Een nieuwe gedragstest wordt beschreven voor het onderzoeken van de kortetermijn smaakgevoelens van de monddelen van vrij bewegende hommels (Bombus terrestris) ten opzichte van voedingsstoffen en gifstoffen in oplossing.
Methodenartikel
A Novel Behavioral Assay om Smaak reacties van individuele, vrij bewegende Bumble Bees Onderzoek (
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Generalist bestuivers zoals de-buff tailed stuntel bij, Bombus terrestris, stuiten zowel voedingsstoffen en giftige stoffen in de bloemen nectar die zij verzamelen van bloeiende planten. Slechts een paar studies hebben beschreven de smaak reacties van de bijen in de richting van giftige stoffen in voedsel, en deze experimenten hebben voornamelijk gebruik gemaakt van de proboscis extensie respons op ingetogen honingbijen. Hier wordt een nieuwe gedrags-test gepresenteerd voor het meten van het voederen reacties van vrij bewegende, individuele werknemer hommels om voedingsstoffen en toxines. Deze test meet de hoeveelheid oplossing ingenomen door elke hommel en identificeert hoe tastants in voedsel invloed op de microstructuur van het eetgedrag.
De oplossingen worden op een microcapillaire buis individuele hommels die eerder zijn uitgehongerd voor 2-4 uur. Het gedrag is vastgelegd op digitale video. De fijnstructuur van het voedingsgedrag wordt geanalyseerd door het continu maken van de positie van de ProboGCB (monddelen) uit video-opnamen met behulp van event logging software. De positie van de snuit wordt bepaald door drie verschillende gedragscategorieën: (1) snuit is verlengd en in contact met de oplossing, is (2) zuigorganen uitgebreid maar niet in contact met de oplossing en (3) zuigorganen wordt opgeborgen onder de kop. Verder is de snelheid van de snuit terugtrekken weg van de oplossing wordt geschat.
In de onderhavige bepalingsmethode het verbruikte volume, het aantal voederplaatsen periodes, de duur van de toevoer aanvallen en de snelheid van de snuit terugtrekken na het eerste contact wordt gebruikt om de phagostimulatory of afschrikkende werking van de geteste verbindingen te evalueren.
Deze nieuwe smaak test kunnen de onderzoekers om te meten hoe stoffen gevonden in nectar invloed op het eetgedrag van de bijen en zal ook nuttig zijn voor de bestuiving biologen, toxicologen en neuroethologists het bestuderen van de smaak van de hommel's systeem.
Inleiding
Plant-bestuiver interacties zijn complex. Bestuivers te bezoeken bloemen naar nectar en stuifmeel als voedsel te verkrijgen; op zijn beurt, bestuivers te vergemakkelijken seksuele voortplanting bij planten. Hoewel deze relatie is meestal mutualistic, bloemen nectar en stuifmeel bevatten soms toxines of andere plantaardige verbindingen 1-5 die kan bestuivers schaden. De ecologische motieven voor de aanwezigheid van dergelijke verbindingen in nectar en stuifmeel is niet duidelijk in alle instellingen. Een uitstekende vraag op dit gebied is hoe bestuivers zoals bijen kunnen detecteren en te voorkomen dat bloemen met nectar bevatten giftige stoffen.
De hommel soorten, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), is een generalist bestuiver dat de bloemen van vele plantensoorten met inbegrip van de productie van nectar dat toxines bevat 6 bezoekt. Hommels is aangetoond dat consumeren oplossingen met hoge concentraties toxinen in een 24 hr twee keuze assay 7 voorkomen. deze assayvan de voedselconsumptie beschreven door Tiedeken et al. 7 is gebleken dat de bijen bitter verbindingen kunnen detecteren in oplossingen. Echter, was deze test niet in staat om de smaak te onderscheiden van post-ingestive processen zoals malaise, die ook van invloed kunnen zijn voedingsgedrag in deze tijd interval 8-10.
