Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54262

⸱

17 juli 2016

 ,  ,  ,  , 
1INSERM U1051, Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier, 2Université de Nîmes, 3CNRS, IES, UMR 5214, 4Aix-Marseille Université, CNRS, École Centrale Marseille, Institut Fresnel, UMR 7249, 5Montpellier RIO Imaging (MRI)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Samenvatting

Laser scanning microscopen combineren van een femtoseconde Ti: saffier laser en een optische parametrische oscillator (OPO) om de laser lijn te dupliceren zijn beschikbaar voor biologen geworden. Deze systemen zijn voornamelijk ontworpen voor multi-channel twee-foton fluorescentiemicroscopie. Echter, zonder enige wijziging, aanvullende non-lineaire optische microscopie, zoals de tweede-harmonische generatie (SHG) of derde harmonische generatie (THG) kan ook worden uitgevoerd met deze set-up, waardoor label-free imaging van gestructureerde moleculen of waterige middellange lipide interfaces. Deze technieken zijn zeer geschikt voor in-vivo observatie, maar zijn beperkt chemische specificiteit. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent trillingen signalen op basis van Raman scattering. Confocale Raman microscopie biedt 3D-ruimtelijke resolutie, maar het vereist een hoge gemiddelde vermogen en lange acquisitie tijd. Om deze problemen op te lossen, hebben recente ontwikkelingen in lasertechnologie de ont toegestaanwikkeling van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopie Daarom heeft ontpopt als een krachtig instrument voor biologische en live cell imaging, door het chemisch mapping lipiden (via CH stretch trillingen), water (via OH stretch trillingen), eiwitten of DNA. In dit werk beschrijven we de uitvoering van de CARS-techniek op een standaard-OPO gekoppeld multiphoton laser scanning microscoop. Het is gebaseerd op de in-tijdsynchronisatie van de twee laserlijnen door de lengte van een van de laserstraal pad. Wij presenteren een stap-voor-stap uitvoering van deze techniek op een bestaande multiphoton systeem. Een eenvoudige achtergrond in experimentele optiek is behulpzaam en de gepresenteerde systeem vereist geen dure aanvullende apparatuur. We tonen ook CARS afbeelden opgehaald op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we zien dat deze beeldvorming gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaardtwo-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.

Inleiding

Optische microscopie is een belangrijke techniek voor destructieve visualisatie van dynamische processen in levende biologische systemen met een subcellulaire resolutie. Fluorescentiemicroscopie is momenteel de meest populaire imaging contrast gebruikt in levende cellen door zijn hoge specificiteit en gevoeligheid 1. Een groot palet van fluorescerende probes is ontstaan ​​(exogene kleurstoffen, genetisch gecodeerde eiwitten, halfgeleider nanodeeltjes). Verschillende sample belichting fluorescerende gebaseerde technieken bloeide (zoals confocale of twee-foton microscopie) voor 3D beeldvorming uit te voeren en een grootste nadeel van deze techniek is fotobleken 2 verminderen. Andere beperkingen zijn de verplichting fluorofoor labeling aangezien de meeste moleculaire soorten niet intrinsiek fluorescerend en bijgevolg worden fluoroforen moeten kunstmatig worden geïntroduceerd in de afgebeelde monster. Deze kunstmatige manipulatie kan in het bijzonder storend zijn voor kleine moleculen of induceert pottiële foto-toxiciteit. Deze redenen maken fluorescentiemicroscopie niet goed geschikt voor in-vivo observaties. Derhalve wordt de toepassing van optische beeldvorming met een hoge gevoeligheid en specifieke moleculaire contrasten zonder gebruik van fluorescerende moleculen in biomedische wetenschap zeer wenselijk.

Verschillende niet-lineaire optische beeldvorming zonder etikettering of vlekken ontstaan, met inbegrip van de tweede-harmonische generatie (SHG) 3,4 en derde-harmonische generatie (THG) 5. SHG microscopie werd gebruikt om het structurele regeling op supramoleculaire niveau zoals microtubuli of collageen 6. THG wordt opgewekt uit optische heterogeniteiten als interface tussen een waterig medium en lipiden 7. THG werd ook aangetoond dat het myeline 8,9. Beide technieken kunnen worden uitgevoerd op een twee-foton fluorescentiemicroscoop en vereisen slechts een laserstraal. Maar ze vereisen een hoog vermogen laser-intensiteit (doorgaans 50mW bij 860 nm voor SHG 10, 25 - 50 mW bij 1180 nm voor THG 9), die schadelijk is in levende monsters, en voorzien niet in de chemische specificiteit die nodig is om op ondubbelzinnige wijze het specifieke biologische structuren.

Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent vibratiespectroscopie signalen op basis van Raman scattering. Wanneer een lichtstraal raakt Overigens kan fotonen worden geabsorbeerd en verstrooid door atomen of moleculen. De meeste van de verstrooide fotonen wordt dezelfde energie, dat wil zeggen, frequentie als de invallende fotonen. Dit proces heet Rayleigh verstrooiing. Echter een klein aantal fotonen verstrooid op een optische frequentie verschillend van de frequentie van de invallende fotonen, dwz een inelastische verstrooiing genoemd Raman verstrooiing. Het verschil in energie is afkomstig van excitatie van vibrationele modes afhankelijk van de moleculaire structuur en milieu. Daarom spontane Raman scattering provides chemisch selectieve beeldvorming als verschillende moleculen hebben specifieke trillingsfrequenties. Het is echter beperkt vanwege de extreem zwak signaal. Confocale Raman microscopie ontwikkeld en biedt 3D ruimtelijke resolutie, maar vereist hoog gemiddeld vermogen en lange acquisitietijd 11. Om deze moeilijkheden te overwinnen, recente ontwikkelingen in de lasertechnologie hebben toegelaten dat de opkomst van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) 11,12,13.

CARS is een derde-orde niet-lineaire optische proces. Drie laserstralen, bestaande uit een pompbundel bij frequentie ω P, een Stokes straal bij frequentie ω S en een testbundel (meestal zijn de pomp) gericht in een monster en het genereren van een anti-Stokes straal bij frequentie ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. De anti-Stokes signaal kan aanzienlijk worden versterkt wanneer het frequentieverschiltussen de pomp en de Stokes balken is afgestemd op een Raman vibratiespectroscopie Ω = R (ω P - ω S). CARS signaal op basis van meerdere fotonen interactie. Het genereert dan ook een coherent signaal ordes van grootte sterker dan spontane Raman scattering.

CARS microscopie werd eerst experimenteel aangetoond door Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Verbeterde vervolgens de techniek door twee gerichte nabij-infrarood femtoseconde laserbundels met een objectieflens van een hoge numerieke apertuur, waardoor de phase matching voorwaarde CARS en worden de twee-foton niet-resonante 16 achtergrond. CARS microscopy heeft daarom ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor in levende cellen en weefsels imaging, door chemische detecteren moleculen zoals lipiden (via CH strekvibratie) 17,18, water (via OH rek trillingen), eiwitten, DNA in levende cellen 19,20 maar ook gedeutereerde chemische verbindings voor de farmaceutische en cosmetische toepassingen 21 22.

De belangrijkste beperking van lineaire microscopie afkomstig van de complexiteit en de kosten van de optische bronnen. Een CARS systeem vereist twee golflengte afstembare lasers met korte puls duur en met tijd en ruimte gesynchroniseerde puls treinen. Vroege CARS microscopen waren gebaseerd op twee gesynchroniseerde picoseconde Ti: saffier lasers 20. CARS imaging werd ook verkregen uit één femtoseconde Ti: saffier laser genereren van een supercontinuum lichtbron 23. Onlangs laserbronnen uit één enkel femtoseconde Ti: saffier laser is het pompen van een afstembare optische parametrische oscillatoren (OPO) gebruikt voor CARS microscopie. Deze set-up maakt intrinsiek tijdelijk gesynchroniseerd balken met een verschil van frequentie tussen de pomp en de Stokes bundel die het volledige moleculaire vibratiespectrum 24. Bovendien laser scanning microscoop gebaseerd op omzetkey fs laser en een OPO, in de eerste plaats gebruikt voor twee-foton fluorescentie (TPF) zijn nu beschikbaar voor niet-fysici. Het potentieel van een dergelijke set-ups kan sterk worden verbeterd, zonder dat aanvullende investeringen door de incorporatie van andere niet-lineaire optische beeldvorming, aangezien elke niet-lineaire (NLO) beeldvormingmodaliteit gevoelig is voor specifieke structuren of moleculen. Multimodale beeldvorming NLO kapitaliseert dus het potentieel van NLO microscopie voor complexe biologische monsters 25. De koppeling van deze technieken is het onderzoeken van vele biologische vragen toegestaan, met name op de vetstofwisseling, huid of kanker ontwikkelen 26, skeletspier ontwikkeling 27, atherosclerotische lesies 28. Bovendien is de toepassing van laserstralen met CARS geeft het vermogen van hoge frequentie imaging, dwz een aantrekkelijk middel om dynamische processen in vivo.

