Methodenartikel

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

DOI:

10.3791/54258

⸱

10 juli 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Inha University, 2Department of Mechanical Engineering, Inha University, 3Biohybrid Systems Research Center (BSRC), Inha University, 4Convergent Research Center for Metabolism and Immunoregulation (CRCMI), Inha University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een kunstmatige lipide dubbellaag of zwarte lipide membraan (BLM), is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van ionkanalen en eiwitinteracties alsook voor biosensor-toepassingen. Echter, conventionele BLM vorming technieken hebben een aantal nadelen en ze vereisen vaak specifieke expertise en tijdrovend proces. Met name de conventionele BLMs last hebben van lage formatie slagingspercentages en inconsistent membraan vorming van de tijd. Hier tonen we een houdbaar en transporteerbaar BLM formatie systeem met een gecontroleerde uitdunnen-out tijd en verbeterde BLM snelheid van vorming door het vervangen van conventioneel gebruikte films (polytetrafluorethyleen, polyoxymethyleen, polystyreen) naar polydimethylsiloxaan (PDMS). In dit experiment wordt een poreuze gestructureerd polymeer zoals PDMS gebruikte dunne. Bovendien, in tegenstelling tot gebruikelijke oplosmiddelen met lage viscositeit, het gebruik van squaleen toegelaten gecontroleerd uitdunnen tijd via slow oplosmiddelabsorptie door PDMS, verlengen membraanlevensduur. in addition, door toepassing van een mengsel van squaleen en hexadecaan, het vriespunt van het lipide-oplossing werd verhoogd (~ 16 ° C) bovendien membraan voorlopers werden geproduceerd die oneindig kan worden opgeslagen en gemakkelijk getransporteerd. Deze membraan voorlopers hebben BLM vorming van <1 uur gereduceerd en behaalde een BLM vorming tarief van ~ 80%. Bovendien ion channel experimenten met gramicidine A toonde de haalbaarheid van het membraan systeem.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kunstmatige lipide dubbellaag membraan of zwarte lipide membraan (BLM), is een belangrijk instrument voor het ophelderen van mechanismen van celmembranen en ionkanalen, alsmede voor het begrijpen van interacties tussen ionen ionenkanalen en / moleculen. 1-7 Hoewel de patch-clamp-methode wordt vaak beschouwd als de gouden standaard voor het celmembraan studies, is bewerkelijk en vereist zeer bekwame operators voor ionkanaal metingen. 8 Terwijl kunstmatig bereide lipide dubbellaag membranen zijn ontstaan ​​als alternatieve instrumenten voor het ionkanaal studies, 9,10 ze worden ook geassocieerd met moeizame processen en specifieke deskundigheid. Bovendien membranen zijn gevoelig voor mechanische storingen. Daarom lipide bilaag technologieën die tot dusver beperkte praktische toepassingen. 11

Om de betrouwbaarheid en duurzaamheid van lipide dubbellaag membranen Costello et al. 12 en Ide en Yanagida verbeteren 13 hebben een vrijstaande lipidedubbellaag ondersteund door hydrogels bedacht. Ondanks de verbeterde levensduur echter (<24 uur), werd dubbellaag robuustheid niet verbeterd. Jeon et al. 14 bedacht een hydrogel ingekapseld membraan (HEM) met intieme hydrogel-lipide bilaag contact, wat resulteert in verhoogde levensduur (tot enkele dagen). Om de levensduur van de HEM verder te verhogen, Malmstadt en Jeon et al. Creëerde een hydrogel ingekapseld membraan met hydrogel-lipidebindende via in-situ covalente conjugatie (cgHEM). 15 In beide systemen membraan levensduur aanzienlijk verhoogd (> ​​10 dagen) . De membraanvorming systemen niet voldoende robuust en kan niet worden opgeslagen of afgeleverd indien vereist deskundigheid vrij die door het gebruik van de lipide bilagen.