Bijen hebben smaak sensilla op hun antennes, monddelen en tarsi om verbindingen 11-13 te detecteren. De proboscis extensie reflex (PER) experimenten betrekken beteugeling van individuele bijen in een harnas en vervolgens het stimuleren antennal sensilla van de bij de productie van het voederen reflex 14-17. Bijen kunnen worden tegengehouden in individuele harnassen en vervolgens gestimuleerd tot het voederen reflex produceren als een analyse van hun vermogen om verbindingen 18,19 proeven. Anderen hebben de PER test om de gevoeligheid van de antennes of monddelen om gifstoffen 9,20 studeren gewijzigd. Echter, bijen blootgesteld aan spanning tijdens benutten. Dit kan invloed hebben op hoeze reageren op verbindingen 21.
Hier wordt een nieuwe test beschreven om de gedragsmatige smaak reactie van vrij bewegende hommels aan sucrose en kinine, een alkaloïde dat eerder werd gemeld afschrikmiddel te beoordelen 9 en giftig 10 tot honingbijen (Apis mellifera) en hommels (Bombus terrestris) 7, 22. Hoewel kinine is niet gevonden in plantaardige nectar, wordt dit alkaloïde vaak gebruikt als een aversieve stimulus in gedrags-en fysiologische studies in bijen 7,9,12,13,22. De methode bestaat uit video-opname monddelen van de hommels bij een hoge resolutie tijdens de eerste slurf contact met de testoplossingen. Specifiek wordt de fijne structuur van de voedingsreactie onderzocht door continu maken van gedrag in een 2 minuten interval. De verbruikte volume wordt gemeten gedurende de voertijd en zo de hoeveelheid voedsel gegeten kunnen worden gecorreleerd met de microstructuur vanhet eetgedrag. Ook de snelheid van de snuit terugtrekken wordt gemeten als een indicator van een werkzame vermijden en derhalve vooraf ingestive detectie.
Protocol
1. Het vastleggen van Bijen van de Kolonie en de honger Periode
Let op: De experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd op de Universiteit van Newcastle, Verenigd Koninkrijk met Bombus terrestris Audax. Multiple (2-3) in de handel gekocht kolonies werden gebruikt per behandeling. De kolonies zijn gehandhaafd op een bankje bij laboratoriumomstandigheden (25 ± 2 ° C en 28 ± 2% RV) in constante duisternis en werden gevoed met honing bijen verzameld stuifmeel en suikeroplossingen ad libitum.
- Verzamel individuele werknemer hommels behulp van een plastic flesje (7 cm lang, 2,8 cm inwendige diameter) met een geperforeerde plastic stop, nadat de gate voor een bee hebben geopend naar de kolonie net lang genoeg om af te sluiten en vast te zitten.
- Voorafgaand aan het experiment, individueel verhongeren alle hommels voor 2-4 uur in plastic flesjes en bewaar bij kamertemperatuur in het donker.
2. overbrengen Bees in de Holding Tubes en de Habituation Phase
- Na de hongerdood periode, dragen een hommel rechtstreeks uit de plastic flesje in een bedrijf buis. De met buis is een gemodificeerde 15 ml centrifugebuis (lengte: 119 mm, diameter 17 mm), met een 4 mm gat aan het uiteinde en een stuk draadgaas (basis: 8 mm; hoogte 30 mm) in door smelten vastgesteld de kunststof van de buis met een verwarmd dissectie stalen naald.
- Bevestig het bedrijf buis met de hommel op een polystyreen houder met tandheelkundige wax. Fix twee stukken karton aan beide kanten van de wachtbuis. Dit is om de bijen te schermen van visuele stimuli die storende experiment.
- Plaats een digitale microscopische camera 5 cm boven de top van het bedrijf buis en sluit de camera op een compatibele laptop.
- Stel de wachtbuis zodat ten minste de eerste 18 mm van de wachtbuis punt binnen het videoframe. Voorafgaand aan het experiment, beginnen de 3 min gewenningsperiode.
