Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

15.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

30 juli 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe villoze cytotrofoblastcellen worden geïsoleerd uit placenta's bij term door opeenvolgende enzymatische digesties, gevolgd door dichtheidscentrifugatie, media-gradientisolatie en immunomagnetische zuivering. Zoals in vivo waargenomen, differentiëren mononucleaire villoze cytotrofoblastcellen in primaire cultuur na 72 uur in multinucleaire syncytiotrofoblastcellen. In vergelijking met normoxie (8% O2) ondergaan villoze cytotrofoblastcellen die hypoxie/reoxygenatie ondergaan (0,5% / 8% O2) verhoogde oxidatieve stress en intrinsieke apoptose, vergelijkbaar met dat wat in vivo wordt waargenomen bij zwangerschapscomplicaties zoals pre-eclampsie, vroeggeboorte en intra-uteriene groeirestrictie. In deze context vertegenwoordigen primaire villoze trofoblasten die onder hypoxie/reoxygenatie-condities worden gekweekt een uniek experimenteel systeem om de mechanismen en signaalroutes die in de menselijke placenta zijn veranderd beter te begrijpen en om de zoektocht naar effectieve medicijnen die beschermen tegen bepaalde zwangerschapsstoornissen te vergemakkelijken. Menselijke villoze trofoblasten produceren melatonine en drukken de enzymen en receptoren uit die het synthetiseren. Melatonine is voorgesteld als een behandeling voor pre-eclampsie en intra-uteriene groeirestrictie vanwege de beschermende antioxiderende effecten. In het primaire villoze cytotrofoblastcellenmodel dat in dit artikel wordt beschreven, heeft melatonine geen effect op trofoblastcellen in de normoxische toestand, maar herstelt het redoxevenwicht van syncytiotrofoblastcellen dat door hypoxie/reoxygenatie is verstoord. Dus zijn menselijke villoze trofoblastcellen in primaire cultuur een uitstekende aanpak om de mechanismen achter de beschermende effecten van melatonine op de placentafunctie tijdens hypoxie/reoxygenatie te bestuderen.

Inleiding

Gedurende de zwangerschap, de placenta cytotrofoblastcellen, die mononucleaire stamcellen zijn, zich snel vermenigvuldigen en differentiëren in ofwel villous of extravilleuze cytotrofoblastcellen. Extravilleuze cytotrofoblasten binnen te vallen en de vorm van de spiraal arteriën van de baarmoederwand. Villous cytotrofoblasten, anderzijds blijven prolifereren, differentiëren en zekering multinucleated syncytiotrofoblast (de syncytium) 1 vormen. Het onderhoud van villi trofoblast homeostase is essentieel voor foetale welzijn en gezonde zwangerschap. In feite, villous trofoblasten mogelijk maternale-foetale uitwisseling van zuurstof en voedingsstoffen en hormonen produceren essentieel voor de zwangerschap. Bovendien is het syncytiotrofoblast het enige celtype in direct contact met de maternale bloedsomloop en een essentiële fysische en immunologische barrière. Daarom moet de syncytiotrofoblast apoptose en vervanging ondergaan homeostatische onderhoud en AVOid placenta pathologie 2-5.

De door Kliman et al. 6 ontwikkeld in 1986 tot primaire villous cytotrofoblasten isoleren van menselijke placenta's techniek zorgde voor een revolutie in de placenta onderzoek doordat de studie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij villous trofoblast differentiatie. Deze klassieke techniek, waarbij in de enzymatische digesties met trypsine en DNase, gevolgd door isolatie van dichtheidscentrifugatie media (colloïdale silicadeeltjes bekleed met polyvinylpyrrolidon of Percoll) wordt nu erkend als de gouden standaard voor het isoleren villeus cytotrofoblastcellen. De techniek kan worden geoptimaliseerd door magnetische immunozuivering, een procedure die villous cytotrofoblasten scheidt van niet-trofoblastcellen gebaseerd op de differentiële expressie van specifieke antigenen op het oppervlak van deze cellen. We kozen voor het menselijke leukocyt antigen ABC (HLA-ABC) vanwege de afwezigheid van de expressie op het trofoblastische cel membraame 7,8.