Het doel van dit werk is om elke stap uit te voeren t tonenhij CARS-techniek op een standaard multiphoton laser scanning microscoop. De microscoop is gebaseerd op een FSEC Ti: saffier laser en een OPO (door de gepompte Ti: saffier laser) bediend door een software voor biologen. De integratie werd uitgevoerd door de lengte van een van de laserstraal pad om te synchroniseren tijdig de twee bundels. We beschrijven de stap-voor-stap uitvoering van deze techniek die op basisachtergrond experimentele optica nodig. We illustreren ook CARS beeldvorming verkregen op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we deze beeldvorming kan gelijktijdig worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaard twee-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

figure-protocol-1
Figuur 1. Schematische weergave van de algemene set-up Het omvat de Ti:. Sapphire (680 - 1080 nm) en de OPO (1050 - 1300 nm) lasers, de vertraging lijn met de 4 spiegels (M 1 tot 4 M), de snelle oscilloscoop, de fotodiode en twee vaste iris diafragma I 1 en I 2. Spiegels M 2 en M 3 zijn bevestigd op een lineaire vertaling podium waardoor de vertraging lijn lengte te veranderen met een micrometer resolutie. A 660 -. 685 nm band pass filter werd geplaatst in de voorkant van de fotomultiplicatorbuis (PMT) gebruikt voor CARS imaging Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Startup van het lasersysteem

  1. Controleer of de Ti: saffier golflengte is ingesteld op 800 nm of definieerdeze golflengte op de Ti: saffier voedingsbronbesturingsorgaan. Draai de sleutel uit Standby naar On om over te schakelen op de Ti: saffier laser.
  2. Zet de OPO laser op de achterkant van de OPO controller en open de Ti: saffier sluiter op de Ti: saffier voedingsbronbesturingsorgaan.
  3. Schakel de tablet-computer op te pompen het OPO. Klik op de OPO Connected en Remote Connected pictogrammen op de tablet. Wacht 30 - 40 minuten op te warmen.
  4. Schakel de microscoop computer en zet de "Microscope Components" switches. Start de software door te dubbelklikken op het pictogram op het bureaublad.
  5. In het tabblad software Acquisition, opent u de Laser gereedschap in de Setup Manager om zowel lasers opereren vanuit de software. Selecteer Ti: saffier laser On en OPO laser On. Controleer de waarde van de optische laservermogen (specifieke waarden van 3700 mW bij 800 nm en 700 mW bij 1000 nm).
  6. Om de bundel pad en lasers te configureren,Open het lichtpad gereedschap in de Setup Manager gereedschapsgroep en controleer doos de eerste Photomultiplier buis (PMT).
  7. Om de Ti controleren: saffier laser spot aan de uitgang van de doelstelling, opent u de Kanalen gereedschap in de Verwerving Parameter gereedschap groep. Selecteer de Ti: saffier vermogen bij lage waarde (ongeveer 1%), vermindering van de winst op 0 (geen afbeelding nodig is in dit stadium) en klik op de Continue-knop om het scannen procedure te starten om de laserstraal te lanceren door de microscoop doelstelling. Controleer de aanwezigheid van een rode vlek door directe waarneming door het positioneren van de IR laser smartcard aan de uitgang van de lucht microscoopobjectief (10X).
  8. Om de OPO laser ter plaatse controleren, stopt de scan van de Ti: saffier laser door te klikken op de knop Stop. Selecteer de OPO vermogen bij lage waarde in het venster Kanalen en klik op de Continue knop.