3.Pre-testfase: Het voorstellen van een Daling van sucrose
- Sluit een injectiespuit aan een vrouw adapter met een druppel sucrose oplossing (~ 3,5 pl, 500 mM sucrose, opgelost in gedeïoniseerd water). Presenteer de sucrose in de wachtbuis tip om de uitbreiding van de slurf te motiveren.
- Geef de hommel tot 5 min naar het sucrose druppel verbruikt. Als de druppel niet verbruikt wordt, verwijdert u de hommel uit het experiment.
- Begin video-opname na de gewenningsperiode. In deze studie werd de slurf activiteit opgenomen met 26,7 beelden / sec -1 met een 25X vergrotingsfactor.
4. Test Fase: de presentatie van de testoplossing
- Vul een 100 ul microcapillaire buis met de testoplossing. Sluit hem aan op een stuk van siliconen buis (6 cm lang, 1 mm binnendiameter) en bevestig deze aan een micro-manipulator.
- Sluit de slang via een mannelijke adapter naar een andere silicone (6 cm lang, 4 mm inwendige diameter), whilech fungeert als pipet bol.
- Plaats de microcapillaire buis 5-10 mm afstand van de wachtbuis tip. Knijp voorzichtig in de slang aan op de voedingsoplossing op het puntje van de microcapillaire buis te handhaven.
- Na de hommel verbruikt de sucrose druppel, onmiddellijk de spuit met de 500 mM sucrose oplossing te verwijderen.
- Begin de 2 min testfase toen de hommel's slurf contact komt met de oplossing in de microcapillaire buis.
- Om te controleren voor mogelijke verdamping, vullen twee extra microcapillair buizen met sucrose of water en manipuleren precies zoals tijdens de testfase.
- Voor en na elke proef scan de vloeistofniveaus in de microcapillaire buis met een scanner 600 dpi tot de hoeveelheid geconsumeerd voedsel (figuur 4A) te meten.
5. Afbeelding Analyses
- Bepaal het volume van de oplossing verbruik met behulp van ImageJ (versie 1.48), een beeld processing software.
- Upload het beeldbestand en zoom in het beeld (~ 400%). Om de referentie schaal instellen, selecteert u de rechte lijn gereedschap en trek een lijn tussen de twee uiteinden van de microcapillaire buis. Selecteer 'Analyseren' en vervolgens 'Set Scale'. Voer de totale lengte van de buis onder "bekende afstand en de overeenkomstige eenheid onder" eenheid van lengte.
- Selecteer de rechte lijn gereedschap weer en een lijn te trekken tussen de twee uiteinden van het vloeistofniveau. Selecteer 'Analyseren' en vervolgens 'Measure'. In het venster resultaten de lengte van de vloeistof is opgenomen in de kolom "lengte".
- Bereken het volume van de oplossing consumptie uit de volgende formule:
waar
is de lengte van de buis en microcapillaire 
en 
zijn de gemeten lengte van de vloeistof in de microcapillaire buis voor en na de testfase, respectievelijk.
6. Video Analyses
- Score het voederen gedrag tijdens de 2 min testfase van elke video met behulp van een event logging software (zie Materials tabel).
- In eerste instantie, definieert het voederen gedrag (bijv. De elementen) in het menu gedrags-klassen van de opnamesoftware. Het voeden gedrag zijn als volgt: (1) proboscis out / contact: de snuit loopt en in contact komt met de oplossing in de microcapillaire buis (2) proboscis out / geen contact: de snuit verlengt en is niet in contact met de oplossing in de microcapillaire buis, (3) slurf opgeborgen: de snuit is niet verlengd, maar in plaats daarvan opgeborgen onder de kop en (4) uit het zicht: de hommel is uit de video frame.
- Stel elk gedragals een 'state' en 'wederzijds uitsluiten' in het menu eigenschappen en maakt continu-opnamen voor een 2 minuten interval. Replay van de video's in slow-motion mode (2 keer langzamer) voor meer precisie.
