3 g / l gistextract, 3 g / l moutextract, 5 g / l pepton, 10 g / l dextrose, 20 g / l agar) en incubeer 48- 72 uur bij 25 ° C. ⁸ ontwikkelde platen kunnen tot een week bewaard bij 4 ° C voorafgaand aan vloeibare voorkweek inocula gebruikt.
3. Bereid optimaal vastgestelde Medium (ODM), een synthetisch medium compatibel is met industriële formulering procedures ²⁰ die eerder is ontwikkeld voor een optimale omzetting van xylose naar ethanol door de ouder strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Gebruik de gedefinieerde medium in alle voorkweken en culturen voor vergisting prestaties bioassays en ook voor ethanol uitgedaagd, xylose-fed continue kweek evolutie. ODM samenstelling is te vinden voor de verwijzing in tabel 2.
4. Zoals eerder beschreven, ¹⁸ analyseren cel biomassa met behulp van een cuvette- of micro-plaat lezen spectrofotometer, in voorkomend geval, tot cultuur absorptie bij 620 nm (A ₆₂₀₎ te meten. Kwantificeren suikers, ethanol, furfural, hydroxymethylfurfural (HMF) en azijnzuur in kweek monsters met behulp van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) of robotic enzymatische bepaling van glucose en xylose hogere doorvoer.

2. Verrijk Robuuste Derivatives tijdens Serial Transfer op AFEX CSH

1. Inoculeer een voorkweek van stam NRRL Y-7124. Transfer cellen van YM agar tot 75 ml ODM + 150 g / L xylose naar het vermogen om te groeien onder o handhavensmotic stress. Incubeer voorkweken in 125 ml kolven afgesloten met silicium spons stekkers 24 uur bij 25 ° C onder schudden (150 rpm, 1 "baan).
2. Ontdooi bevroren hoeveelheden van 6-12% glucan AFEX CSH in koud water voor gebruik. Breng de pH op 5 indien nodig en filter steriliseren alvorens met een verdunningsreeks in 96-well microtiterplaten.
3. Vul microplaten met 50 ul per putje en 8 wells per hydrolysaat verdunning, daarna te enten met een paar microliter van voorkweek per putje om een initiële absorptie mogelijk te maken (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Incubeer de platen statisch 24-48 uur bij 25 ° C in een plastic doos met een natte papieren handdoek voor vochtigheid.
4. Met de meest geconcentreerde hydrolysaat verdunning zichtbaar gegroeid tot ₆₂₀ A> 1, overdracht 1-5 ul aan elk putje van een nieuwe hydrolysaat verdunningsreeks initiële A ₆₂₀ ≥0.1 bereiken.
5. Monitor groei cultuur A ₆₂₀ in microplaten met een spectrofotometer. Een niet-geënte verdunningsreeks serves als een controle en blanco. Plate deksels worden achtergelaten tijdens de controle op om besmetting te voorkomen, en de lezingen dienovereenkomstig aangepast.
6. Bereid glycerol voorraden aanpassing culturen regelmatig voor de daaropvolgende isolatie van verbeterde stammen of voor gebruik in reinoculating de aanhoudende hydrolysaat verdunning serie. Om aandelen te bereiden, zwembad vier putten (200 pl) van de grootste hydrolysaat concentratie gekoloniseerd. Mix 1: 1 met 20% steriele glycerol in cryovials, aan cellen in 10% glycerol invriezen bij -80 ° C.
7. Herhaal stap 2,3-2,6 tot groei in 12% glucan AFEX CSH is altijd zichtbaar bij 24 uur.

3. Isoleer Single Cell Tolerant Derivaten na verrijking AFEX CSH

1. Streak geselecteerde glycerol voorraden aanpassing culturen YM agar en gebruiken stroken 50 gl 3% of 6% glucan AFEX CSH (pH 5) te inoculeren in elk van de drie putjes microplaat (aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,1). Incubate microplaten 24 uur zoals in stap 2.3. Pool replicate gekoloniseerd putten op het hoogste hydrolysaat sterkte met een sterke groei, en verdunning plaat YM of 6% glucan AFEX CSH agar. Bereid de laatste als 1: 1 mix van filter gesteriliseerde 12% glucan AFEX CSH met warme geautoclaveerde 30 g / l agar-oplossing.
2. Pick 5 enkele kolonies van de hoogste verdunning plaat toont de groei na 24-48 uur incubatie bij 25 ° C te bevriezen als glycerol voorraad culturen. Streak elke kolonie een YM plaat. Incubeer 24 uur. Met een steriele lus overdracht een ontwikkelde reeks van cellen aan een klein volume van 10% glycerol, mixen om cellen te schorten en distribueren naar 2-3 cryovials ingevroren bij -80 ° C.

