Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een protocol wordt gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Voor het starten van experimenten worden verse of bevroren monocyten gedurende 1 week gekweekt in kolven met M-CSF om hun differentiatie in macrofagen te induceren. Vervolgens kunnen de macrofagen worden geoogst en gezaaid in kweekputjes bij vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten. Het gebruik van gedefinieerde aantallen macrofagen in plaats van gedefinieerde aantallen monocyten om macrofaagculturen voor experimenten te starten, levert macrofaagculturen op waarin de gewenste celdichtheid consistenter kan worden bereikt. Het gebruik van cryobewaarde monocyten vermindert de afhankelijkheid van donorbeschikbaarheid en produceert homogenere macrofaagculturen.
Inleiding
Het bestuderen van gekweekte macrofagen is een nuttig model om de functie van deze cellen in ontstekingen te begrijpen, zoals die optreedt in atherosclerotische plaques. Wanneer het onderzoek zich richt op menselijke ziekten waarbij macrofagen betrokken zijn, is het nuttig om primaire menselijke macrofagen te bestuderen in plaats van niet-menselijke macrofagen om soortverschillen te vermijden. Ook kunnen de effecten van celtransformatie worden vermeden door primaire macrofagen te gebruiken in plaats van macrofagencellenlijnen. Voor dit doel dienen macrofagen die gedifferentieerd zijn uit monocyten geïsoleerd uit menselijk bloed, als een manier om primaire menselijke macrofagen te verkrijgen.
Weefselmacrofagen kunnen ofwel resident zijn in weefsels of afkomstig zijn van monocyten die naar het weefsel migreren en differentiëren tot macrofagen 1. Er zijn twee soorten menselijke monocyte-afgeleide macrofagen gedefinieerd die niet alleen verschillen in morfologie, maar ook in genexpressie en celfunctie 2. Deze twee typen worden verkregen uit monocyten die worden gedifferentieerd tot macrofagen in aanwezigheid van M-CSF + foetaal bovien serum (FBS) en monocyten die worden gedifferentieerd tot macrofagen in aanwezigheid van granulocyte-macrofaagkoloniestimulerend factor (GM-CSF) + FBS 2-6. In onze ervaring (ongepubliceerde observatie) genereert het gebruik van menselijk serum in plaats van FBS de GM-CSF-type, ongeacht of M-CSF of GM-CSF in het differentiatiemedium is opgenomen. M-CSF type macrofagen zijn meestal langer dan GM-CSF type macrofagen, die lijken op gebakken eieren in hun morfologie. Onderzoekers moeten zich realiseren dat menselijke M-CSF en GM-CSF monocyte-afgeleide macrofagen niet hetzelfde zijn als de zogenaamde M1 en M2 muis beenmerg-afgeleide macrofagen 6.
Tijdens onderzoek met humane monocyte-afgeleide M-CSF gedifferentieerde macrofagen, ondervonden we moeilijkheden met betrekking tot de beschikbaarheid van monocyten om experimenten te starten en variatie in de verkregen celdichtheden van macrofagen tijdens de differentiatie van monocyten in macrofagen. Om deze problemen te overwinnen, hebben we het volgende protocol ontwikkeld waarin monocyten worden ingevroren totdat ze nodig zijn voor gebruik, en monocyten worden in bulk gedifferentieerd in macrofagen die vervolgens uit kweekkolven kunnen worden verwijderd en ingeplant op gewenste celdichtheden om meer uniforme culturen te verkrijgen van experiment tot experiment.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Leukaferese werd uitgevoerd onder een menselijk onderwerp onderzoeksprotocol door een National Institutes of Health Institutional Review Board goedgekeurd uitgevoerd.
1. Isolatie en cryopreservatie van monocyten
- Verkrijgen mononucleaire cellen door leukaferese van humane donoren en verrijken monocyten door continue tegenstroom centrifugatie elutie van mononucleaire cellen zoals beschreven in de referenties 7,8. Verkrijgen ongeveer 100 x 10 6 cellen elutriated (ongeveer 80 - 90% monocyten) in elutratie buffer die door de fabrikant. Aantal cellen met een hemocytometer.
- Centrifuge monocyten in een 15 ml polypropyleen buis bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in FBS vervolgens dimethylsulfoxide tot een uiteindelijke concentratie van 90% FBS / 10% dimethylsulfoxide en 50 x 10 6 cellen / ml bereiken.
- Voeg elke ml celsuspensie to een individuele cryovial.