De placenta is een orgaan dat dramatische verschillen in zuurstofgehalte ondergaat tijdens de zwangerschap. In het eerste trimester is de oxygenatie verhouding fysiologisch zeer laag (2% O 2) maar neemt milde niveaus van oxygenatie (8% O 2) in het tweede en derde trimester. Tuuli et al. 9 beschreven dat het in vitro reproduceren van de trofoblast omgeving in de placenta villi is een uitdaging en variaties oxygenatie niveau kan zelfs leiden tot fenotypische veranderingen. Het is daarom voorgesteld 8% zuurstof vast die normoxia de zuurstofspanning in placenta villi in het derde trimester van de zwangerschap 8,9 nabootsen. Chen et al. 10 uitgebreid bestudeerd verscheidene variabelen in verband met zuurstofspanning in trofoblast celkweek en toonde het belang van het bepalen van het zuurstofgehalte in een pericellulaire omgeving. De niveaus van zuurstof in de villi neiging te stijgendoor vasculogenese. De bloedstroom in placenta villi voortdurend toeneemt en het niveau van waterstofperoxide (een overvloedige reactieve zuurstofspecies) een belangrijk signaal dat vasculogenese 11,12 regelt. In de zwangerschap complicaties, een gebrek aan vasculogenese genereert hypoxie, en nog belangrijker, intermitterende variaties van oxygenatie (genaamd hypoxie / reoxygenatie). Deze omstandigheden leiden tot een abnormale verhoging van de oxidatieve stress, die de placenta en de levensvatbaarheid van de foetus 13,14 compromissen. De veranderingen die trofoblast cellen ondergaan in vivo tijdens episodes van hypoxie / reoxygenation kan worden nagebootst in vitro als volgt: villous cytotrofoblasten onder normoxische omstandigheden (8% O 2) totdat ze differentiëren tot syncytiotrofoblast worden gehandhaafd. Zij worden vervolgens onderworpen aan hypoxische omstandigheden (0,5% O2) gedurende 4 uur, gevolgd door nog 18 h normoxia (reoxygenatie). Met behulp van deze hypoxie / reoxygenation benadering, trofoblasten exHiBit gedereguleerd redox status en verhoogde intrinsieke apoptose 8, zoals in sommige zwangerschap complicaties waargenomen. Daarom is het zinvol om in vitro model om nieuwe preventieve en therapeutische mogelijkheden te evalueren bestrijding zwangerschap complicaties van placenta hypoxie / reoxygenatie.

Placenta cellen produceren melatonine, dat een aantal belangrijke functies, zoals het vermogen om oxidatieve stress en placentale dysfunctie 15 overbodig is. Hier presenteren we de experimentele aanpak en mobiele modellen die worden gebruikt om de beschermende effecten van melatonine in de placenta trofoblast cellen vertonen op moleculair, cellulair en functioneel niveau 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Placenta's werden verkregen direct na spontane vaginale leveringen van ongecompliceerde zwangerschap met de CHUM-St-Luc ziekenhuis, Montreal, QC, Canada, met geïnformeerde toestemming van de patiënt en de goedkeuring van de ethische commissies (CHUM-St-Luc Ziekenhuis en INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).