4. Evalueer prestaties van AFEX CSH Tolerant Derivaten Vergeleken met Parent

1. Test isolaten in de eenvoudige 6% glucan AFEX CSH Batch Cultures.
   1. Transfer cellen van 48 uur platen uitgestreken uit glycerol voorraden pH 7 kaliumfosfaatbuffer (0,4 mM) om celsuspensies te bereiden met A = ₆₂₀ 10. Gebruik 1 pielke suspensie aan elk van vier putjes van 50 gl 3% glucan hydrolysaat te inoculeren aanvankelijke A ₆₂₀ = 0,2. Incubate microplaten 24 uur zoals in stap 2.3. Bereid de 3% glucan AFEX CSH bij pH 5 door verdunning van 12% glucan AFEX CSH 1: 3 met steriel water.
   2. Overdracht twee 24 uur microtiterplaat wells voor het enten van 25 ml voorkweken van pH 5 12% glucan AFEX CSH gebruikt 50% van de volledige sterkte. Incubeer voorkweken in 50 ml kolven met silicium spons sluitingen voor 24 uur bij 25 ° C, ~ 150 rpm (1 'orbit) Bereid helft sterkte 12% glucan AFEX CSH door verdunning van het hydrolysaat 1:. 1 met steriel water.
   3. Gebruik van halve sterkte hydrolysaat voorkweken soortgelijke 25 ml groei culturen aanvankelijke A ₆₂₀ = 0,1 te enten. Incubeer de groei kweken zoals hierboven (4.1.2) en dagelijks monster (0,2 ml). Monitor ophopingen van biomassa (A ₆₂₀₎ en concentraties van suikers en fermentatieproducten (HPLC).
2. Als alternatief repitch (dat wil zeggen, de oogst en reuse) populaties van 6% glucan AFEX-CSH gekweekt gist voor testen in 8% glucan hydrolysaat batch kweken zoals eerder beschreven. ¹⁸
3. Anderzijds is er verder testpopulaties opnieuw gepikt van 6% glucan AFEX CSH kweken door het voeren met 12% glucan hydrolysaat, zoals eerder beschreven. ¹⁸
4. Test diauxic vertraging van de isolaten in batch culturen van ODM met gemengde suikers.
   1. Inoculeer voorkweken van 75 ml ODM met 150 g / L xylose in 125 ml kolven met siliconen spons sluitingen door lus transfer van YM glycerol strepen. Incubeer 24 uur zoals in stap 2.1.
   2. Gebruik voorkweken soortgelijke 75 ml testculturen inoculeren met ODM bevattende 75 g / l glucose en 75 g / l xylose bij pH 6,5. Schudkolven bij 25 ° C, 150 rpm. dagelijks proeven.
   3. Alternatief test de invloed van 0-15 g / l azijnzuur op diauxy tijdens fermentatie van glucose en xylose door een soortgelijk protocol, behalve begin-pH wordt ingesteld op 6,0 ± 0,2 in testkweken tot pH 6-7 du handhavenring azijnzuur consumptie, zoals eerder beschreven. ¹⁸

