Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes

Summary

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Abstract

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Introduction

Tijdens mitose worden de chromosomen van de gerepliceerde genoom georganiseerd in de cel evenaar tot gelijke verdeling van zusterchromatiden over de nieuw gevormde dochter cellen te waarborgen. Chromosoom positionering en segregatie wordt gemedieerd door hun gehechtheid aan spindle microtubules afkomstig van twee tegengestelde centrosomes. Afgezien van het getrouwe chromosoom distributie, de oriëntatie van de mitotische spoel bepaalt eveneens de celdeling vlak ^1. Gecoördineerde oriëntatie van de celdeling is van essentieel belang tijdens de vele stadia van ontwikkeling en voor het weefsel homeostase ^2. Specifiek kan geregeld mitotische spoel positionering leiden tot een asymmetrische verdeling van celinhoud of zelfs produceren dochtercellen van verschillende grootte ^2. Mitotische spoel assemblage en oriëntatie start in profase en wordt georkestreerd door een complex samenspel tussen samenwerkende en tegenwerken van kracht generatoren ^3,4. De optredende krachten bestaan ​​uit both trekken en duwen krachten. Deze komen voort zowel spindel contacten met de cel cortex en vanuit de spil en kan worden gegenereerd door microtubule dynamiek en door moleculaire motoren en cross-linkers (figuur 1).

Duwkrachten kunnen worden gegenereerd wanneer microtubuli groeien tegen rigide structuren zoals de cel cortex. Afhankelijk van de totale weerstand kracht gegenereerd binnen het systeem, kan dit leiden tot een herpositionering van de mitotische spindel (lage krachten) of triggeren microtubule knik of catastrofe (grote krachten) ^5-8. De hoeveelheid kracht die kan worden opgewekt door op afhankelijk van microtubuli lengte, omdat lengte bepaalt in grote mate van microtubule-knik ^9. Bovendien kan microtubules afkomstig van de ene centrosome duwen tegen elkaar centrosome, een mechanisme dat is voorgesteld om centrosoom scheiding rijden vroege profase ^3,10.

in addition te duwen krachten die ontstaan ​​door groeiende microtubuli, microtubule eindigt in contact brengen van de cel cortex kan ook bemiddelen trekkrachten ^11. Onderzoeken van meerdere laboratoria hebben aangetoond dat de beheerste activiteit van de corticale kracht generatoren nodig voor de asymmetrische positionering van mitotische spoelen in vivo ^1. Essentieel voor deze trekkrachten is-cortex gelokaliseerd cytoplasmatisch dyneine (hierna "dynein '), een min-end gerichte microtubule eiwit motor ^8,12,13. Bijvoorbeeld in gist, laterale corticale interacties van dynein de crotubulusrooster resultaat motor-afhankelijke microtubule glijden langs de ¹⁴ cortex. Echter, corticale trekkrachten worden opgewekt door het vermogen van dynein end-on aanhangsels samen te depolymeriseren microtubuli ^8. De energie van microtubule krimp kan leiden tot krachten die over het algemeen een orde van grootte hoger (~ 50 pN (referentienummer ¹⁵ )) dan de krachten die ontstaan ​​door individuele motor-eiwitten (~ 7-8 PN (ref. ^16)). End-on attachment van corticale dynein te depolymeriseren microtubuli stimuleert spindel positionering in gist ¹⁷ ​​en C. ¹³ elegans. Of beide afhankelijk van de motor te schuiven en microtubule depolymerisatie gedreven corticale trekkrachten kunnen samenwerken of elkaar uitsluiten in vivo is op dit moment onbekend.

Naast de microtubule duwkrachten en dyneine gemedieerd corticale trekkrachten, wordt centrosome positionering gecontroleerd vanuit de mitotische spindel door tal van andere eiwitten. Kinesine-5 motoren bijvoorbeeld bestaan ​​tetrameren die verknopen antiparallel interpolaire microtubules, resulterend in het genereren van uitgaande schuifkrachten ^18-20. Leden van het kinesine-5 motor familie zijn vereist voor centrosoom scheiding en bipolaire spileenheid in alle eukaryoten bestudeerd, met uitzondering van C. elegans (besproken in referentie ^21).

