We hebben cellen verzameld, gekleurd en afbeeldingen gemaakt van de conjunctiva van de binnenrand van het ooglid van menselijke proefpersonen. Door celmorfologie en metabolische activiteit te karakteriseren, kan deze methode ons begrip van droge ogen en de rol die wrijving tussen de oculaire oppervlakken kan spelen bij het waarnemen van oculaire ongemakken, verder verdiepen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Impressie Cytologie van het deksel Wiper Area
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er bestaan weinig rapporten over de cellulaire anatomie van het lid wiper (LW) gebied van de binnenkant van het ooglid en slechts één rapport maakt gebruik van cytologische methoden. De optimalisatie van een methode voor het verzamelen, kleuren en afbeelden van cellen uit het LW-gebied met behulp van impressiecytologie (IC) wordt in deze studie beschreven. Cellen worden verzameld vanaf het binnenoppervlak van het bovenste ooglid van menselijke proefpersonen met behulp van hydrofiele polytetrafluorethyleen (PTFE) membranen, en gekleurd met cytologische kleurstoffen om de aanwezigheid van bekercellen, mucinen, celkernen en verschillende graden van pre- en parakeratinisering te onthullen. Immunocytochemische kleurstoffen tonen cellulaire esterase-activiteit en beschadigde celmembranen door het gebruik van een confocale scanlasermicroscoop. Tot 100 microscopische digitale beelden worden vastgelegd voor elke steekproef en samengevoegd tot een hoogwaardig, grootschalig beeld van de volledige IC-span. We demonstreren een hogere gevoeligheid van IC dan eerder gerapporteerd, geschikt voor het identificeren van cellulaire morfologieën en metabolische activiteit in het LW-gebied. Voor zover wij weten, is dit de eerste keer dat deze selectie van fluorescente kleurstoffen werd gebruikt om LW IC-membranen af te beelden. Dit protocol zal effectief zijn in toekomstige studies om ongedocumenteerde details van het LW-gebied te onthullen, zoals het beoordelen van cellulaire particulariteiten van contactlensdragers of patiënten met droge ogen of lid wiper epitheliopathie.
Inleiding
De menselijke bovenste ooglid voert ongeveer 10.000 knippert elke dag 1, met slechts een 1-2 mm smalle conjunctivale regio tegen de oogbol. Door het wissen beweging tijdens het knipperen, is dit gedeelte van het ooglid is genoemd het "deksel wiper" gebied 2. Aangenomen wordt dat de wrijving tijdens gewone knipperend in dit gebied verhoogd, door het deksel vegen over de hele wereld. Dit kan een belangrijke rol spelen bij oculaire comfortabel. Contactlensdragers met name ervaring oculair ongemak en dit is een van de belangrijkste redenen voor stopzetting van de lens te dragen 3. Wanneer een contactlens geplaatst op het oog, is de wrijvingscoëfficiënt tussen het lensmateriaal en het oogoppervlak aangetoond veranderen 4. Er zijn aanwijzingen dat de droogte de symptomen kunnen worden gerelateerd aan deze veranderde wrijving 2,5,6.
Deze vereniging kan ook tot uiting komen in klinisch waarneembare verschijnselen, met name deksel wiper epitheliopathie (LWE), ook wel bovenste ooglid marge kleuring (ULMS) 6. LWE is een vroeg teken van oogirritatie en een potentiële voorspeller voor droge oogziekte. Opgemerkt wordt gemeten en de vitale kleuring van de bovenste en onderste ondermargegebieden deksel. Hoewel dit beoordelingssysteem 2 en de klinische geldigheid (dat wil zeggen, correlatie met subjectieve symptomen) zijn nog in discussie, oculair ongemak blijft een raadsel voor zowel clinici en wetenschappers en, belangrijker nog, een ongemak voor de patiënten.