5. Breng Continu Cultuur om te selecteren voor-Ethanol uitgedaagd Xylose Gebruik

1. Bereid ODM als de continue cultuur toevoer medium met 60-100 g / L xylose, 20-50 g / l ethanol bij een pH van 6,3 ± 0,2. Kiezen combinaties van xylose en ethanol de gedeeltelijke fermentatie van 150 g / L xylose simuleren, uitgaande van een potentiële opbrengst van ~ 0,5 g ethanol / g xylose, en het potentieel geschikt voor 50-70 g / l ethanol optreden. ⁸
2. Om de continue cultuur entstof te bereiden, over te dragen een vertegenwoordiger AFEX CSH-tolerante kolonie (analoog aan Colony 5 in bijvoorbeeld figuur 1) van de loop van een 48 hr YM plaat tot 75 ml van de ethanol-vrije ODM (100 g / L xylose, in dit geval) in 125 ml kolven. Incubeer bij 25 ° C, 150 rpm (1 'orbit) gedurende 24 uur. Kies de voorkweek ODM xylose concentratie die van de oorspronkelijke continue kweek houden van volume.
3. Inoculeren een continue kweek die hoeveelheid ODM bij pH 6,3 ± 0,2 met 100 g / l xylose + 20 g / l ethanol ~ 5-10 ml van een voorkweek van een concentraat AFEX CSH-tolerante isolaat (analoog aan Colony 5 figuur 1 ) tot 100 ml bij de eerste A ₆₂₀ ~ 0,5 te verkrijgen. Handhaaf de kweek met volume _(VR), bij 25 ° C in een mantel 100 ml centrifugekolf geroerd bij 200 rpm en uitgerust met steriliseerbare pH-elektrode, pH regelaar en temperatuurregeling circulerend waterbad.
4. Aanvankelijk omdat celgroei maar langzaam zal als gevolg van blootstelling ethanol, opzetten van de voedingsmedium te doseren met behulp van een pH-aangedreven pomp. Stel de pomp te voeden pH 6,3 ODM met 100 g / L xylose en 50 g / l ethanol wanneer de kweek fermentatie laat de pH tot 5,4, waardoor het stoppen verder pH-daling. Handhaving van de volume van 100 ml met een effluent pomp continu het afromen van de cultuur oppervlak. Bijgevolg ethanolconcentratie stijgt met voortgezet metabolisme en voeding.
5. Meet effluent en monsters (1-2 ml) trekken continue culturen elke 48-72 uur voor de analyse van levensvatbare celconcentratie, producten en substraten zoals eerder beschreven. ¹⁸ Om haalbare celconcentratie te maken seriële 1:10 verdunningen van monsters in buffer (zie 4.1.1) en de verspreiding van de plaat verdunningen om YM agar (zie 1.2.1). Gebaseerd op effluent inzamelingspercentages (Q) Bereken de verdunning (D) (Q / _VR), en, in het voorbeeld van S. stipitis, varieerde 0-0,01 h ^-1.
6. Spaar glycerol voorraden regelmatig door het isoleren van de levensvatbaarheid platen van gebufferde monster verdunningen vormen 30-100 kolonies, die het meest voor robuuste kolonisten op dat moment in de verrijking. Flood platen met ~ 5 ml van 10% glycerol om de bereiding van dubbele cryovials mogelijk. Voor het onderhoud of een adempauze, stop dan het continue cultuur en opnieuw op te starten als nodig is met behulp van de meest actuele (resistente) glycerol voorraad (s).
7. Opnieuw op te starten, streak de glycerol voorraad (s) van de meesteresistente populaties YM agar en overdragen 24-48 uur cellen door lus een voorkweek van ethanolvrije ODM voor incubatie zoals hierboven. Inoculeer de 100 ml met volume van ODM de initiële A ₆₂₀ 0.5 met behulp van een concentraat van de voorgekweekt gist, en laat de cultuur tot batch-gewijs naar stationaire fase groeien voordat het voer medium stroom wordt hernieuwd.
8. Als kweken gestadig> 0,01 ^uur-1 kan groeien op xylose in de aanwezigheid van> 25 g / l ethanol, start de continue kweek toevoer (ODM + 60 g / l xylose + ethanol variërend 30 tot 50 g / l) bij een lage verdunning ~ 0,01 ^h-1 tot 100 ml met volume (aanvankelijk ODM + 60 g / l xylose + 20 g / l ethanol). Na verloop van tijd, verhogen van de ethanol in het voer in de richting van 50 g / l. Leg geavanceerde bevolking in glycerol voorraden.
   NB: Het handhaven van het lage verdunning percentage kan de vorming van een voldoende hoge cel concentratie beschikbaarheid van zuurstof en ondersteuning fermentatie te verminderen.
9. Eventueel toepassing ultraviolet (UV) bestralingenion maandelijks aan glycerol voorraad populatie gebruikt om continue culturen wordt opnieuw overgeënt.
   1. Resuspendeer kolonies van glycerol voorraad strepen in 10 ml ODM (zoals in voorkweken) met 60 g / L xylose en bundelen alle bestanden in één enkele steriele kolf. Breng de gepoolde celsuspensie bij ~ 5 x 10 ⁸ levensvatbare cellen / ml tot net onder de bodems van 4-5 Petri platen met 6 ml / plaat. Om 6 ml dekking van een standaard wegwerp petrischaal te verkrijgen, afzien van 15 ml tot oppervlaktespanning overwinnen, en verwijder dan 9 ml.
   2. Expose elke open cultuur plaat UV van de lichtbron in een biologisch veiligheidskabinet. Pas de blootstelling aan UV tijd of afstand tot de gewenste kill rate> 90% te verkrijgen. Hier blootstellen gedurende 45 minuten op ongeveer 56 cm van de bron.
   3. Verdunnen plaat celsuspensies voor en na bestraling. Schatting kill tarief op basis van kolonievormende eenheden. Voor de S. stipitis bijvoorbeeld de kill bedroeg ~ 97%.
   4. Breng de UV-behandelde culturen (24-30 ml) van een folie-covEred 50 ml kolf en incubeer bij 25 ° C en 150 rpm gedurende 24 uur om het kleine percentage levensvatbare cellen herbevolking tot ~ 1 x 10 ⁸ levensvatbare S. stipitis cellen / ml. Door het voorkomen van foto reactiveringen, de folie deksel behoudt mutaties terwijl culturen worden geïncubeerd.
   5. Gebruik de herbevolkte gemutageniseerde kweek continue culturen te inoculeren ~ 1 x 10 ⁷ levensvatbare cellen / ml. Start de-ethanol verrijkte ODM + 60 g / L xylose medium toevoer naar de selectie proces voort te zetten.