- Plaats de cryovials in een cel bevriezen houder en overbrengen naar een -80 ° C vriezer gedurende 24 uur alvorens naar een vloeibare stikstof cryovial opslagtank voor langdurige opslag.
2. Differentiatie van monocyten tot macrofagen
- Dooi een cryovial van de cellen door het snel overbrengen naar een 37 ° C waterbad en dan onmiddellijk te verwijderen wanneer de cel suspensie ongeveer 70% is ontdooid.
- Onmiddellijk na volledig ontdooien bij kamertemperatuur, breng de 1 ml cryovial inhoud in 50 ml 37 ° C opgewarmd Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) en 10% FBS (volledig medium).
- Overdracht 25 ml van monocyten suspensie in elk van twee 75 cm 2 plastic celkweek kolven.
- Incubeer kweken in een 37 ° C celkweek incubator met 5% CO2 / 95% lucht gedurende 48 uur.
- Spoel de cultures 3 maal met 10 ml RPMI 1640 medium (voorverwarmd tot 37 ° C) voorzichtig verwijderen van het kweekmedium te voorkomen loskomen elke losjes verbonden cellen.
- Na spoelen, voeg vers compleet medium, het veranderen medium elke 2 dagen tot monocyten differentiëren en vermenigvuldigen voldoende om confluent worden. Dit vergt ongeveer een week van de cultuur.
3. Oogsten Macrofagen experimenten starten
- Spoel gedifferentieerde macrofagen in kolf 3 maal met 10 ml voorverwarmd 37 ° C Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + voordat 10 ml voorverwarmd 37 ° C 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing.
- Cuvette in celkweek incubator gedurende 10 - 15 min waarna ongeveer 90% van de macrofagen moeten rond en losgemaakt. Verifieer dit door microscopisch onderzoek van de kolf.
- Voeg 10 ml RMPI 1640 medium dat 10% FBS tot stop trypsine.
- Breng de macrofaag celsuspensie uit de kolf in een 50 ml polypropyleen buis, centrifuge 300 xg gedurende 5 min en gooi het supernatant.
- Voorzichtig resuspendeer de macrofagen in 1 ml compleet medium.
- Meng 10 pl macrofaag celsuspensie met 10 pi trypan blauwe oplossing en bepaal macrofaag celaantal en levensvatbaarheid (gewoonlijk> 95%) met een hemocytometer.
- Op basis van het aantal cellen (gewoonlijk ongeveer 15-18 x 10 5 macrofagen), voeg extra compleet medium om de gewenste zaaien celdichtheid bereiken. Opmerking: 1 x 10 5 macrofagen in 1,5 ml medium per putje van een 12-wells plaat zal een bijna-confluente cultuur te produceren.
- Na enten macrofagen incubeer overnacht in een 37 ° C celkweek incubator met 5% CO2 / 95% lucht celhechting mogelijk. Vervolgens beginnen gewenste experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De levensvatbaarheid van vers of gecryopreserveerde monocyten was hoger dan 95%, bepaald met Trypan Blue kleuring 9. Figuur 1 en Figuur 2 vergelijkt bij lagere en hogere vergrotingen, respectievelijk, de voortgang van verse en gecryopreserveerd (dwz bevroren) monocytdifferentiatie tot macrofagen. Merk op dat de verse opzichte van gecryopreserveerde monocyten tonen een subpopulatie differentiëren monocyten die niet ver...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het genereren van gedefinieerde typen macrofaag kan een deel van de tegenstrijdige resultaten verkregen door de onderzoekers bij het bestuderen van macrofaag biologie te verduidelijken. Het gebruik van verschillende kweekomstandigheden en differentiatiefactoren genereren primaire humane macrofagen kan leiden tot zeer verschillende typen macrofaag, een feit dat niet kan worden gewaardeerd door de onderzoeker. Bijvoorbeeld, macrofagen soms gegenereerd uit humane monocyten gebruiken, wordt geen serum, humaan serum alleen, ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het Department of Transfusion Medicine, Clinical Center, National Institutes of Health, leverde elutriated monocyten. Dit werk werd ondersteund door het Intramural Research Program, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | opgewarmd tot 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetaal bovien serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS zonder Ca2+ en Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropyleen conische buis | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blauw | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-verbeterde lichte hemocytometers | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX celvriescontainer | BioCision | BCS-405 | andere vriescontainers zouden ook geschikt moeten zijn voor deze stap |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | elke vloeibare stikstoftank zou geschikt moeten zijn |
Referenties
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