1. Isolatie en zuivering van Villous cytotrofoblastcellen

  1. Oplossingen en media
    1. Bereid transportmiddelen aanvulling Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium hoog glucosegehalte (DMEM-HG) met 1% vol / vol antibiotica (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) en bewaar bij 4 ° C.
    2. Bereid primaire kweekmedium door DMEM-HG vullen met 10% v / v foetaal runderserum (FBS), 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1% vol / vol antibiotica (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) en bewaar bij 4 ° C. Warm media tot 37 ° C vóórgebruiken.
    3. Bereid 4 L zoutoplossing (0,9% gew / vol natriumchloride).
    4. Bereid gemodificeerde Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) door toevoeging van 25 mM HEPES tot 1x HBSS (pH 7,4).
    5. Vers bereid, vier flessen ontsluitingsoplossing met gemodificeerde HBSS (bereid in 1.1.4), magnesiumsulfaat (MgSO4), calciumchloride (CaCl2), trypsine, desoxyribonuclease IV (DNase IV), en 1% vol / vol antibioticum ( 10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) zoals getoond in tabel 1.
    6. Bereid dichtheid centrifugeren media gradiënt
      1. Bereid dichtheid centrifugeren media-oplossing aan te vullen dichtheid centrifugeren media met 10% vol / vol HBSS 10x.
      2. Bereid 14 testbuizen met dichtheidscentrifugatie mediaoplossing gewijzigde HBSS, zoals aangegeven in tabel 2.
      3. Meng elke density oplossing (stap 1.1.6.2) krachtig voor de inhoud toe te voegen aan het verloop. Voorzichtigvoeg de dichtheid oplossingen een 50 ml glazen centrifugebuis met een peristaltische pomp (1 ml / min), beginnend met de hoogste concentratie (70%). Vermijd druppeltjes door het laten uitlekken van de oplossingen tegen de buiswand op de juiste scheiding van elke laag van de helling te handhaven.
        1. Bij afwezigheid van een peristaltische pomp, de lagen aan te brengen heel voorzichtig met Pasteurpipetten.
    7. Bereid definitieve loopbuffer door daaraan loopbuffer (zie tabel of Materials) met 2% vol / vol antibioticum / antimycoticum (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat). Bewaren bij 4 ° C.
  2. Villous cytotrofoblast isolatie
    Opmerking: Gebruik steriele chirurgische apparatuur, glaswerk, pipetten, flesjes, enz.
    1. Op de dag van villi cytotrofoblast isolatie, in een 37 ° C waterbad, warm de spijsvertering oplossingen (uit stap 1.1.5) en 70 ml FBS. Opmerking: Gebruik 50 ml FBS aan de vertering en onderbrekenresterende 20 ml voor het invriezen stap (1.2.22) die op ijs worden gebracht als ontdooid.
    2. Na de bevalling, breng de placenta naar het laboratorium in ijskoude transportmedium (uit stap 1.1.1) zo snel mogelijk (minder dan 1 uur).
    3. Teruggooi transportmedium en de placenta bloed in vloeibare vuilnisbak. Weeg de placenta en onder te dompelen in koude zoutoplossing.
    4. Meet en de volgende functies te analyseren: navelstreng lengte; navelstreng lokalisatie; placenta lengte, breedte, vorm (ovaal, discoïde); membraan kleur; zaadlob structuur pathologieën. Opmerking: De gegevens worden in de resultaten sectie.
    5. Snijd de navelstreng, naast haar placenta inbrengen (dat wil zeggen, aan de basis van een extra 1 cm straal cirkel rond het snoer). Dompelen in 300 ml histologische fixerende oplossing (formaline 10%) voor latere histologische analyse.
    6. Snijd de hele placenta in blokjes van 5 x 5 x 5 cm. Grondig wassen (4 x x ~ 1 min) in zoutoplossing solution (0,9%) bloedcellen te verwijderen totdat zoutoplossing duidelijk. Gooi spoelvloeistof.
    7. In een horlogeglas, verwijder de placenta membranen en gehakt weefsels aan de bloedvaten en verkalkingen te verwijderen. Houd bloedvaten stevig vast met een tang en verwijder weefsels met behulp van de achterkant van Metzenbaum schaar.