- De snelheid meten van snuit terugtrekken uit de testoplossing na het eerste contact tussen twee opeenvolgende frames (gescheiden door 37,5 msec in de beeldopnames hier afgebeeld) via een video motion tracking software (zie Materialen tabel).
- Upload de video-bestand en ga naar het frame waar de slurf eerste contacten de oplossing.
- Om de referentie schaal te stellen, selecteert u de regel gereedschap en trek een lijn over de breedte van de microcapillaire buis in de video frame. Klik met de rechtermuisknop op de lijn en selecteer 'kalibreren maatregel ". Voer de breedte van het capillair en het bijbehorende apparaat.
- Selecteer 'Beeld' en vervolgens 'Coördinatensysteem oorsprong'. Op het nieuwe venster klikt u op het puntje van de snuit en selecteer9; Apply '.
- Selecteer de kant gereedschap Verplaatsen, klik met de rechtermuisknop op het puntje van de slurf op de video frame en selecteer 'Track Path'. Ga naar het volgende frame en stel de tracking punt aan het uiteinde van de slurf.
- Klik met de rechtermuisknop op de tracking point en selecteer 'Configuration'. Kies 'Complete Path' en selecteer 'Speed' te meten. Selecteer 'Toepassen'. De snelheid wordt weergegeven.
Resultaten
De nieuwe assay wordt gebruikt voor het voederen reacties testen 1 M sucrose, 1 M sucrose oplossing plus 1 mM kinine en gedeïoniseerd water alleen. De directe voeding reacties op elke behandeling worden bepaald door het kwantificeren van de duur van de snuit contact met de testoplossing, de frequentie van de voeding aanvallen en de snelheid van de snuit terugtrekken weg van de testoplossing na het eerste contact in de 2 min testfase. De verbruikte volume wordt gemeten na de testfase. In deze studie hebben we gekozen voor een aanval criterium interval van 5 sec (figuur 1, zie Hulp File) op basis van eerder werk van de Franse et al. 25, die op 5 sec drempel gebruikt om de slurf terugtrekking gedrag te karakteriseren door Drosophila in reactie op afschrikking verbindingen 25. Zo hebben we bepaald een voeding bout als contactpersoon tussen de verlengde snuit en de oplossing niett onderbroken door de afwezigheid van contacten van 5 seconden of meer.
In vergelijking met sucrose en gedemineraliseerd water alleen, het toevoegen van kinine tot sucrose-oplossing schrikt kennelijk voeden door hommels als ze snel weg zullen verhuizen als zij een aversieve stof (Video figuur 1) op te sporen.
In dit experiment werd de behandelingen een significant effect op de totale duur van de slurf contacten tijdens de testfase (ANOVA op de log-getransformeerde gegevens, F 2,31 = 41, p <0,001). De totale duur van contacttijd met sucrose die kinine wordt aanzienlijk verminderd in vergelijking met alleen sucrose (p <0,001), maar niet aan gedeïoniseerd water alleen (p = 0,219) (Figuur 2). Ook de behandelingen hebben een significant effect op de totale duur van het voeden aanvallen (ANOVA op de log-getransformeerde gegevens, F 2,31 = 27,95, p <0,001, figuur 3A). De totale tijdsduur van het toevoeren periodes met sucrose die kinine wordt aanzienlijk verminderd in vergelijking met alleen sucrose (p <0,001) maar niet in vergelijking met gedeïoniseerd water alleen (p = 0,41). De behandelingen hebben een significant effect op de frequentie van voederen aanvallen (Poisson GLM met een log schakelfunctie, verandering van afwijking ten opzichte van de c 2 verdeling: p <0,050), waarbij het aantal periodes met sucrose die kinine significant hoger in vergelijking met sucrose (p <0,01), maar marginaal significant verschillend het gedeïoniseerde water behandeling (p = 0,055, vanwege een hommel weergeven zeven voeden aanvallen op water, Figuur 3B). Ook de snelheid van snuit terugtrekken verschilt significant tussen de behandelingen (ANOVA op de log-getransformeerde gegevens, F 2,31 = 5,12, p <0,050). Hommels trek de proboscis weg van de testoplossing aanzienlijk sneller na het eerste contact met sucrose die kinine dan met sucrose of gedeïoniseerd water alleen (p <0,050, Figuur 3C). Deze resultaten suggereren dat kinine triggers een actieve vermijdingsgedrag in hommels. De behandelingen hebben een significant effect op de totale verbruikte volume (ANOVA op de log-getransformeerde gegevens, F 2,32 = 62,5, p <0,001), waarbij de consumptie van sucrose die kinine wordt verminderd in vergelijking met sucrose (p <0,001), maar niet aan gedeïoniseerd water (p = 0,457) (figuur 4B). Het volume van de oplossing tijdens de testperiode van de capillaire afgedampt verwaarloosbaar. Bij laboratoriumomstandigheden (25 ± 2 ° C en 28 ± 2% RH), het verdampen varieert tussen 0,033-0,883 gl met gemiddeld 0,276 en 0,171 pl pl van gedeioniseerd water en 1 M sucrose respectievelijk.