6. Evalueer Glycerol Stock Populaties en te identificeren Degenen met verbeterde xylose fermentatie in de tegenwoordigheid van Ethanol

1. Streak geselecteerde glycerol stock culturen YM agar als eerste stap in het scherm voor de beste groei en fermentatie van xylose in de aanwezigheid van ethanol.
2. Transfer elke geëvolueerd populatie worden gescreend uit agar stroken tot 75 ml voorkweken in ODM met 150 g / l glucose en incubeer in 125 ml kolven 96uur vóór gebruik als inocula voor testculturen. De grote glucosegekweekte populaties inductie van enzymen voor gebruik xylose vereisen.
   1. Inductie testen, oogst elke cultuur, schorten cellen tot 30 ml, aanvankelijke A ₆₂₀ van 40 ODM 60 g / L xylose + 30-45 g / l ethanol en incubeer bij 25 ° C, 150 rpm (1 "orbit) in 50 ml kolven met silicium spons sluitingen. tekenen monsters tweemaal daags toezicht xylose opname door HPLC-analyse.
3. Alternatief, zoals beschreven in Slininger et al., ¹⁸ groei op xylose beoordelen aanwezigheid van ethanol, bereid voorkweken van elke ontwikkelde bevolking lus overdracht aan 75 ml ODM met 150 g / l xylose in 125 ml kolven, en incubeer 96 uur bij 25 ° C, 150 rpm (1 'orbit). Inoculeer testkweken een lage initiële een ₆₂₀ van 0,1 in 25 ml ODM + 60 g / l xylose + 30-45 g / l ethanol in 125 ml kolven. Incubate kolven bij 25 ° C, 300 rpm, 1 "baan en monster.