      1. Plaats gehakt placenta in een Büchner trechter. Spoelen met ongeveer 100 ml van een zoutoplossing buffer. Blijven hakken tot 30-35 gram gehakt weefsel wordt verkregen (gebruik plastic wegen boot en schaal). Indien nodig, gehakt de rest van de placenta te verkrijgen tot drie extra 30-35 g preparaten. Gedurende deze tijd, zet gehakt weefsel in een weegschuitje op ijs.
        Opmerking: Deze stap zal ongeveer 45 minuten duren 1 uur.
    8. Voeg de 30 - 35 g gehakt placenta weefsel om een ​​trypsinizing kolf. Overdracht 150 ml van de bereide ontsluitingsoplossing 1 (tabel 1) bij de trypsinizing kolf en meng.
    9. Plaats de kolf in trypsinizingeen schuddend waterbad gedurende 30 minuten bij een snelheid van niet meer dan 50 cycli / min en handmatig trypsinizing kolf zachtjes elke 5 min gedurende homogene spijsvertering.
    10. Aan het einde van de eerste digestie verwijdert de trypsinizing kolf uit het waterbad en kantelen (45 °) gedurende 1 min naar het placentaweefsel sedimenteren. Met een 10 ml steriele pipet, te verwijderen en gooi ongeveer 80 ml van de bovenstaande. Vermijd het opzuigen van het weefsel.
    11. Breng 100 ml ontsluitingsoplossing 2 (tabel 1) bij de trypsinizing kolf; meng goed en herhaal stap 1.2.9.
    12. Aan het einde van de tweede spijsvertering, verwijder de trypsinizing kolf uit het waterbad en kantelen 45 ° gedurende 1 minuut. Met een 10 ml steriele pipet Verwijder 80 ml supernatant en voorzichtig overbrengen naar een centrifugebuis met een cel zeef (100 um mesh). Breng de bovenstaande vloeistof gefiltreerd met een bekerglas met 2 ml FBS telkens de centrifugebuis vol.
    13. Voer de derde digestie zoals beschreven voor detweede spijsvertering (1.2.11 en 1.2.12) met behulp van 75 ml spijsvertering oplossing 3. Tegelijkertijd voeren stappen 1.2.15 om 1.2.16.1 voor de spijsvertering 2.
    14. Voer de vierde digestie precies zoals de derde digestie met de verteringsoplossing 4 (75 ml), maar laat een maximale hoeveelheid supernatant. Voer stap 1.2.15 om 1.2.16.1 in parallel voor de spijsvertering 3, en ten slotte voor de spijsvertering 4.
    15. Aliquot de supernatant (van digesties 2, 3 en 4) in 13,5 ml delen, elk in een 15 ml centrifugebuis. Met een 22,8 cm lange glazen Pasteur pipet zachtjes en langzaam plaats 1,5 ml FBS onder aan elke buis om een ​​afzonderlijke laag. Meng geen FBS en supernatant. Centrifugeer de buizen zonder rem gedurende 20 minuten bij 1250 xg bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Na centrifugeren 4 lagen zijn zichtbaar in de buis, zoals weergegeven in figuur 1 De scheiding van trypsine en trofoblast cellen voorkomt overmatige cellulaire spijsvertering..
    16. Met een vacuümpomp, Aspiraten en gooi het supernatant (spijsvertering oplossing) en FBS lagen, met inbegrip van de witachtige film tussen de twee lagen. Resuspendeer de pellet (de trofoblasten en rode bloedcel lagen) met 1 ml warm celkweekmedium (stap 1.1.2, zonder FBS en zonder HEPES).
      1. Verzamel geresuspendeerde cellen van alle buizen en combineren in 1 tube. Laat de buis bij kamertemperatuur staan ​​tot het einde van alle ontsluitingen. Let op: Na alle ontsluitingen, de gebruikelijke opbrengst is 3 tubes van geresuspendeerde cellen (één per spijsvertering).
    17. Make-up het volume op 15 ml met warme celkweekmedium. Centrifugeer bij 1250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een vacuümpomp. Vermijd opzuigen de pellet.
    18. Voorzichtig resuspendeer de pellet verkregen uit de 3 buizen met 1 ml warm celcultuurmedium. de inhoud in 1 tube zwembad. Om 8 ml te verkrijgen, vul het volume met warme celkweekmedium.