Tot op heden is er weinig bekend over klinisch relevante verschillen in de (sub-) cellulaire anatomie en fysiologie van het deksel ruitenwisser gebied 7 en slechts één rapport maakt gebruik van cytologisch methoden 8. Indruk cytologie (IC) is gebruikt meer dan 40 jaar om cellen te verzamelen van het epitheliale oppervlak van de bulbaire conjunctiva of tarsale door toepassing van een membraan 9,10. Na verwijdering van de hechtende cellen ondergaan cytological kleuring en microscopische beeldvorming. Door de anatomische en cellulaire verschillen in het deksel ruitenwisser regio, deze techniek vereist optimalisatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek statement: Voorafgaand aan het verzamelen van cellen van menselijke proefpersonen, informed consent en ethiek toestemming moet worden verkregen.
1. Bereid Stain
OPMERKING: Bereid vlek op de dag van het experiment.
- Voeg 5 ul Ethidium (of 4 uM) en 5 gl calceïne AM (of 4 pM) aan 2,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in 15 ml centrifugebuis; mengen. Wikkel in aluminiumfolie af te schermen tegen licht en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik.
2. Collect Cells
- Verwijder celkweek inserts uit hun verpakking en label voor elke ooglid te bemonsteren. Mark oriëntatie van de cel collectie op de zijkant van het membraan plastic houder met behulp van permanent marker. Conduct spleet lamp inzage bij matige vergroting (ongeveer 20X) passende gezondheid van de regio om IC te ondergaan bevestigen.
- Verdeel één druppel plaatselijke verdoving (0,5% proparacaine hydrochloride) in de lagere conjunctivale zak van each oog en instrueren deelnemer aan de ogen gesloten te houden gedurende één minuut.
- Evert bovenste ooglid en plaats te houden door de wimpers; vermijd contact met het deksel ruitenwisser omgeving.
Optioneel: de hulp van een tweede onderzoeker kan nodig zijn om deze stap uit te voeren. - Toepassen membraan loodrecht op het midden van het deksel wisser regio minimale druk.
- Houd membraan in de plaats voor 3-5 sec. Let op het membraan doorzichtig geworden in het contactvlak. Op dit punt, verwijder voorzichtig het membraan en toestaan dat het deksel van de deelnemer op "flip" terug op zijn plaats.
- Onmiddellijk breng een druppel PBS aan het monster om het uitdrogen. Doorzichtig membraan draaien en niet ondoorzichtig te allen tijde, omdat dit droogtoestel aangegeven. Laat de secundaire onderzoeker gaan onmiddellijk met de verwerking van de monsters (deel 3).
- Gedrag laatste eye controle om de integriteit van het bindvlies te waarborgen. Verdeel oculaire smeermiddelen en instrueren deelnemerom te voorkomen dat wrijven hun ogen tot verdovend effect uitgewerkt (ong. 15 min).
3. Sample Processing
- Met behulp van micro-schaar, snijden het membraan in half (één helft voor elk van de stroomafwaartse analyses), loodrecht door het midden van de cel collectie. Snijd langs de buitenrand van een halve membraan te scheiden van de plastic houder; vermijd interactie met de verzamelde cellen op het membraan, waarbij gezorgd dat het membraan niet vouwen op zichzelf.
- Beveilig het membraan met een pincet voordat volledig los uit de houder. Plaats membraan in gelabelde 2 ml centrifugebuis die 500 pl 95% (v / v) ethanol en laat vaststellen voor minstens 20 minuten tot maximaal 2 uur vóór de verwerking (4.2).
- Onmiddellijk apart tweede helft van membraan (zoals beschreven in paragraaf 3.2) en onmiddellijk doorgaan met paragraaf 4.1.
4. De steekproef kleuring
- Immunocytochemical kleuring
- Plaats membraan voorzichtig in 35 mm glazen bodem cultuur schotel met een collectie omlaag; zorgen voor membraan is plat.