In deze assay contacten tussen de antenne en de testoplossing kan niet worden voorkomen. Niettemin is het percentage hommels via hun antennes om de voedingsoplossing tijdens de testfase smaak (sucrose: 46,1% sucrose plus kinine: 60,0% en gedeïoniseerd water: 33,3%) is niet significant verschillend tussen de behandelingen (binomiale GLM, verandering in afwijking ten opzichte van de c 2 verdeling: p = 0,450). Geen effect van de behandelingen op de wachttijd tussen de eerste antennaal contacten en de testoplossing en de eerste contacten van de zuigorganen (mediaan: 2,67 seconden voor sucrose, 1,10 seconden voor sucrose plus kinine, 0,80 seconden voor gedeïoniseerd water, ANOVA op de log-getransformeerde gegevens, F 2,13 = 0.620, p = 0,550). Bovendien is het percentage hommels verlenging van de snuit naar de testoplossing smaak blijft constant over de behandelingen (sucrose: 66,7%; sucrose plus kinine: 50,0% gedeïoniseerd water: 52,2%; binomiale GLM, verandering in afwijkend gedrag ten opzichte van de c 2 verdeling: p = 0,840). Tezamen suggereren deze resultaten dat de antennes spelen een kleine rol bij de detectie van de toxinen in deze test.
Een afzonderlijk experiment onderzoekt of het nodig is om de bijen te testen voor een periode langer dan 2 minuten. De hoeveelheid voedsel geconsumeerd door bijen wordt getest met de 1 M sucrose of 1 mM kinine in 1 M sucrose-oplossingen in twee voorwaarden: a 2 min testperiode en een 10 min testperiode. Voor beide behandelingen, is totale voedselconsumptie niet verschillen van de testperiode en er geen significante interacties optreden tussen de testperiode en behandeling (N = 6-13, ANOVA op de log-getransformeerde gegevens effect van de behandelingen: F = 1,31 54,8, p <0,001, effect van de testperiode: F 1,31 = 0, p = 0,979, effect van de interactie: F = 0,1, p = 0,457). Kortom, een2 min testperiode voldoende om het effect van de oplossing op de totale hoeveelheid geconsumeerd voedsel door hommels en de preventieve effecten van giftige of afstotende stoffen in deze test te evalueren. Dus door het meten van de voedselconsumptie en het testen van voedingsgedrag is het mogelijk correleert totale voedselconsumptie aan de fijne structuur van voeding tijdens de test.