    19. Heel voorzichtig laag de celsuspensie op een scheiding gradseerde met een Pasteur pipet. Centrifugeren zonder rem gedurende 30 min bij 507 xg bij kamertemperatuur.
    20. Na centrifugeren identificeren van de verschillende lagen van cellen in het verloop met achtergrondverlichting. Zoek de lagen die trofoblast en contaminerende cellen tussen 40 - 50% van dichtheidscentrifugatie medium. Met een vacuümpomp verwijdert de bovenste lagen (> 50%).
    21. Verzamel cellen die zich in de lagen van belang met een Pasteur pipet en overbrengen naar een 50 ml centrifugebuis. Vul met water aan tot 50 ml met celkweekmedium. Centrifugeer 10 minuten bij 1250 xg bij kamertemperatuur.
    22. Onder steriele omstandigheden, gooi het supernatant, resuspendeer de pellet met 20 ml FBS en tel het aantal cellen met een hemocytometer. Op ijs, voeg 2,22 ml steriele dimethylsulfoxide (DMSO) en meng door omkeren. Aliquot 1,5 ml celsuspensie in cryogene flesjes, invriezen overnacht bij -80 ° C en overbrengen in een vloeibare stikstof tank.
  3. Trofoblast zuivering
    1. Installeer de spoelen en actief buffers en een nieuw filter kolom aan de magnetische zuivering instrument volgens de instructies van de fabrikant. Voer de "schone programma" negatieve 1, positieve 1 en positieve 2 poorten schoon te maken, en vervolgens de invoering van de 50 ml buizen onder elke haven volgens instructies van de fabrikant.
    2. Ontdooi de cellen die werden bevroren in stap 1.2.22 snel in een 37 ° C waterbad. Overdracht cellen om een ​​50 ml buis en resuspendeer cellen zachtjes met 20 ml koud bufferoplossing. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C.
    3. Verwijder het supernatant. Herhaal de wasstap met koud stromend buffer. Aantal cellen met een hemocytometer levensvatbaarheid te bepalen. Centrifugeer nogmaals (gedurende 5 min, 450 x g bij 4 ° C). Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Voeg 1 ml koude loopbuffer die 1% vol / vol muizen anti-HLA-ABC-antilichamen. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min, mixing zachtjes elke 5 min.
    4. Voeg 6 ml koud stromend buffer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en herhaal deze stap. Resuspendeer cellen in 1 ml koude loopbuffer die 10% vol / vol anti-muis secundair antilichaam gekoppelde magnetische korrels. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten, voorzichtig mengen om de 5 min.
    5. Voeg 6 ml koud stromend buffer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 ml koud stromend buffer.
    6. Scheid de trofoblast cellen met de magnetische zuivering instrument. Verzamel cellen op het negatieve haven en voeg 20 ml koud stromend buffer.
      Opmerking: trofoblast cellen niet bevatten complexe HLA-ABC en worden dus gescheiden van andere celtypen en gericht naar de negatieve 1 poort.
    7. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 20 ml warme primaire kweekmedium. Tel de cellen usinga hemocytometer om de levensvatbaarheid te bepalen.
    8. Plaat de cellen op de volgende dichtheden: 0,15 x 10 6 cellen / putje in 96-putjesplaten, 1,6 x 10 6 cellen / putje in 24-putjesplaten en 4,5 x 10 6 cellen / putje in 6-well platen. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2.
    9. Bevestigt de zuiverheid van de trofoblast cellen door flowcytometrie 16,17 en / of 18 immunocytochemie.
      Opmerking: De zuiverheid van het immuungezuiverd cellen werd bepaald met FITC-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen cytokeratine-7 en vimentine 17-19. Dit protocol is goed gedetailleerd in Lanoix et al., 2008 7.
    10. Na minimaal 4 uur Spoel de cellen tweemaal met warm kweekmedium losse cellen te verwijderen en vervolgens de platen dragen aan de normoxia kamer, die is samengesteld uit 8% O 2 (zie figuur 2 en paragraaf 2).