2. Microscoop Instellingen

  1. Handmatig op de dichroïsche spiegel met een cutoff golflengte bij 760 nm in de SidePort schuif in de oneindige ruimte boven de doelstelling neusstuk om het licht tot 760 nm van het monster te lanceren in de PMT's in niet-descanned detectie (NDD) mode.
  2. Stel de nauwe band pass filter bij 660-685 nm in de NDD reflector kubus in de voorkant van PMT1 op te nemen alleen de CARS signaal bij 670 nm om de resultaten die in dit werk te verveelvoudigen.
  3. Plaats een smalle band filter van 500 tot 550 nm in de NDD reflector kubus voor pMT3 op fluorescentie waarneming van het myeline. Plaats een smalle band filter, variërend 565-610 nm in de reflector kubus voor pMT4 voor SHG observatie.
  4. Om te selecteren in de software van de opname van het signaal op de detector met de ad hoc band pass filter, opent het lichtpad gereedschap in het menu Instellingen Manager in het tabblad Verwerving. Activeer de gewenste PMT (selectievakje) en selecteer een kleur voor dit kanaal. In dit werk, werd de groene gekozen voor auto's, rood voor fluorescentie en magenta voor SHG.

3. Temporal Synchronisatie

Opmerking: De twee laserstralen uit dezelfde Ti: saffier laser maar de OPO bundel wordt vertraagd wanneer het wordt gegenereerd zodat de twee bundels niet worden gesynchroniseerd ogenblik dat zij de microscoop bereiken. Het doel hier is om een ​​van de twee bundels vertraging opnieuw synchroniseren ze tijdig voordat ze de microscoop bereiken.

  1. Contact maken met BNC kabels het ingangskanaal CH1 van de oscilloscoop om de elektrische BNC laservermogen (Sync. Out). Verbind de ingang kanaal CH2 van de oscilloscoop aan de fotodiode en kies de CH1 kanaal als de trigger kanaal door te drukken op het menu Trigger, dan is de main-menuknop Bron en dan is de side-menu-knop die overeenkomt met de geselecteerde C-kanaalH1.
  2. Positie en bevestig met optische montage berichten de fotodiode in het brandvlak van een lucht microscoop doelstelling (10X), of in de bundel pad van de microscoop na het verwijderen van de doelstelling. Opmerking: Verwijder indien nodig de condensor en zijn drager.
  3. In het Kanalen gereedschap (Acquisitie Parameter gereedschap groep), bepalen de Ti: saffier laser golflengte bij 830 nm bij laag vermogen (dat wil zeggen, minder dan 1% van het volledige vermogen). In het gereedschap acquisitiemodus, verminderen het scangebied op één punt om de fotodiode met de kleinste straal verlichten. Schakel de laser scan door te klikken op de Continue knop.
  4. Druk AUTOSET op de oscilloscoop voorpaneel en handmatig verplaatsen van de positie van de fotodiode op de pulstreinen te krijgen op het scherm. Druk op RUN / STOP-knop om het scherm te bevriezen.
    1. Om een ​​kopie van de oscilloscoop scherm op te slaan, plaatst u een 3,5inch diskette in het diskettestation of sluit de GPIB-poort aan de achterzijde op een computer. Druk vervolgens op SHIFT HARDCOPY MENU drukt FORMAT (hoofd) naar TIFF beeldformaat te selecteren en geef in het menu Port de uitgang kanaal. Druk HARDCOPY knop om de oscilloscoop weergave van de puls treinen van de Ti op te nemen: saffier laser.
  5. Schakel de Ti: saffier laser scan door te klikken op de knop Stop. Door te klikken op Channels gereedschap bepalen de OPO signaal bij 1107 nm en een laag stroomverbruik. Schakel de OPO laser scan en noteer de pols treinen van de OPO laser op de oscilloscoop. Schakel de OPO laser scan.