Figuur 1: Wachttijd Perioden tussen de Zuigorganen Contacten tijdens de Eerste 2 Min van het Feeding Assay Density plots van de tijd latentie perioden elkaar te scheiden slurf contact met de 1 M sucrose-oplossing, de 1 M sucrose + 1 mM kinine-oplossing en water.. De cumulatieve gegevens van 13, 10 en 11 bijen worden respectievelijk vertegenwoordigd zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2: Zuigorganen Contact Durations tijdens de Eerste 2 Min van het Feeding Assay Density percelen van de slurf contact duur door hommels voeden met 1 M sucrose, 1 M sucrose + 1 mM kinine of water.. Steekproefgrootte zoals in Figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuigorganen activiteit van Hommels voeden met 1 M sucrose, 1 M sucrose + 1 mM kinine of Water (A) De totale duur van het voeden periodes tijdens de testfase (B) de frequentie van het voeden van aanvallen en (C) de snelheid. van de proboscis retractie na het eerste contact. Letters geeft een significant verschil behandelingen met verschillende letters vertegenwoordigen P <0,05. Boxplots vertegenwoordigen de mediaan (zwarte balken), de laagste en de hoogste data punten nog binnen 1.5 van de interkwartielafstand (snorharen) en de uitschieters (cirkels). Steekproefgrootte zoals in Figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Kinine Onderdrukt voeden door hommels (A) Gescande beelden van de microcapillaire buizen waarin de omvang van de 1 M sucrose of de 1 M sucrose plus 1 mM kinine-oplossing (aangegeven met een zwarte lijn) voor en na de testfase respectievelijk. (B) Het verbruik van 1 M sucrose, 1 M sucrose plus 1 mM kinine of gedemineraliseerd water alleen door hommels na de testfase. Belettering wijst op een significant verschil: behandelingen met verschillende letters geven p <0,001. Boxplots vertegenwoordigen de mediaan (zwarte balken), de laagste en de hoogste data punten nog binnen 1.5 van de interkwartielafstand (snorharen) en de uitschieters (cirkels). Steekproefgrootte zoals in Figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video Figuur 1: Video-opnamen van de Proboscis activiteit in de richting van (A) 1 M sucrose , (B) 1 M sucrose plus 1 mM kinine en (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "target =" _ blank "> Gedeïoniseerd Water tijdens de testfase.
Discussie
Met deze roman gedrags assay, wordt kinine getoond aan het voeden van de buff-tailed hommel af te schrikken. De verminderde slurf contacttijd en voeding bout frequentie met water of de sucrose oplossing doorspekt met kinine wordt hier uitgelegd als een weigering om te starten verder te voeden op non-of voedingsbestanddelen potentieel toxische oplossingen. Wanneer kinine wordt toegevoegd aan 1 M sucrose oplossing, hommels niet alleen vermindering van het volume van de oplossing die zij verbruiken, ze de slurf ook sneller terug te trekken, waardoor de contacttijd tussen de monddelen en de oplossing die een toxine verminderen. Samen vormen deze resultaten suggereren dat kinine wordt waargenomen door de smaak receptor cellen aan de monddelen van de hommel, zoals reeds eerder geïdentificeerd in de honingbij 9. Kinine is een toxine voor insecten die malaise-achtig gedrag induceert in de honingbij 10 en knock-down in de malariamug (Anopheles gambiae) 23. Deze test zou wel leiden tot de identification van enkele afschrikking en potentieel toxische stoffen die door de smaak receptor cellen worden waargenomen op de monddelen van de hommels.
Het is cruciaal voor de microcapillaire buis worden gevuld met een geschikte hoeveelheid testoplossing te duren gedurende de testfase. Het wordt aanbevolen dat ten minste ongeveer driekwart van de microcapillaire buis (bijv 70-80 pi) wordt gevuld. Toch moet erop worden gelet dat niet volledig de microcapillaire buis om het risico van morsen tijdens het proces van scannen verminderen vullen en bevestigen van de microcapillaire buis naar de experimentele apparatuur. Zorg moet ook rekening worden gehouden bij de presentatie van de 500 mM sucrose druppel op de stuntel bij, zodat de experimentator vermijdt lekt de druppel in de wachtbuis.