- Pipetteer 20 ul van immunocytochemische beitssamenstelling geassembleerd in deel 1 op het membraan. Als monster krullen omhoog, wegwerp pipet tips om zorgvuldig af te vlakken het membraan door op de randen naar beneden. contact met een mobiele collectie gebieden te voorkomen.
- Voorzichtig bedekken het membraan met glazen afdekplaat slip. Vermijd onnodige beweging van het monster. Sluit de schaal met deksel en afdichting met een lab-film rond de randen. Heeft transparantie van de schotel (boven en onder) en de zichtbaarheid van het monster niet in de weg. Label met labo marker.
- Meteen doorgaan met beeldvorming (paragraaf 5.1), dan terug te vinden in hoofdstuk 4.2 door te gaan met cytologisch kleuring van de andere helft van het membraan.
- cytologisch kleuring
- Geleidelijk hydrateren membraan door het langzaam toevoegen van 500 gl gedestilleerd water aan de buis Used voor bevestiging in paragraaf 3.4. Zuig de inhoud meerdere malen in de pipet tip om te mixen en verwijder de inhoud.
- Voeg 500 ul gedestilleerd water. Laten staan voor een paar seconden, dan verwijderen. Voeg 500 ul van Alcian Blue kleuring en laat gedurende 3 min. Verwijder vlekken en het uitvoeren van 3 opeenvolgende 500 pi gedestilleerd water gespoeld, of tot vloeistof spoelt duidelijk.
- Voeg 500 gl hematoxyline # 1 vlek en laat gedurende 3 min. Verwijder vlekken en het uitvoeren van drie opeenvolgende 500 pl gedestilleerd water gespoeld, of tot vloeistof spoelt duidelijk. Dehydrateren (achterzijde van paragraaf 4.2.1) door opzuigen van de heldere vloeistof.
- Voeg 500 ul van Papanicolaou OG-6 vlek en laat gedurende 3 min. Verwijderen vlekken en voer een 500 pl 95% (v / v) ethanol spoeling.
- Voeg 500 ul van Papanicolaou EA-65 vlek en laat gedurende 3 min. Verwijderen vlek en uitvoeren 3 opeenvolgende 500 pl 95% (v / v) ethanol spoelingen.
- Volledig drogen met behulp van drie opeenvolgende 500 pi 100% ethanol spoelingen. Met behulp van TWEezers, verwijder het monster uit de oplossing; vermijd het aanraken cel collectie gebieden.
- Plaats membraan op glasplaatje; ervoor te zorgen dat de cel collectie lijn ofwel parallel of loodrecht op de marge te schuiven voor een betere afstemming tijdens de beeldvorming.
- Breng een druppel van 100% ethanol en afdekken met glas slip. Meteen doorgaan met beeldvorming (paragraaf 5.2).
5. Sample Imaging
- Imaging Fluorescent Immunocytochemisch Stains
- Gebruik een confocale laser scanning microscoop (CLSM) 11 of fluorescentiemicroscoop 12, uitgerust met een digitale kleuren camera, aangesloten op een computer met een afbeelding acquisitie software. Door de monsters zijn opgenomen in kweekschalen, kan een omgekeerde microscoop nodig.
- Opgericht 11,12 Microscoop volgens absorptie- en emissiespectra van ethidium homodimeer-1 (528/617 nm Ex / Em maxima in de aanwezigheid van DNA) en calceïne AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Selecteer laagste vergroting van de microscoop (bijv 2.5x objectieve) en de digitale imaging-systeem te activeren; observeren van het monster wordt weergegeven op het computerscherm.
- Inspecteer monster voor cellulaire kenmerken van belang.
- Selecteer de gewenste microscoop vergroting en beelden verwerven met behulp van beeldbewerkingssoftware.
- Bestanden opslaan in een van beide inheemse microscoop bestandsformaat of een niet-gecomprimeerd bestandsformaat (bijvoorbeeld * .raw, * .tiff).