  6. Vergelijk de tijdelijke verschuiving tussen de Ti: saffier en de OPO signalen.
    LET OP: De tijdelijke verschuiving t verschuiving geeft de duur van de vertraging lijn L DelayLine die moet worden uitgevoerd naar aanleiding van de vergelijking: L delayLine = c5; t verschuiving waarbij c de snelheid van het licht.
  7. Kies een van de laserlijnen.
    LET OP: In dit werk, de Ti: saffier laser werd lijn gekozen omdat vrije ruimte beschikbaar is in de buurt van deze laser lijn was. Bovendien maakt deze keuze de herschikking van de laserlijn met een zichtbare laserlicht te bereiken.
  8. Open de laserlijn door verwijdering van de beschermende buis op de plaats waar de vertragingslijn worden toegepast.
    Let op! Draag geschikte veiligheidsbril en verwijder keten armbanden of kijken uit polsen.
  9. Selecteer een golflengte in het zichtbare gebied om te kunnen gemakkelijk observeren de laserstraal (700 nm bijvoorbeeld bij laag vermogen in de kanalen instrument van de software). Schakel de laser scan.
  10. Plaats en bezet met optische montage berichten twee iris diafragma langs de open laser lijn. Positie een iris bij de uitgang van de vertraging lijn en plaats de andere iris bij de ingang van de periscoop.
    LET OP: De periscope controles door twee gemotoriseerde spiegels bestuurd door de software de hoek van ingang van de laserbundel in de aftastkop van de laser scanning microscoop.
  11. Verlaag het irisdiafragma opening en stel het diafragma posities op de laserstraal pad passen. Bevestig ze op de optische tafel. Stel de verticale positie van een derde mobiele irisdiafragma, om de hoogte van de laserstraal controleren tijdens het achtereenvolgens plaatsen van de vier spiegels van de vertragingslijn.
    Opmerking: Deze irisdiafragma dient als controle voor de herschikking procedure die het pad te volgen.
  12. Plaats de spiegel M1 aangebracht op een compacte kinematische spiegelhouder aan de ingang van de vertragingslijn (zie figuur 1) en de positie en de oriëntatie op de balk hoogte met het gebruik van de mobiele irisdiafragma handhaven passen. Plaats spiegels M2 en M3 (ook gemonteerd op compact kinematische spiegel mounts) bij 90 ° op de vertaling podium die op midco zal worden gepositioneerdurse. Plaats ze om de vertraging lijn lengte passen zoals eerder berekend.
  13. Stel de oriëntatie van M2 en M3 met behulp van de mobiele irisdiafragma. Stel M4 (ook bevestigd op een compacte houder) bij de uitgang van de vertragingslijn (vlak voor iris I 1 zoals getoond in figuur 1) en zorgvuldig pas de positie en hoek ten opzichte van het pad van de laserbundel passen door de twee vaste irisdiafragma.
  14. Plaats de laser smartcard aan de uitgang van het microscoopobjectief en controleer de laserbundel profiel op de pagina Continue inschakelen van de laser scan. Let op een uniform heldere schijf. Indien nodig, licht pas de oriëntatie van M4.
  15. Positie weer de snelle fotodiode onder de laserstraal in de steekproef focus vliegtuig van de microscoop. Houd u aan de tijdelijke verschuiving tussen de Ti: saffier laser en de OPO balk op de oscilloscoop.
    Opmerking: Wijzig zo nodig de vertraging lijn lengte door het bewegen van het hele systeem M2, M3 gemonteerd op detranslatietrap (zonder de translatietrap tuning) voor beide pulsen synchroniseren. Wijzigingen van enkele centimeters kan worden gevergd.