De 4 mm gat op het puntje van het bedrijf buis is groot genoeg voor een volwassen werknemer hommel op natuurlijke wijze uit te breiden haar slurf in de richting van de testoplossing. Het is echter mogelijk dathommels kan de oplossing met hun antennes proeven voordat een verlenging van hun proboscises. Dit kan invloed hebben op de kans op proboscis extensie zoals PER in hommels kan worden opgewekt door het stimuleren van hun antennes met een suikeroplossing 15. In feite is de antennes van Hymenoptera, zoals de sluipwesp (Trissolcus brochymenae) 24 of de honingbij 13 zijn uitgerust met smaak sensilla, waardoor ze suikers en toxines smaakt kinine. Bijgevolg kunnen de eerste antennaal contacten met oplossingen die sterk afschrikmiddel verbindingen zoals kinine verminderen ook de motivatie van een hommel om zijn slurf uit te breiden en dus van invloed op de experimentele slagingspercentage. Hoewel antennal contact met de testoplossing niet kan worden gecontroleerd, in het huidige onderzoek hebben we geen significant effect van antennal contact op proboscis uitbreiding in de richting van de test oplossing te vinden. Bij deze bepaling van meteen de microcapillaire buis na de pre-testfase wduivin antennes van de hommels "zijn nog steeds binnen de holding buis kan de kans verkleinen de hommels aan de testoplossing met hun antennes te proeven.
De belangrijkste beperking van deze test ontstaat wanneer het bijhouden van de slurf terugtrekken uit de buurt van de testoplossing na het eerste slurf contact met behulp van de motion tracking video software. De videobeelden geeft alleen 2D-beweging van de slurf, zodat de gegeven uitgang van de snelheidsmeting kan onder of over de geschatte. Maar met enkele wijzigingen, kan dit aspect van de assay verbeteren.
Deze test kan worden gebruikt om de natuurlijke afweer voederen oplossingen bevattende verschillende verbindingen waaronder natuurlijk voorkomende plantaardige secundaire metabolieten observeren. Het observeren van de directe voederen reacties met deze test geeft gedetailleerde informatie over hoe hommels detecteren deze verbindingen. Dit is voordelig ten opzichte van bestaande 'go-no go' methoden zoals PER 18,19 En meer dan twee-choice assays 7 omdat deze methode produceert verschillende behavioral respons maatregelen, waaronder voedselconsumptie tijdens een discrete voeden wedstrijd.
Meten meerdere parameters tegelijkertijd zorgt voor een betere beoordeling van de smaak van een verbinding. Bijvoorbeeld in onze test vermijden hommels consumptie van water of de sucrose oplossing doorspekt met kinine. Terugtrekken van de slurf kan worden veroorzaakt door een verandering in de respons van de suiker receptor cellen 12,13. Onze analyse toont aan dat hommels schuif de slurf sneller na contact met de sucrose plus kinine oplossing dan alleen water; dit zou kunnen suggereren dat kinine beïnvloedt een afzonderlijke reeks van neuronen in aanvulling op het remmen van suiker sensing neuronen 9,12,13,25.
Onze analyse laat de analyse van de temporele patroon van gedragsreacties tijdens het voeden. Een soortgelijk protocol, waar de consumptie de tijd en het aantal aanvallen wordt gemeten heeft alklaar om geïmplementeerd om het voederen reactie van Drosophila tot voedzame en niet-voedzame suikers 26 te evalueren. Wij voorspellen dat bijen betrouwbaarder respons op stimulerende voeden in onze assay dan bij andere werkwijzen zoals PER exposeren omdat de bijen zich vrij bewegen in de wachtbuis 21. Deze techniek zal een diepgaande analyse van de smaak drempels mogelijk maken voor nutriënten en giftige stoffen om de mechanismen te verlichten van het voeden in hommels en mogelijk andere bijensoorten.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de Leverhulme Trust subsidie (RPG-2012-708) en een BBSRC subsidie (BB / M00709X / 1) tot GAW.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Controleer de compatibiliteit met videosoftware | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Controleer de compatibiliteit met de computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm lengte, 1 mm binnen Ø & 6 cm lengte, 4 mm binnen Ø; | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm maaswijdte | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
Referenties
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25(2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388(2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667(2015).
Herprints en machtigingen