7. Isoleer Single-cell kolonies die gebruik maken van xylose in PSGHL Wanneer Ethanol is aanwezig

1. Uit de resultaten van stap 6 selecteert glycerol stock populaties toont superieur vermogen om te groeien en fermenteren xylose in aanwezigheid van ethanol. Gebruik deze om streak platen. De reeks platen worden gebruikt om dichte, gebufferde celsuspensies van A = ₆₂₀ 5. Daarna celsuspensies worden gebruikt om voorkweken met 96 diepe putjes inoculeren A ₆₂₀ = 0,5 te bereiden. Beënten 1 ml voorkweken op PSGHL gemengd 1: 1 met ODM + 50 g / L xylose (geen ethanol). Incubate voorkweken in 96-well, diepe put platen met geventileerde lage verdamping dekt voor 48 uur bij 25 ° C, 400 rpm, 1 "baan. Aparte verschillende glycerol voorraad bevolkingsgroepen door lege putten.
2. Gebruik van elk voorkweek Inoculeer zestien 1 ml repliceren culturen aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,5 in 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L xylose met 20, 30 of 40 g / l ethanol tolerante kolonisten verrijken. Incubate verrijking cultures vergelijkbaar met voorkweken.
3. Voor elk verschillend glycerol voorraad, de oogst van de cultuur putten met de hoogste concentratie ethanol waardoor de groei en xylose te gebruiken. Plate elke cellijn te YM agar te heersen enkele kolonies te verkrijgen te bewaren in glycerol. Pick tien kolonies per cellijn en streak elk een YM agar plaat voor glycerol voorraad voorbereiding.

8. verder te verrijken Robuuste Evolved Stammen tijdens Serial Transfer op PSGHL, als voor AFEX CSH

1. Bereid pre-kweken van NRRL Y-7124 (ouder), AFEX CSH-tolerante geëvolueerd isoleren en continue kweek ontwikkelde populatie met verhoogd vermogen om xylose in aanwezigheid van ethanol. Wordt geënt in 75 ml van ODM + 150 g / L xylose door lus van glycerol voorraad strepen zoals hierboven beschreven (stap 2.1) voor de AFEX CSH hydrolysaat aanpassingsproces beschreven.
2. Verdun PSGHL met water om een ​​reeks van toenemende concentraties verschaffen. Bereid een 96-well microplaat voor elk van de drie cellijnen door elkePSGHL verdunning tot 8 putjes te vullen met 50 pi. Gebruik voorkweek elk 50 ul micro-cultuur van de verdunningsreeks aan aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,1-0,5 te enten.
   1. Verdere evolutie van gist in toenemende sterktes van PSGHL volgens dezelfde procedure als AFEX CSH hydrolysaat aanpassing hierboven (stap 2) nader tot kweken kunnen groeien in de volle sterkte hydrolysaat een stabiele 14-d gemiddelde verhouding AA ₆₂₀ per Δtime als seriële transfers zijn nog eens vier maanden voortgezet.

9. Isoleer Single-cell Colonies behulp PSGHL Verlopen met of zonder Ethanol Challenge

1. Verkrijgen van single-cell isoleert rechtstreeks uit volle sterkte PSGHL laatste aanpassing platen door verdunningsuitplatingstechniek aan YM agar. Pick tien grote kolonies voor elk van de drie cellijnen en bar strook tot YM platen glycerolvoorraden bereiden zoals eerder beschreven (stap 3,2).
2. Optioneel verkennen eerder tijdstip punten in deevolutieproces door het isoleren van opgeslagen glycerol voorraden van de drie cellijnen.
   1. Inoculeer een voorkweek voor elke cellijn door lus van glycerol voorraad strepen en incubeer 24 uur op 30 ml ODM + 50 g / L xylose (50 ml flesjes, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Uitdaging cellen van voorkweken groei in hydrolysaat door het enten van 50 pi 50% PSGHL in microtiterplaat putjes een eerste A ₆₂₀ ~ 0,2 en incubatie statisch 48 uur.
   3. Verspreid 0,1 ml van elk verrijkte kweek op agarplaten PSGHL gradiënt van 0 tot 50% sterkte hydrolysaat (~ 300-400 leveren levensvatbare cellen per plaat) en kies 10 enkele kolonies per cellijn van de hoogst mogelijke hydrolysaat concentratiegebied van de gradiënt . ²¹ Streak geplukt kolonies YM voor glycerol voorraad voorbereiding als in stap 3.2.
   4. Als alternatief voor stap 9.2.3, in plaats van enten van de gradiënt agarplaten inoculeren putjes van 96-well microplaten met aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,2, wheopnieuw de putten zijn ontworpen om een ​​scala van concentraties hydrolysaat bevatten 50-100% 's ethanol en van 10 tot 40 g / l. In dit geval, ontwikkelen microplaten 72-96 uur en voorts in stap 2,3. Isoleer tien enkele kolonies uit putten van de zwaarste hydrolysaat-ethanol combinaties die de groei via verdunningsuitplatingstechniek, en voor te bereiden glycerol voorraden zoals in stap 3.2.