4. Ruimtelijke Overlap van de balken

Opmerking: Om een ​​CARS signaal te produceren, wordt de ruimtelijke overlapping van de twee laserstralen nodig. De afwisselende verlichting van beide bundels op dezelfde korrels gekleurd door met twee verschillende fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de ruimtelijke verschuiving te geven. Fijne aanpassingen van de spiegel posities kan dan het minimaliseren van de shift.

  1. Gebruik voorgemonteerd fluorescerende microbolletjes. Of zet microsferen in suspensie op schone microscoopglaasjes zoals hieronder beschreven:
    1. Voordat bemonstering, mix (op een cortex mixer of door sonicating) de kralen oplossing om zeker te zijn dat de korrels op uniforme wijze worden opgeschort.
    2. Toepassen 5 ul van de kralensuspensie aan het oppervlak van een glijbaan en verspreid met de pipetpunt. Wacht tot de druppel te drogen en breng daarna 5 ui mounting medium, zoals glycerol, water of onderdompeling olie via droge monster kralen. Bedek het monster met een dekglaasje en sluit de dekglaasje met sneldrogende lijm of gesmolten paraffine.
  2. Plaats het op een microscoop dia onder de doelstelling 20X water vast fluorescerende polystyreen korrels. Voeg enkele druppels water aan de doelstelling onder te dompelen.
  3. Om de focus op de parels te bereiken, opent u het tabblad Zoek in de software van de laser scanning-modus te schakelen naar de directe waarneming van het monster met het oog, door op de knop Online. Open het oculair tool om de ad hoc-filter te selecteren en schakel de halogeenlamp door te klikken op de pictogrammen.
  4. Handmatig verwijderen van de dichroïsche spiegel in de SidePort slider in de oneindigheid ruimte en gebruik maken van de focalisatie van de microscoop om het monster vlak scherpstellen door het observeren van de kralen met de oculairs. Vervang de dichroïsche spiegel.
  5. In deLokaliseren tab, schakelen naar de laser scanning modus door op de knop Offline. Ga naar het tabblad Overname om de parameters voor het scannen te definiëren: selecteer de grootte van het kader tot 512 pixels, een scansnelheid van 9, een gemiddelde van 1, een beetje diepte van 8 bit en verhoging van de scan gebied tot het maximum.
  6. In het Kanalen instrument van het tabblad Verwerving, voeg een Track (Track 1) als deze niet al gemaakt. Kies de golflengte van 830 nm en een laag stroomverbruik voor de Ti:. Saffier laserstraal Vink de kleur groen in de Track 1 doos uit het raam kanalen en in de pMT3 of pMT4 box van het lichtpad venster.
  7. In het Kanalen instrument van het tabblad Verwerving, voeg een tweede Track (Track 2). Kies de golflengte van 1107 nm en een laag stroomverbruik voor het OPO laserstraal. Vink de kleur rood in de Track 2 box van het raam kanalen en in de doos pMT3 uit de Light Path venster.
  8. Pas de winst van beide tracks op 600. Dan, achtereenvolgens van toepassing de scan van de twee bundels op het monster door te klikken op Continue.
  9. Let op het beeld in het scherm gebied in de 2D-weergave. In het scherm View Option regelblok, past het scherm intensiteit.
    Opmerking: Indien nodig verplaatst enigszins de focalisatie om de focus vlak van de parels te vinden. Pas de Crop en zoom het beeld in een enkele kraal of in een groep van aangrenzende kralen.
  10. Gebruik de periscoop controller aan de balken elkaar overlappen in xy-vlak. In de software, opent u het tabblad Onderhoud. Klik op de System Options en gereedschappen venster Gemotoriseerde Periscope weer te geven. Gebruik grove en fijne aanpassingen van de periscoop spiegels van de Ti: saffier laserstraal in om te synchroniseren in de ruimte beide beelden.
  11. Voor de periscoop manipulatie, gebruik dan de eerste aanpassing bars voor verticale en de second een voor horizontale bewegingen van de laserstraal. Beweeg de balk met de ingang spiegel tot het beeld licht zichtbaar, en vervolgens te compenseren voor de laser intensiteit met de uitvoer spiegel van de periscoop door te klikken op "input" en "output".
  12. Om verticaal overlappen de balken, in het tabblad onderhouden, opent u de Collimator gereedschap en pas de waarde van de brandpuntsafstand van de Ti: saffier laserstraal.
  13. Verplaats voorzichtig de doelstelling verticale positie van het verschil in focus te controleren op beide beelden. Of, neem een ​​z-stack van het monster door de opening in het tabblad Overname de Z-Stack gereedschap en kies de verschillende parameters (bereik, het aantal schijfjes). Druk Ortho in het beeld op het scherm gebied om de balken in axiale doorsnede te zien. Maximaliseren van de z-overlap door het doen van dezelfde procedure meerdere malen.

5. De laatste aanpassingen en Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Signal Observation van Olive Oil Droplets

  1. Doe een druppel olijfolie op een glazen plaat en bedek het met een glazen afdekplaat slip. Voeg enkele druppels water op een 20x water immersie objectief onder te dompelen. Richten op de rand van het dekglas met de oculairs (zoals hierboven in 4,2).
  2. In het Kanalen instrument van het tabblad Verwerving, selecteert u in Track 1 de golflengte van 830 nm voor de Ti: saffier laser en 1107 nm voor het OPO. Vink beide lasers in Track 1 tot een gelijktijdige scan van beide lasers te krijgen. Set bevoegdheden bij lage waarde voor een begin.
  3. In het lichtpad venster selecteert PMT1. Schakel de laser scans door te klikken op de Continue knop. Verplaats lichtjes de focus naar het laserlicht te leveren in de olie dunne laag.
  4. Vergroot zonodig de optische sterkte van beide lasers. Pas de weergave-intensiteit in het scherm View Option control block. Verplaats de vertaling fase van de vertraging lijn totdat het signaal sigdend verbeterd.
  5. Na de boete rooilijnen compleet zijn, controleer dan of het is echt een CARS signaleren: Verplaats lichtjes De vertaling stadium; de intensiteit van het signaal moet zwakker. En / of schakel een van de laserbundel, hetzij Ti: saffier laser of OPO. Opnieuw is er een sterke verval in intensiteit in vergelijking met de CARS signaal moet zijn.
  6. Om het maximale CARS signaal te bereiken, selecteert u de optie op de software tot een waarde van de gemiddelde intensiteit van het gehele beeld te bieden (in het Histo van het tabblad scherm gebied). Stel de golflengte (enkele nm), vervolgens de x, y, z posities van de focus bundel de gemiddelde intensiteit te maximaliseren.