De ontwikkeling van een lipide bilaag platform is vooral draaide om het verhogen van de robuustheid en de levensduur van BLMs. Hoewel de levensduur van BLMs is substantially verbeterde recent zijn de toepassingen beperkt door een gebrek transporteerbaarheid en houdbaarheid. Om deze problemen te overwinnen, Jeon et al. Creëerde een houdbare membraan systeem en introduceerde een membraan precursor (MP). 16 Om een MP bouwen, bereidden zij een mengsel van n- decaan en hexadecaan die 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) van het vriespunt van de lipideoplossing zodat het zou bevriezen bij ~ 14 ° C (beneden kamertemperatuur, typisch boven koelkasttemperatuur) regelen. In dit experiment werd de MP verdeeld over een kleine opening op een polytetrafluorethyleen (PTFE) film en vervolgens in een koelkast bij 4 ° C bevroren. Wanneer de MP tot kamertemperatuur werd gebracht, de MP ontdooid en een lipide bilaag werd automatisch gevormd, waardoor de deskundigheid doorgaans geassocieerd met membraanvorming. Echter, het slagingspercentage van BLM gemaakt van de MP was zo laag als ~ 27%, en het membraan formation keer was inconsistent (30 min tot 24 uur), de praktische toepassingen ervan te beperken.

In deze studie wordt een polydimethylsiloxaan (PDMS) dunne film gebruikt in plaats van een conventionele hydrofobe dunne films (PTFE, polyoxymethyleen, polystyreen) tot (a) controle fabricagetijd en (b) verhogen de slaagkans van BLM formatie eerder door Ryu gemeld et al. 17 Hierin membraanvorming werd vergemakkelijkt door extractie van oplosmiddelen door de poreuze aard van PDMS en de benodigde tijd voor membraanvorming werd succesvol gecontroleerd in deze studie. In dit systeem, omdat de lipideoplossing werd geabsorbeerd in de dunne PDMS film, werd een consistente membraanvorming tijd bereikt. Bovendien werd membraanlevensduur verlengd door langzame absorptie van oplosmiddelen in het PDMS dunne film, een gevolg van de toevoeging van squaleen aan de lipideoplossing. Voerden we optische en elektrische metingen te controleren of membranen gevormd onder toepassing van deze techniek zijn geschikt voor iop kanalen studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oplossing Voorbereiding

  1. Bereiding bufferoplossing:
    1. Om bufferoplossing formuleren, oplossen 1 M KCl (kaliumchloride), 10 mM Tris-HCl (tris-hydrochloride), en 1 mM EDTA (Ethyleendeniaminetetraacetaat) in gedestilleerd water en de pH instellen op 8,0.
    2. Filter de oplossing om met een 0,20 pm filter. Te steriliseren, autoclaveren de oplossing bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
  2. Bereiding van lipide-oplossing voor pre-painting:
    1. De lipideoplossing voor pre-painting formuleren oplossen 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) lipide (w: v) in een mengsel van 2: 8 n decaan en hexadecaan (v: v). Roer 's nachts met behulp van een rotator.
  3. Bereiding van lipide oplossing membraanvorming:
    1. De lipideoplossing voor membraanvorming formuleren oplossen 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) lipide (w: v) in een mengsel van 2: 8 squalene en hexadecaan (v: v). Roer 's nachts met behulp van een rotator.

2. Vorming van een PDMS Thin Film

  1. Meng PDMS en uithardingsmiddel in een 9: 1 (w / w) verhouding in een mengkom de PDMS prepolymeer. Voeg 5 g PDMS prepolymeer een petrischaal het PDMS vormen dunne film (dikte 200-250 pm). Spread PDMS prepolymeer met behulp van een spin coater bij 800 rpm gedurende 10 seconden om een ​​dunne film te vormen.
  2. Plaats de petrischaal in een vacuümexsiccator bij een druk van 100 mTorr gedurende 2 uur om luchtbellen te verwijderen. Het prepolymeer dunne film, bak polymeriseren in een oven gedurende 5 uur bij 70 ° C.
  3. Om een vierkant PDMS dunne film te maken, stuurde de gepolymeriseerde PDMS dunne folie in 2 x 2 cm 2 vierkantjes. Gebruik een 500 urn micro punch om een ​​opening te maken in het midden van het PDMS dunne film. Voorstrijkverf openingen met 3% DPhPC lipideoplossing gemengd in 2: 8 n- decaan en hexadecaan.