10. In een primaire scherm, Elimineer Inferior isolaten door het vergelijken en Ranking Performances op PSGHL bij Two Nutrient Voorwaarden

1. Breng een high throughput diepe put plaat scherm van PSGHL prestaties scherm vijf sets van dertig isolaten samen met NRRL Y-7124 ouder en AFEX CSH-tolerante isolaat (analoog aan Colony 5 van de figuur 1 evolutie bijvoorbeeld) als controles tot zes top stammen kiezen (20%) van elke set door te geven aan de secundaire screening niveau (stap 12).
2. Uit te voeren op het scherm in de diepe put platen gevuld 1 ml per putje en bedekt with roestvrij stalen deksels met zwarte siliconen laag verdampende zeehonden. Klem alle borden aan de raad van de incubator / shaker en werken bij 25 ° C en 400 rpm (1 "shaker baan). Ontwerp alle diepe put plaat vullen patronen om scheiding van de verschillende isolaten mogelijk door open bronnen.
3. Om teelten beginnen, kies een strook cellen uit glycerol stroken bereid uit 30 isolaten verkregen zoals hierboven (in stappen 3, 7 en 9) aan putjes van ODM + 50 g / l xylose dupliceren en incubeer 48 uur.
4. Als uitdaging medium voor preculturing isolaten bereid 50% PSGHL door mengen PSGHL 1: 1 met ODM + 10 g / l glucose + 50 g / L xylose. Voor het screenen van 30 isolaten en twee controlestammen, 2 platen met 2 wells per elke 16 isolaten worden gevuld, waardoor er lege putjes tussen de verschillende isolaten.
5. Voor challenge culturen, overdracht, een 50 ul volume ODM pre-cultures (A ₆₂₀ ~ 10) aan elk van twee 50% PSGHL uitdaging kweekputjes voor elk van de isolaten en controles om een initi verkrijgenal A ₆₂₀ ~ 0,5 en incubeer 72 uur.
6. Gebruik twee proefmedia van verschillende nutritionele rijkdom voor screening isolaten: 60% PSGHL + ODM voedingsstoffen; en 75% PSGHL + ODM + YM voedingsstoffen. Voeg ODM voedingsstoffen (exclusief suikers) en de helft van de kracht als standaard ODM gebruiken met 50 g / l suiker (stap 1,3). Zoals aangeduid, voeg YM nutriënten (exclusief suikers) en de helft van de standaard sterkte van 3 g / l gistextract, 3 g / l moutextract, 5 g / l pepton.
7. Inoculeer testculturen door de overdracht van 50 pi 72 uur 50% PSGHL uitdaging pre-culturen tot 1000 pi tot aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0.5 in vijf diepe putten voor elk van de twee test-media te enten.
8. Proef elk isolaat per dag. Pipetteer de inhoud van een put naar een microfugebuis en gecentrifugeerd (5533 x g, 15 min) om bovenstaande vloeistof van ethanol, glucose en xylose high throughput analyse te verkrijgen. Meet biomassa als ₆₂₀ in 96-well microplaten (200 ul / putje) met een spectrofotometer.
9. Binnen elke set van 30 isolates getest (5 sets voor S. stipitis NRRL Y-7124 geëvolueerd stammen), het berekenen van de relatieve performance indexen (RPI), zoals beschreven in stap 11 hieronder en gebruik om elke stam te rangschikken op basis van ethanol opbrengst (maximaal ethanol geaccumuleerde per initiële suiker meegeleverd) en xylose opnamesnelheid (xylose concentratie verbruikt per eerste 96 uur) aan beide testen media.