Bovendien worden diffundeerbare vernettingsmiddelen van de ASE1 / PRC1 familie ook bekend lokaliseren overlappende gebieden van microtubule interpolaire microtubuli in vivo en in vitro ^22-27. De krachten die ontstaan ​​door ASE1 aangedreven expansie van de overlappende microtubule-gebied zijn groot genoeg om kinesine-14 gemedieerde schuifkrachten tegenwicht in vitro ^28,29. In de cel wordt ASE1 / PRC1 nodig voor stabiele vorming van microtubule overlappende gebieden in de spindel Midzone ^25-27,30, wat suggereert dat de krachten die door diffundeerbare vernettingsmiddelen aanzienlijk kunnen bijdragen tot spil organisatie. Tenslotte krachten uit de mitotische chromatine en kinetochoren beïnvloeden mitotische spoel montage en positionering via verschillende wegen ^3. Aangezien deze componenten niet tot de reconstitutie assays beschreven, worden deze niet in detail besproken.

jove_content "> Verschillende theorieën bestaan ​​over de manier waarop de verschillende moleculaire componenten en krachten hierboven beschreven werken in assemblage van de spoel en positionering, maar we zijn nog ver verwijderd van een kwantitatief begrip. Naast experimenten in levende cellen, in vitro experimenten met gezuiverde componenten zorgen voor een krachtige route om dit doel te bereiken. Hier presenteren we een visuele gids een aangepaste en uitgebreide versie van de onlangs gepubliceerde methoden (Roth et al. ^31), waarin elementaire spindels worden gereconstitueerd in water-in-olie-emulsie druppeltjes, beginnend met een minimaal aantal onderdelen. met microfluïdische technieken, worden bolvormige druppeltjes gegenereerd met afmetingen die vergelijkbaar mitotische cellen. Binnen deze druppeltjes, kunnen gezuiverd centrosomes en tubuline worden gecombineerd om microtubuli aster dynamica te bestuderen, krachtgeneratie en aster-aster interacties. By invoering van corticale (zoals dynein) en inter-polaire (zoals kinesine-5 / ASE1) force-generatoren, wereconstitueren steeds complexer spindel-achtige structuren die beginnen met de in vivo situatie lijken.

Protocol

1. Bereiding van Microfluidics Chips

OPMERKING: Bij bottom-up onderzoek spileenheid worden bolvormige water-in-olie-emulsie druppeltjes gebruikt. Deze zijn waterige microdruppels gescheiden van de omringende oliefase door een monolaag van fosfolipiden en surfactant. Deze emulsie-druppels worden geproduceerd binnen microfluïdische polydimethylsiloxaan (PDMS) chips. Veranderingen in kanaal geometrie en stroomsnelheden kunnen worden gebruikt voor het afstemmen druppelgrootte. In de microfluïdische ontwerpen beschreven worden gegenereerd druppels met een diameter van ongeveer 15 um tot de geometrische opsluiting van een zoogdiercel mitotische cel nabootsen.

1. Fotomasker ontwerp en Mold Fabrication
   1. Ontwerp een fotomasker met drie inlaatkanalen ^31. Inlaatkanaal 1 aansluit op de water-fase, die de inhoud druppel (zie hoofdstuk 3 "Bereiding basic microtubuli asters") bevat. Inlaatkanaal 2 verbindt met de olie-fase (zie paragraaf 2.1 "Lipide / olie-phase voorbereiding "). Gebruik inlaatkanaal 3 tot emulsie-druppels met extra lipide / olie-fase verdunnen voor observatie (optioneel) (Figuur 2a-b).
      Opmerking: Alle inlaatkanalen volgt een stof-filter (een doolhof van kanalen 2 pm) te controleren stof PDMS deeltjes en (eiwit) aggregaten en om te voorkomen dat het blokkeren van de microkanalen (figuur 2d). Kanalen zijn 75 micrometer breed en de lipide / olie-fase en waterfase ontmoeten op een 12,5 micrometer breed kruising waar emulsie-druppels (figuur 2c) zal vormen.
   2. Bestel en afgedrukt fotomaskers te verkrijgen over een film substraat, met een negatieve polariteit (het fotomasker wordt donker met transparante ontworpen structuren).
2. Mold Fabrication
   1. Fabriceren mallen door spin-coating SU-8 3025 fotoresist op een 4 inch silicium wafer met behulp van een spin-coater (500 rpm, 10 sec, gevolgd door 1800 rpm, 45 sec) in een clean-room omgeving.
   2. Expose de SU-8 bekledesiliciumwafel door het fotomasker. Ontwikkelen van wafers volgens de instructies van de fabrikant om kanalen van ~ 40 micrometer dik te maken.
3. Het maken van een microfluïdische chip
   1. Meng 10 delen PDMS pre-polymeer met 1 deel verharder (totaal ~ 40 gr) in een boot-achtige schip met behulp van een plastic spatel. Plaats PDMS met bootachtige vaartuig in een vacuümkamer gedurende ~ 30 minuten. om luchtbellen te verwijderen. Wikkel aluminiumfolie rond de vorm om een ​​kop met ~ 1 cm opstaande randen vormen.
   2. Giet de PDMS (~ 75% van het totale volume) in de mal, laat in een vacuümkamer voor een ~ 30 min. (Luchtbellen te verwijderen) en harden gedurende 1 uur bij 100 ° C in een oven.
   3. Spin-coat resterende PDMS op glasplaatjes (5 sec bij 200 rpm, gevolgd door 30 sec bij 4000 rpm) gevolgd door uitharden gedurende 1 uur bij 100 ° C. Verwijder stof uit glasplaatjes met perslucht / _N2 -Flow, reiniging vooraf is niet nodig.
      OPMERKING: De PDMS beklede glasplaatjes kan zowel voor microfluidic chip en stroming-cel productie (zie ook 2.2).
   4. Voorzichtig strip de PDMS af van de mal met behulp van een scheermesje en perforeren (0,5 mm voor inlaten, 0,75 mm voor outlet) .Corona behandelen de microfluïdische chip en een PDMS gecoate glasplaatje met een klinisch corona oppervlak behandelaar enkele seconden .
   5. Plaats de microfluïdische chip op het glaasje (kanalen naar beneden) en bak de chips o / n bij 100 ° C (Figuur 3a). Bewaar microfluïdische chips voor enkele maanden in een stofvrije omgeving.