3. Kamer Fabrication en Assembly

  1. Om de BLM kamer fabriceren, ontwerp twee symmetrische blokken van de kamer met behulp van 3D tekensoftware met buitenafmetingen van 4 cm x 1,5 cm x 1 cm en innerlijke goed afmetingen van 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
  2. Craft de kamer met behulp van een PTFE-blok met een CNC-machine en volg de instructies van de fabrikant.

4. Kamer Assembly

  1. De kamer monteren, plaatst de voorgelakte-PDMS dunne film tussen de twee PTFE blokken zodanig dat de opening aan het PDMS dunne film wordt aangesloten aan de opening in de kamer.
  2. Sluit de buitenste randen van de tank af met een cover glas met vet (het faciliteren van optische waarneming). Immobiliseer de geassembleerde kamer met behulp van bouten en moeren.
    LET OP: Zorg ervoor dat de kamer wordt goed afgesloten, zodat er geen vloeistof lekken.

5. Vorming van Membrane Voorloper met Versnelde Zelfassemblage Formation (MPES)

  1. Met behulp van een pipet, stort 0,5gl 0,1% DPhPC lipide gemengd in 2: 8 n decaan: hexadecaan op de opening van de PDMS dunne film geassembleerd met de kamer.
  2. Voor gebruik opslaan van de kamer in een vriezer of koelkast beneden 10 ° C.

6. Membraan Formation and Verification

  1. Om een ​​BLM met MPES vormen, trekken de kamer uit de koelkast en op te schorten 2 ml buffer oplossing in elke kant van de kamer. Zet de kamer gereserveerd voor <10 min, totdat het bevroren membraan voorloper ontdooit.
  2. Plaats de kamer op een micromanipulator om de hoogte nauwkeurig te regelen ten opzichte van de lichtbron en de microscoop. Verlicht één zijde van de kamer als een lichtbron met een halogeen vezeloptische illuminator de opening van de PDMS dunne film voor optische waarneming van BLM vormingsproces helderen.
  3. Anderzijds plaatst een digitale microscoop verticaal ten opzichte van de lichtbron BLM vorming observeren (20 maal vergroten0X).
  4. Om BLM vorming bevestigen acht het midden van de opening waar de kleur helderder dan de ring.

7. Elektrische Recording

  1. Voor elektrische metingen, voor te bereiden Ag / Cl elektroden met behulp van een 208 urn dikke zilverdraad en bleekmiddel in natriumhypochloriet gedurende> 1 min. Plaats de Ag / Cl elektroden in elke zijde van de kamer diep genoeg te dompelen in de bufferoplossing.
  2. Sluit de elektroden aan op de micro-elektrode versterker. Met behulp van elektrofysiologie software, breng dan een ± 10 mV driehoekige golfvorm over het membraan om een ​​blokgolf te verwerven. Stel het toepassen van spanning door te klikken op de op V_clamp (mV) pijlen.
  3. Noteer de elektrische eigenschappen van het membraan door te klikken op de knop record (rode stip icoon). Ga door met opnemen totdat een uniforme vierkante golf wordt waargenomen. Stoppen met de opname door te klikken op de zwarte vierkante pictogram.

8. Ion Channel Incorporation

NIETE: Gramicidin A (gA) opneming gebeurt spontaan bij vorming van BLM, zoals gA rechtstreeks wordt toegevoegd aan de lipideoplossing.