11. Rank Isoleert in de primaire PSGHL Screen Met behulp van Relative Performance Index (RPI)

1. Na primaire screening, berekenen relatieve dimensieloze kengetallen (RPI) teneinde rangschikken de 30 isolaten in elk van de vijf verschillende experimenten scherm isolaten op PSGHL twee verschillende voedingsstoffen formuleringen per experiment, dat wil zeggen, 60% en 75% PSGHL PSGHL.
2. Bereken de statistische parameter F voor gebruik in de rangschikking isolaat prestaties binnen een groep getest met een bepaalde experiment isolaten: F = (XX _avg) / s. Hier, X de prestatieparameter, zoals opbrengst (Y)of (R), waargenomen voor elk isolaat, terwijl X _avg en s de gemiddelde en de standaarddeviatie van respectievelijk X waargenomen voor alle isolaten binnen een bepaald experiment. Voor normale verdelingen, -2
3. Voor elk isolaat in een experiment, berekenen de relatieve prestaties op basis van snelheid, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, en op dezelfde wijze de relatieve prestaties op basis van de opbrengst, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . De waarde van de RPI varieert van ~ 0-100 percentiel (oplopend). Bereken dan RPI gemiddelden voor elk te isoleren binnen een gegeven hydrolysaat experiment als volgt: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, waar de opbrengst en tarief bijdragen gelijk gewicht worden gegeven in deze toepassing.
   Merk op dat in het algemeen kunnen de opbrengst en snelheidsparameters gewogen als ongelijke belang geacht.
4. Bereken RPI _overall over de n soorten getest hydrolysaten: RPI _algehele = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Beschouw elk isolaat in een experimentele set van 30 isolaten en 2 controles. Tijdens primaire ranking van de ~ 150 single-kolonie isolaten aangepast om xylose-rijke PSGHL, de RPI _totale wordt berekend voor de tarieven en rendementen over de twee PSGHL formuleringen toegepast in het scherm, dat wil zeggen 60% PSGHL en 75% PSGHL, waarbij n = 2.
5. Op basis van RPI _algehele binnen elk experiment, kiest de top percentage van de isolaten door te geven aan de secundaire scherm. In dit voorbeeld is de top 20% van de stammen worden geselecteerd door middel (bijvoorbeeld 30 of 150 getest) te passen.

12. In een tweede scherm, Vergelijk Top Primaire Screen Performers op Multiple Compleet hydrolysaten (> 100 g / l Gemengde Sugars) naar Hoogste Werking Robuuste Stammen Reveal

1. Vergelijk top PSGHL performers op 6% glucan AFEX CSH en SGH gewijzigd met twee niveaus van stikstof, SGH-N1 en SGH-N2 (samenstellingB als in tabel 1) voor eindstand. Het scherm van de 30 isolaten dat de top performers in de primaire diepe put plaat scherm van PSGHL waren (stappen 10 en 11) en de twee controles (ouderlijke stam NRRL Y-7124 en AFEX CSH-tolerante isolaat (analoog aan Colony 5, figuur 1 voorbeeld ).
2. Begin teelten door het kiezen van een kraal van cellen van glycerol stroken tot diepe putjes van 1 ml ODM + 50 g / L xylose als hiervoor dupliceren en incubeer 48 uur in de diepe well plaat systeem (stap 10.2). Vervolgens transfer 50 pi ODM voorkweken tot 50% SGH uitdaging culturen, en incubeer in het diepe well plaat voor 72 uur naar A ₆₂₀ te verkrijgen bij ~ 10). Bereid de 50% SGH door mengen SGH 1: 1 met suikervrije ODM + 50 g / L xylose (pH 5,6).
3. Voor elk van de isolaten, inoculeren een 16 ml aliquot van SGH-N1 of N2-SGH de celpellet (15 min, 2711 x g) van drie putjes van uitdaging cultuur tot cultuur beginsnelheid A ₆₂₀ ~ 2,0 verkregen. Incubeer testculturen op 25 & #176;. C, 180 rpm (1 "orbit) in 25 ml flesjes met siliconen spons sluitingen Sample kolven dagelijks en analyseren per PSGHL het scherm.
4. Op dezelfde manier, het scherm isoleert als in de stappen 12.2 en 12.3, maar dit keer vervanger SGH-N1 en SGH-N2 met 6% glucan AFEX CSH bij een pH van 5,2 voor de uitwerking van de uitdaging kweekmedium en test kweekmedium. Voor de 50% sterkte uitdaging culturen, gebruiken 6% AFEX CSH 1: 1 verdund met water omdat het stikstof voldoende ongewijzigd.
5. Herhaal stap 12,1-12,4 om resultaten te dupliceren.