2. microfluïdische Setup

OPMERKING: Water-in-olie-emulsie druppeltjes worden gegenereerd met een microfluïdische opstelling en de microfluïdische chips hierboven beschreven. De samenstelling van het lipide / oliefase kan worden gevarieerd afhankelijk van de experimentele eisen. -Olie opgelost lipiden een monolaag op het water-olie-interface met hun polaire kop-groepen die met het water in te vormen. Om eiwitten targeten(Bijv dynein) naar de druppel grens geringe hoeveelheden biotinyl-fosfatidylethanolamine (biotinyl-PE) lipiden worden toegevoegd. Hierdoor kan de werving van gebiotinyleerd dynein (zie paragraaf 4.1 "Dynein richten naar de druppel cortex") via streptavidine gemedieerde multimerizatie. Druppels worden gestabiliseerd door toevoeging van een oppervlakteactieve stof en opgeslagen in PDMS gecoate stroomcellen.

1. Lipide / olie-fase Voorbereiding
   1. Mix-chloroform opgelost 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfo-L-serine (DOPS) en biotinyl-PE lipiden in een 4: 1 molaire verhouding in een glazen buis met behulp van glazen pipetten (uitgebreid pipetten met chloroform gespoeld voor gebruiken). Bereid een totaal van ~ 250 ug lipiden, waardoor een lipide concentratie van ~ 0,5 mg / ml.
   2. Droog het lipide mengsel met _N2 -Flow en vervolgens in een vacuümkamer gedurende ~ 1 uur voorzichtig. Los de gedroogde lipiden in minerale olie en 2,5% oppervlakteactieve stof tot 0,5 mg / ml (merk ~ 500 pi).
   3. Plaats de lipide / olie-monster in eenultrasoon bad en ultrasone trillingen gedurende 30 minuten. bij 40 kHz tot de lipiden volledig op te lossen.
2. Flow-cell Voorbereiding
   1. Spin-coat PDMS (zie ook sectie 1.3) op dekglaasjes (5 sec bij 200 rpm, gevolgd door 30 sec bij 4000 rpm) en objectglaasjes (5 sec bij 100 rpm, gevolgd door 30 sec 1500 tpm) teneinde de homogene laag deponeren PDMS.
      LET OP: Voor een optimale beeldkwaliteit, zorg ervoor om dekking bril te gebruiken met een dikte die overeenkomt met de microscoop doelstelling. In dit geval: 1,5 (~ 0,17 mm).
   2. Genezen van de PDMS-gecoate dekglaasjes en glasplaatjes gedurende 1 uur bij 100 ° C in een oven. Voeg stroom-cellen door nauwe spatiëring (~ 2 mm) dunne plakjes laboratorium afsluitfilm (~ 3 mm breed) op de PDMS-beklede glazen objectglaasjes. Bewaard in een stofvrije omgeving, kunnen kanalen die niet zijn gebruikt worden gebruikt op andere momenten.
   3. Bedek de stroom-cellen met een PDMS-gecoate dekglaasje en afdichting door het smelten van het laboratorium afdichtfilm ~ 1 min. bij 100 ° C Druklicht (Figuur 3c). Sluit het laboratorium afdichting film -Glas-grenzen met valap (figuur 3c). WINKEL stroom-cellen gedurende enkele maanden in een stofvrije omgeving.
3. PDMS Cup Voorbereiding
   1. Voor langdurige imaging, maak een PDMS kop, door ponsen van een gat diameter 4 mm in een stuk PDMS (~ 3 mm dik)
   2. Corona-behandeling van de PDMS slice en een PDMS gecoate dekglas en plaats ze op de top van elkaar. Bak de PDMS cup o / n (bij 100 ° C) (figuur 5a).
4. Emulsie-druppel Formation
   1. Monitor druppelvorming op een omgekeerde bright-field microscoop. Sluit de drukregelaar aan de microfluïdische chip met behulp van PEEK buizen (diameters: 510 micrometer (buiten) en 125 micrometer (innerlijke)) (Figuur 3a). Vul microfluïdische chips volledig met vet / olie-fase van inlaat 2.