  1. Om gA channel activiteiten te observeren, toe te passen 100 mV over het membraan met een frequentie van 5 kHz te meten met het potentieel van het membraan. Stel het toepassen van spanning door te klikken op de op V_clamp (mV) pijlen.
  2. Noteer de elektrische eigenschappen van de GA-opneming van informatie door te klikken op de knop record (rode stip icoon). Ga verder het opnemen totdat het huidige sprongen wordt waargenomen. Stoppen met de opname door te klikken op de zwarte vierkante pictogram.
  3. Na elektrische data-acquisitie, filteren de gegevens met een lage-pass Bessel-filter bij 100 Hz met behulp van een elektrofysiologie software.
  4. Let op de huidige sprongen in de gefilterde houdt potentiële data (elke huidige sprong, ~ 0,15 NS, vertegenwoordigt dimerisatie van een gA ionkanaal) naar gA opname te controleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimalisatie van MPES Solution Samenstelling
Verschillende samenstellingen van lipiden en oplosmiddelen werden getest met succes reconstitueren lipide bilaag membranen van MPES. Het MP systeem met een mengsel van n- decaan en hexadecaan met 3% DPhPC 14 vertoonde een lage membraanvorming (~ 27%) succes. Bovendien, als de PDMS film continu geëxtraheerd lipideoplossing, was het noodzakelijk om oplosmiddelsamenstelling een intact lipide dubbellaag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze BLM-vormingstechniek biedt een krachtig hulpmiddel voor celmembraan- en ionkanaalstudies, in tegenstelling tot conventionele technieken die een beperkt potentieel voor industrieel gebruik hebben. We ontwikkelden een membraanvoorloper met behulp van een PDMS-dunne film en bedachten een bevroren membraanvoorloper met versnelde zelfsamenstelling.

In tegenstelling tot conventionele membraanvormingsmethoden met hydrofobe films, waar membraanvorming alleen plaatsvindt via oppervlakte-interactie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) en National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) van de National Research Foundation of Korea. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Inha University Research Grant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
KaliumchlorideSigma-AldrichP9333Voor bufferoplossing
Tris-hydrochlorideSigma-Aldrich1185-53-1Voor bufferoplossing
EthyleendiaminetetraazijnzuurSigma-Aldrich60-00-4Voor bufferoplossing
n-decaanSigma-Aldrich44074-UVoor lipide-oplossing
HexadecaanSigma-Aldrich544-76-3Voor lipide-oplossing
SqualeenSigma-AldrichS3626Voor lipide-oplossing
Gramicidine ASigma-Aldrich11029-61-1Membraaneiwit
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholineAvanti Polar Lipids, Inc.850356Voor membraanvorming
Sylgard 184a en 184b elastromeerkitDow Corning AsiaVoor het produceren van een PDMS-dunne film
0,2 μm filterSatorius stedim16534----------KOm bufferoplossing te filteren
RotatorFinePCRAGOm lipide homogeen op te lossen
AutoclaafBiofreeBF-60ACOm bufferoplossing te steriliseren
Spin coaterShinu MstSP-60POm PDMS-prepolymer te verspreiden
VacuumdessiccatorWelch2042-22Om luchtbellen in PDMS-prepolymer te verwijderen
500 μm  ponsHarris Uni-Core0,5Om een opening in de PDMS-dunne film te maken
CNC-machineSME tradingSME 2518Om de kamer voor membraanvorming te fabriceren
Halogeenvezeloptisch verlichtingsmiddelMoticMLC-150COm de opening van de PDMS-dunne film te verlichten voor optische observatie
Digitaal microscoopDigital blueQX-5Om de vorming van lipide-dubbellaagmembranen optisch te observeren
ElektrodeA-M SystemsOm membraanvorming elektrisch te observeren
Micro-elektrode versterker (Axopatch versterker)Axon InstrumentsAxopatch 200B VersterkerOm de capaciteit van het membraan te meten (beschreven als micro-elektrode versterker in het manuscript)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
  2. Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
  3. Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
  4. Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
  5. Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
  6. Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
  7. Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
  8. Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
  10. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
  11. Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
  12. Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
  13. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
  14. Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
  15. Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
  16. Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
  17. Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
  18. Yaws, C. Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).
  19. Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , Merck & Co. (1976).
  20. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer Science & Business Media. (1986).
  21. Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
  22. Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
  23. Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vorming van lipide dubbellagenzwarte lipide membraangeautomatiseerde membraanassemblagesqualeen hexadecaanmengselincorporatie van gramicidine Aelektrofysiologische metingbereiding van PDMS filmbereiding van bufferoplossingprotocol voor kamerassemblage

Gerelateerde artikelen