13. Rank De prestaties van isolaten in de secundaire scherm Met behulp van RPI _algehele om Rate gebruik van meerdere Compleet hydrolysaten

1. Bereken relatieve prestatie indices (RPI) om elk van de top 20% van de isolaten te rangschikken (~ 30 van de 150) van de primaire scherm die zijn getest in de secundaire scherm op enzym versuikerd hydrolysaat formuleringen van verschillende nutritionele rijkdom.
2. Score elkisoleer getest in het secundaire scherm gebaseerd op xylose opnamesnelheid en ethanolopbrengst uitgevoerd op drie-enzym versuikerd voorbehandelde hydrolysaat formuleringen in duplo, waaronder AFEX CSH (i = 1 en 2), SGH-N1 (i = 3 en 4) en SGH -N2 (i = 5 en 6).
3. Bereken de RPI _globaal voor elk isolaat en passen deze rangschikking parameter verder ziften de lijst van superieure isolaten: RPI _alles = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, waarbij n = 6 .
   LET OP: Aantonen kinetiek van superieure isolaten in SGH-N2 hydrolysaten in kolf culturen door het volgen van de procedures in Slininger et al ^18.

Resultaten

S. stipitis werd ontwikkeld met combinaties van drie selectie culturen die AFEX CSH, PSGHL en ethanol uitgedaagd xylose-fed continue kweek opgenomen. Figuur 1 toont het schema van de evolutie experimenten uitgevoerd met de isolaten hebben ofwel meest effectieve wijze overall, of het meest effectief op één van de geteste hydrolysaten. Tabel 3 toont de toegangsnummers NRRL van deze superieure isolaten en vat de aanpassing spanningen toegepast bij de werkwijze van het bereiken van...

Discussie

Verschillende stappen waren cruciaal voor het succes van het evolutieproces. Ten eerste is het belangrijk passende selectiedrukken kiezen om de populatie evolutie drijven naar de gewenste fenotypen die nodig zijn voor een succesvolle toepassing. De volgende selectieve spanningen werden gekozen voor S. stipitis ontwikkeling en toegepast op geschikte tijdstippen verrijking leidraad voor de gewenste fenotypen: toenemende sterkte van 12% glucan AFEX CSH (die de groei en fermentatie van verschillende suikers dwingt ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cellic Ctec, Bevat Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	Geen productnummer	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Bevat Cellulase en Xyalanase	Novozymes	Geen productnummer	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Gebakken Nutrisoy Meel	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Oppervlakteactieve stof)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV van sojabonen	Fluka	P0521-500g	meerdere leveranciers: bijv., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% poeder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Andere merken kunnen ook worden gebruikt. Meerdere leveranciers: bijv., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, platte bodemplaten	Becton Dickinson Falcon	351172	meerdere leveranciers: bijv., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Doek	Kimberly-Clark		handdoek in microplatedozen om water te absorberen voor bevochtiging; meerdere leveranciers bijv., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning gegradueerde pyrex kolf, 125 ml, smalle opening (stop #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	meerdere leveranciers: bijv., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R schudder/incubator, 2,5 cm (1") rotatie	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	meerdere leveranciers: bijv., Eppendorf, Thermo-Fisher. Andere schudders/incubators met een 2,5 cm (1") worp kunnen worden gebruikt.
Duetz Dekselklem voor 4 diepe putjes MTP platen	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz Systeem sandwichdeksel voor 96 diepe putjes platen	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz Systeem siliconen afdichting (0,8 mm zwart lage verdamping) voor 96 diepe putjes plaatdeksel	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blauwe microvezellaag voor Duetz systeem sandwichdeksel	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml vierkante putjes piramidebodemplaten, natuurlijk popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm siliconen sponspakketingsluitingen, pk van 25 voor 125 ml kolven	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, hun catalogusnummer is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glas Dom, Afsluitbare Flens Type, 100 ml werkvolume. Dit ontwerp wordt niet langer vervaardigd.	Bellco	1968-00100 (origineel Cat. Nr.)	Gemantelde vaten hebben la