- Imaging cytologische Stains
- Gebruik een standaard laboratorium bright-field microscoop met geen filters, uitgerust met een digitale kleuren camera, aangesloten op een computer met een afbeelding acquisitie software.
- Plaats en glasplaatje lock (uit stap 4.2.8) op de microscoop podium. Rehydrateren monster met 100% ethanol zoals nodig tijdens de gehele beeldvormingsprocedure.
- Selecteer laagste vergroting van de microscoop (bijv 2.5x objectieve) en e activerene digital imaging-systeem; observeren van het monster wordt weergegeven op het computerscherm.
- Zorg ervoor dat de cel collectie is uitgelijnd met hetzij X of Y-as van de microscoop podium controle. Pas indien nodig, door het verwijderen van het deksel slip en het draaien van het monster met behulp van een pipet tip of een pincet.
- Het gebruik van de afbeelding (en) vast te leggen van het gehele monster met het laagste microscoop vergroting imaging software.
- Overschakelen naar matig microscoop vergroting (bv 10 - 20X objectief) en stel microscoop lichtbron en software imaging parameters (belichting, contrast, witbalans, enz.), En hun geautomatiseerde software metering uit te schakelen. Deze instellingen opslaan voor later gebruik.
- Bepaal de begin- en eindpunten van de scan (bijvoorbeeld, linksboven en rechtsonder hoeken van cel collectie).
- Het gebruik van de afbeelding (en) vast te leggen van de gehele cel collectie gebied binnen het start- en eindpunt imaging software. Zorg voor een 20% side-to-side en top-to-bottom overlap betwEen alle aangrenzende foto's.
- Bestanden opslaan met behulp van de inheemse microscoop bestandsformaat of een niet-gecomprimeerd bestandsformaat (bijvoorbeeld * .raw, * .tiff).
- Genereer image laatste panoramisch met behulp van geautomatiseerde stitching software naar keuze (bijvoorbeeld Adobe Photoshop Elements). Referentiebeelden gebruiken die bij stap 5.2.5) om de nauwkeurigheid van de geautomatiseerde stiksel bevestigen in het uiteindelijke beeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De celkweek membraan overspannen over de plastic houder is een handig hulpmiddel voor handheld verzameling van epitheelcellen van het deksel ruitenwisser bindvlies. Deze werkwijze elimineert de behoefte aan extra gesteriliseerde instrumenten juist gebruikt voor het bereiden en verwerken IC membranen. Figuur 1 toont de IC van het deksel wisser gebied met een celkweek insert. We geoptimaliseerd twee verschillende kleuringsprotocollen die elkaar aanvullen om epitheelcellen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Impression cytologie wordt typisch uitgevoerd op de bulbaire conjunctiva, die gemengde cellulose-ester membranen. Monsters worden op maat gesneden van bulkmateriaal bladen gesteriliseerd, aangebracht en verwijderd uit de conjunctivale oppervlak met behulp van een tang. Met dezelfde membraanmateriaal werd een piston IC apparaat onlangs ontworpen om de oppervlakte geometrie van de bulbaire conjunctiva passen en constant hoge druk tussen 13 toepassingen. Deze benaderingen zijn inefficiënt voor de smalle, gebogen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante financiering of belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We willen onze collega Dr. Jalaiah Varikooty bedanken die inzicht en expertise verschafte over het onderwerp van de dekselveger, wat deze onderzoek sterk heeft geholpen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue, 1% in 3% Azijnzuur | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylinen, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou-kleuring, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou-kleuring, Gemodificeerd EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Levensvatbaarheid/Cytotoxiciteit Kit | Life Technologies | L-3224 | bevat ethidium homodimer-1 en Calcein AM kleurstoffen |
| Alcaine (0,5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Celcultuur Inzet, 12 mm, hydrofiel PTFE, 0,4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bodem Schalen | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referenties
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