6. Behuizing van het lichtpad van de Delay Line

  1. Aangezien het uiteindelijke systeem is gewijd aan niet-fysici, omsluiten het lichtpad van de vertraging lijn met buizen of een behuizing box, de rechtstreekse toegang tot schadelijke niet-zichtbare hoog piekvermogen laserstraal te voorkomen. Zorg om een ​​toegang tot de translatietrap biedenknop.

7. Golflengte Tuning voor CARS

  1. Gebruik de vergelijking figure-protocol-2 afstemmen de lasergolflengten de gewenste Raman trillingen. Om de resultaten die in dit werk om de afbeelding CARS reproduceren signaal van CH bindingen met stretching trilling van 3015 cm -1, selecteert λ Ti: saffier = 830 nm en λ OPO = 1095 nm.
    OPMERKING: Raman kenmerkende trillingsfrequenties waargenomen in biologische monsters, zoals water, kan CH binding worden in Evans et al 13 of Ellis et al 29...
  2. Gebruik de vergelijking figure-protocol-3 de emissiegolflengte van CARS signaal bepalen. Voor CH binding beeldvorming door CARS, kies dan een smalle band filter bij 670 nm sinds λ CARS = 670 nm met laser golflengten die in 7.1.
    OPMERKING: Een mobiele telefoon applicatie is avbaar te λ CARS berekenen op basis van λ P en S λ-waarden (zie referentie 30).

8. Waarneming van CARS Signal en Stained myeline uit heupzenuw Cuts

Opmerking: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele regelgeving.

  1. Bereid de axiale en longitudinale heupzenuw sneden op een microscoopglaasje zoals weergegeven in Ozcelik et al. 31.
  2. Bereid de fluoromyelin rode vlekken oplossing door verdunning van de voorraadoplossing 300-voudig in PBS. Overspoelen de zenuw snijdt met de kleuroplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en was 3 maal gedurende 10 min met PBS.
  3. Plaats de bezuinigingen onder de 20X water immersie objectief. Plaats een dekglaasje. Voeg enkele druppels PBS om de doelstelling te dompelen en de focus van de doelstelling aan te passen om een ​​duidelijk beeld van de bezuinigingen door het oculair te krijgen (zoals eerder beschreven in 4.2).
  4. In Track 1 Selecteer de Ti: saffier en de OPO lasers en hun golflengten definiëren tot 830 nm en 1095 nm, respectievelijk. In het lichtpad venster selecteert PMT1 en groene kleur.
  5. Volg 2, selecteert u de OPO laser enige (golflengte 1095 nm). In het lichtpad venster selecteert pMT4 en rode kleur.
  6. Voor beide lasers, selecteert u een laag vermogen en stel de winst tot 600 voor een begin. Schakel de laser scant en pas de volgende parameters om auto's te verbeteren en fluorescentie signaal contrasten: vermogenswaarden, vertaling podium knop (zeer licht), golflengten (enkele nm), vertoning intensiteit.
  7. Tot de uiteindelijke beelden op te nemen met een hoge resolutie, selecteert u in het hulpprogramma Acquisition Mode de volgende parameters: framegrootte van 1024 pixels, scansnelheid van 7, middeling van 4. Klik op de Snap knop voor het opnemen van een enkel beeld. Sla de afbeelding op in de eigen vormbij aan het imago en de volledige overname parameters vast te leggen.