2. In vitro Induction van normoxia en hypoxie / reoxygenation

  1. Incubator kamer operatie (zie figuur 2A voor de set-up).
    1. In een laminaire stroming kap, plaats een petrischaal met steriel water op de bodem van de kamer incubator tot droog voorkomen; plaats de eerder bereide cel kweekplaten of flessen (stap 1.3.10) op de superieure schappen van de kamer.
    2. Buiten de kap, sluit de kamer (inlaatpoort) aan de gasslang (Figuur 2A: 5a, b en c) de buis gas (8% O 2 of 0,5% O 2) te bereiken (Figuur 2A: 7). Open beide inlaat en uitlaat poorten van de kamer. Op dit moment, het gas regulator (Figuur 2A: 4) moet gesloten blijven.
    3. Open voorzichtig de gas-regelklep (Figuur 2A: 4). Flush 4 min onder een luchtstroom van 25 l / min tot volledig vervangen van de lucht in de kamer.
    4. Na het spoelen van de kamer, sluit het gas regulator dan de inlaat en outlet havens van de kamer.
    5. Koppel de debietmeter afvoerslang (Figuur 2A: 5c) vanaf de inlaatpoort van de kamer en plaats de kamer in een cel incubator bij 37 ° C.
    6. Vervang het moment aanwezig in de platen, kolven en opgelost in het kweekmedium door het vullen van de kamer met gas 1 uur na stap 2.1.3.
    7. Herhaal de stappen 2.1.1 tot 2.1.6 voor de andere composities gas (bv, 2% O 2 voor de eerste trimester trofoblast cultuur 9).
  2. Bevestig het zuurstofpercentage (Figuur 2B-C)
    1. De concentratie van zuurstof in de celkweek medium (zonder cellen) binnen de kamer te bevestigen, gebruikt een zuurstof elektrode verbonden met een zuurstof adapter. Sluit de zuurstof elektrode naar een voltmeter.
    2. Een kalibratiekromme in dezelfde oplossing (bijv celkweekmedium) Door de oplossing bloot gassen met bekende zuurstofgehaltes (bijvoorbeeld 0% en21% zuurstof). Nadat de metingen zijn gestabiliseerd voor elke concentratie, dient de elektrode in het medium in de kamer.
      Opmerking: Neem alle metingen op dezelfde diepte om eventuele bias in zuurstofconcentratie 10 voorkomen.
  3. Inductie van normoxia en hypoxie / reoxygenatie in trophoblasts.
    1. Na toevoeging primaire trofoblast cellen de juiste celkweek flessen, platen of petrischaaltjes, voeren behandelingen nodig.
    2. Tegelijkertijd binnen de kamer, bloot cellen het gewenste gasmengsel te reproduceren een specifieke voorwaarde elke 24 uur (figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie en immunozuivering van villous cytotrofoblastcellen van een normale term placenta verkregen door vaginale bevalling leverde 1 x 10 8 levensvatbare cellen. De placenta woog 350 g, was 19 cm in diameter 4 cm hoog met schijfvormige vorm en transparant membranen. Geen zaadlob misvorming werd gedetecteerd. De navelstreng had paracentrale lokalisatie en een lengte van 56 cm. De zuiverheid werd beoordeeld door flowcytometrie behulp vimentine en cytokeratine 7-merkers. Meer d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In zoogdieren, ontwikkeling van de foetus is direct afhankelijk van een adequate placenta-functie. De oorsprong van ontwikkeling stoornissen zijn gebaseerd op de hypothese dat de oorzaak van ziekten manifesteren op latere leeftijd naar vroege ontwikkeling en dat de placenta een mechanistische rol bij de foetale 30-32 kunnen worden getraceerd. De placenta is de sleutel mediator van de foetale groei en ontwikkeling: het reguleert nutriëntentransfers, beschermt tegen schadelijke blootstelling, en heeft grote end...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (nr. 262011-2009) aan CV en March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) aan CV en JTS; door beurzen aan LSF van het Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieur et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) en de Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, aan HC van het Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, aan AAHT van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) en FRQ-Santé, en aan JBP van NSERC; door een fellowship aan EMAS van de Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) en het Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Curved Metzenbaum ScissorsShandon9212chirurgische apparatuur (celisolatie) (2 eenheden)