   2. Introduceer MRB80-gebaseerde water-fase (zie hoofdstuk 3 "Bereiding basic microtubule asters4;) van inlaat 1. Controle druppelgrootte-size door het veranderen van lipide / olie-fase en waterfase druk om druppels te creëren ~ 15 micrometer in diameter (figuur 3b).
      OPMERKING: Met deze opstelling gebruik ~ 800 mbar voor lipide / olie-fase en -200 mbar de waterfase tot druppeltjes van de gewenste grootte te maken.
   3. Na het verkrijgen van de gewenste druppelgrootte-size en benodigde hoeveelheid (~ 10 ul per monster), het verzamelen van druppels uit het stopcontact kanaal en lading in stroom-cell (volledig vullen de stroming-cel).
   4. Sluiten de uiteinden van de stroming-cel voorzichtig met valap (onvolledig gesloten stroom-cellen kan leiden tot uitgebreide beweging van de druppels, waardoor het moeilijk beeld hen). Bovendien, de vorming van luchtbellen waardoor druppeltje beweging.
   5. Spoel de PEEK buizen uitgebreid met isopropanol voor en na gebruik om te proeven kruisbesmetting en verstoppingen te voorkomen.

3. reconstitueren Basic microtubuli Asters

OPMERKING: Druppeltje inhoud kan worden gevarieerd afhankelijk van de experimentele eisen. Alle buffers zijn MRB80 basis (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM _MgCl2 (pH 6,8)), en alle monsters worden bereid op ijs. In het algemeen druppeltjes altijd bevatten centrosomes, componenten die nodig zijn voor microtubule polymerisatie, een zuurstof scavenger-systeem en blokkerend middel (zie paragraaf 3.1). Microtubule force-generatoren en de vereiste co-factoren en doelgerichtheid-factoren kunnen worden opgenomen indien gewenst (zie rubrieken 4.1 en 4.2).

1. Algemene instellingen voor aster formatie in emulsie druppeltjes (figuur 3d)
   1. Bereid glucoseoxidase (20 mg / ml glucose oxidase in 200 mM DTT en 10 mg / ml catalase) mix vooraf en bewaar in kleine porties bij -80 ° C.
   2. Bereid een blokkerende mix "die κ-caseïne, runderserumalbumine (BSA), Tween-20 en fluorescent dextran (als neutraal markering) (zie tabel 1) vooraf en bewaar in kleine aliquots bij -80 ° C. Voorkom herhaalde vries-dooi cycli. Zorg ervoor dat alle onderdelen worden vers bereid.
   3. Zuiver centrosomes uit menselijke lymfatische KE37 cellijnen zoals beschreven door Moudjou et al. ³² en bewaar bij -150 ° C in kleine porties.
   4. Centrosomes ontdooien bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C gedurende ~ 20 minuten. voor gebruik om juiste microtubule nucleatie waarborgen.
      LET OP: Dit bevordert microtubuli nucleatie tijdens het experiment.
   5. In de tussentijd bereiden 'analysemengsel' gemaakt met tubuline (tl en "donker"), guanosine trifosfaat (GTP), een zuurstof wegvangend systeem (glucose, glucose-oxidase, katalase en 1,4-dithiothreitol (DTT)), moleculaire werking generatoren (bijvoorbeeld microtubule motoren / verknopingsmiddelen), adenosine trifosfaat (ATP) en een ATP-regenererend systeem (fosfoenolpyruvaat (PEP), pyruvaat kinase (PK) en lactaat dehydrogenase (LDH)) op ijs (zie tabel 2).
   6. Pre-koelenairfuge rotor op ijs. Spin down het monster in de gekoelde airfuge rotor (30 psi gedurende 3 min) .Voeg voorverwarmd centrosomes (optimaliseren van de hoeveelheid centrosomes te streven druppeltjes met 1-2 centrosomes).
   7. Gebruik de gecombineerde mix emulsie druppeltjes met behulp van de in paragraaf 2.3 beschreven methoden te produceren.