9. Waarneming van CARS en SHG Signalen van heupzenuw Cuts

  1. Bereid de Ischiaszenuw zoals gepresenteerd in Ozcelik et al. 31.
  2. Volg de procedure zoals beschreven in deel 8 om een ​​beeld te krijgen door middel van de oculairen en CARS signaalparameter (Track 1) te selecteren.
  3. Volg 2, selecteert u de OPO laser enige (golflengte 1095 nm). In het lichtpad venster selecteert pMT3 en magenta kleur.
  4. Volg de procedure zoals beschreven in deel 8 inschakelen van de laser scant en redden hoge resolutie beelden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De pulstrein frequentie van de standaard Ti: saffier laser is meestal rond de 80 MHz. De OPO heeft dezelfde frequentie omdat deze wordt gepompt door de Ti: saffier laser. Een snelle oscilloscoop van ten minste 200 MHz is daarom noodzakelijk. Een snelle fotodiode in het bereik 600 tot 1100 nm is ook vereist. De maximale temporele verschuiving optreedt wanneer de Ti: saffier en de OPO worden verschoven van 1 / (2 x 80 x 10 6) = 6,2 nanoseconden. Het komt overeen met de ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest uitdagende gedeelte van het werk is de tijd synchroniseren van de laserstralen. Het vereist een snelle fotodiode gecombineerd met een snelle oscilloscoop, maar slechts een ruwe overlapping in de tijd kan worden uitgevoerd op het eerste. Dan is een verdere aanpassing van enkele cm is vereist. Tenslotte micrometer beweegt met een lineaire translatietafel maakt het uitvoeren van de uiteindelijke fijnafstelling van de vertragingslijn lengte teneinde het CARS kan activeren. Dit signaal wordt in een smal traject van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Frankrijk) bedanken voor de lening van de snelle oscilloscoop en erkennen de financiële steun van Montpellier RIO Imaging (MRI). HR erkent ANR-subsidies France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) en France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructuurnetwerken voor coherente Raman-beeldvormingsontwikkelingen. Dit werk werd hoofdzakelijk ondersteund door een European Research Council-subsidie (FP7-IDEAS-ERC 311610) en een INSERM - AVENIR-subsidie aan NT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
OscilloscopeTektronixTDS 520D500 MHz 
PhotodetectorThorlabsDET08C/M, T42905 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm
Ti:Saffier laser Chameleon Ultra Family IICoherent
Optische parametrische oscillator OPO Compact FamilyAPE Berlin
Axio Examiner microscoop LSM 7 MPCarl Zeiss
Gemotoriseerde periscoopNewport
Objectief W Plan-Apochromat 20X/1.0Carl Zeiss
StraalverbinderCarl Zeiss
Acousto-optische modulatorCarl Zeiss
OPO vermogen demperCarl Zeiss
FotovermenigvuldigingsbuisCarl Zeiss
ZEN softwareCarl Zeiss
Bandpass filtersCarl ZeissLSM BiG 1935-176400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm
Dichroic spiegelCarl ZeissCutoff golflengte 760 nm
Zilveren spiegelsNewport10D20ER.2 λ/10, 480 - 20.000 nm, Aantal 4
Eén-assige translatie stage met standaard micrometerThorlabsPT1/MAantal 1
Aluminium breadboardThorlabsMB1015/M Aantal 1
SpiegelmontageThorlabsKMSS/M Aantal 4
Spiegelhouder voor Ø1" Optica ThorlabsMH25Aantal 4
Iris diafragma's ThorlabsID8/MAantal 3
Beschermende doosThorlabsTB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1SAantal 1
Optische postsThorlabsTR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/MAantal 8 (lengten afhankelijk van de set-up)
661 - 690 nm bandpass filterSemrock676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filterAantal 1
Fluorescente kralenThermoFisherTetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser bekijkkaartThorlabsIR laser bekijkkaart
Laser veiligheidsglasNewportLV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain ThermoFisherF34652

Referenties

  1. Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
  4. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  5. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  6. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
  8. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
  9. Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
  10. Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
  11. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
  12. Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
  13. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
  14. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. New York. (1995).
  15. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
  16. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  17. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
  18. Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
  19. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
  20. Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
  21. Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
  22. Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
  23. Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
  24. Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).
  25. Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
  26. Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
  27. Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
  28. Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).
  29. Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
  30. A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
  31. Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
  32. Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
  33. Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
  34. King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
  35. Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
  36. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
  37. Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
  38. Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CARS microscopieTi Saffierlaserlasersynchronisatieimplementatie van vertragingslijnenniet lineaire optische beeldvormingtweede harmonische generatiebeeldvorming van de myelineschedelabelvrije chemische beeldvormingmultifotonmicroscoop
Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.