Splinter Forceps Fine 41/2 inFisherbrand13-812-42chirurgische apparatuur (celisolatie) (2 eenheden)
Scissors 4.5 Str DissectionFisherbrand08-940chirurgische apparatuur (celisolatie) (2 eenheden)
Gauze Sponge 10 cm x 10 cmCardinal Health361020733
Oblong Glass Baking DishPyrex1105397Glaswerk (2,8 L)
Funnel BuchnerCoorstek Inc10-356EGlaswerk (114 mm diameter)
Watch Glass pyrex9985100EMDGlaswerk
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Loplossing voor histologisch weefselfixatief
Trypsinizing FlasksWheaton355395Glaswerk (1 eenheid)
Disposable Culture TubesKimble73750-13100Glaswerk
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm)FisherbrandK63B1367820CGlaswerk
250 ml Glass BeakersFisherbrandKFS14005250Glaswerk
Glass Media Bottles With CapFisherbrandKFS14395250Glaswerk (8 eenheden)
50 ml Corex Tube Corning8422-A(1 eenheid)
15 ml Polystyrene Centrifuge TubeCorning430791
50 ml Polystyrene Centrifuge TubeCorning430829
10 ml Serological PipetCorning11415038
Cell Strainer 100 μm NylonCorning431752
Absorbant LinerScienceware1199918
500 ml Bottles Top FilterCorningPore: 0.22 µm / medium en HBSS-voorbereiding
2 ml Criogenic VialsCorning430488
Freezing Container, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
Peristaltic PumpPharmacia Fine ChemicalsP3 model
Shaking Water BathFisherModel 127
Vacuum PumpABM4EKFS6CX-4
Sodium ChlorideFisherbrandEC231-598-3Zoutoplossing 0,9%
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss)Sigma-AldrichH2387Hoeveelheid: 9,25 (één flesje) voor 1 L van de verteringsoplossing
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)Life Technologies15630-08025 ml (1 M) voor 1 L van de verteringsoplossing
Trypsin Type ISigma-AldrichT80039.888 U
Deoxyribonuclease Type IvRoche10-104-159-001402.000 U
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901100 mM
Magnesium SulfateBaker2500-01800 mM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)Life Technologies10564-045
Penicillin/Streptomycin SulphateHycloneSV30010
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Densiteitscentrifugeringsmediagradient. Volume: 36 ml
IsopropanolAcros42383-001050 ml
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich472301
Automacs Magnetic Separator Miltenyi BiotecModel 003
Automacs Columns Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs Running Buffer Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs Rinsing Solution Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82anti-muis antilichaam
Anti Mouse Igg MicrobeadsMiltenyi Biotec130048401
Multiple Well Plate -  6 Well With LidCorning3335Cell Bind-oppervlak
Multiple Well Plate -  24 Well With LidCorning3337Cell Bind-oppervlak
Multiple Well Plate -  96 Well With LidCorning3300Cell Bind-oppervlak
Modular Incubator Chamber Billups-RothenbergMIC-101Een set van twee is noodzakelijk voor gelijktijdig genereren van normoxia en hypoxia/reoxygenatiecondities
Single Flow MeterBillups-RothenbergSFM3001
50 mm In-Line FilterWhatman6721-5010PTFE, pore: 1,0 µm
Gas RegulatorPro StarPRS301233Een set van twee is noodzakelijk voor gelijktijdig genereren van normoxia en hypoxia/reoxygenatiecondities
Gas Hose Class Vi Clear 5/16 Parker100-050701023 stuks met ~ 0,5 m
17 mm Adjustable Gas Hose ClampTiewrapsTHCSS-16
Normoxia Gas Cylinder PraxairNI CDOXR1U-KMaat K (3rd trimester's samenstelling

Referenties

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van villus cytotrofoblastenprimaire trofoblastkweekhypoxie reoxygenatiemodelbeschermende effecten van melatonineimmunomagnetische zuiveringdichtheidscentrifugatieflowcytometrie analysedifferentiatie van syncytiotrofoblastenbeoordeling van oxidatieve stressb ta hCG secretie
Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.