bestanddeel	voorraadconcentratie	Eindconcentratie (in assay)	Volume	Commentaar
Dextran-647nm	75 uM	3,75 uM (0,6 uM)	5 gl
κ-caseïne	20 mg / ml	12,5 mg / ml (2 mg / ml)	62,5 pl
Tween-20	5%	0,375% (0,06%)	7,5 pl
BSA	200 mg / ml	12 mg / ml (1,9 mg / ml)	6 pl
MRB80			19 ul
			100 pl finale	Store in 2 pi porties

Tabel 1: Bestanddelen van "Blocking Mix bestanddelen blokkeren mix, die voor de bereiding van spindel-achtige structuren in water-in-olie-emulsie druppeltjes.. Voor een beschrijving, zie hoofdtekst sectie 3 "Bereiding basic microtubule asters". Voor meer informatie over materialen, zie "Materialen Table.

bestanddeel	Stock concentration	eindconcentratie	Volume	Commentaar
Het blokkeren mix			1,6 pl
tubulin	500 uM	30 uM	0,6 pl
Tubuline-488/561	50 uM	3 uM	0,6 pl
GTP	50 mM	5 mM	1,0 gl
Dynein-TMR	178 nM	30 nM	1,7 pl
streptavidine	5 mg / ml	200 nM	0,4 pl	Voor corticale Dynein alleen
Kinesine-5	1,6 mM	80 nM	0,5 pl
ATP	25 mM	1 mM	0,4 pl	Bij motoren alleen
FUT	0,5 M	25,6 mmol	0,5 pl	Bij motoren alleen
PK / LDH	800 U / 1100 U	23 U / 32 U	0,3 pl	Bij motoren alleen
ASE1-GFP	400 nM	80 nM	2,0 pl
Glucose	2,5 M	50 mM	0,3 pl	Laatste stap
Glucose-oxidase	50x	1.0x	0,3 pl	Laatste stap
MRB80			X
			9 ul uiteindelijke

Tabel 2: Bestanddelen van 'Assay Mix'. Bestanddelen van analysemengsel, vereist voor de reconstitutie van spindel-achtige structuren in water-in-olie-emulsie druppeltjes. Voor een beschrijving, zie hoofdtekst sectie 3 "Bereiding basic microtubule asters". Voor meer informatie over materialen, zie materialen tabel.

4. De invoering van Spileenheid-factoren

Opmerking: In de hier beschreven assays, een groen fluorescerend eiwit (GFP) gemerkte afgeknotte versie van S. dynein cerevisiae werd gebruikt dat kunstmatig wordt gedimeriseerd via een amino-eindstandige glutathion S-transferase (GST) -tag ^33. Dit eiwit wordt gezuiverd met een affiniteit tag die twee kopieën van de proteïne A IgG-bindend domein bevat. De variant die hier gebruikt wordt gemerkt met een tetramethylrhodamine (TMR) label op de carboxy-eindstandige en het N-terminale SNAP-tag wordt gebruikt om de gezuiverde eiwitten biotinyleren. Voor construct details, zie Roth et al ^31.; voor de zuivering meer informatie, zie Reck-Peterson et al. ^33. GFP-biotine dyneine-TMR kan worden gericht op de druppel-cortex door de vorming van biotine-streptavidine complexen die dynein aan biotinyl-PE lipiden (figuur 3e) verbinden.

1. Dynein Targeting naar het Droplet Cortex
   1. GFP omvatten biotine dyneine-TMR in het "assay mix '(zie tabel 2) bij een uiteindelijke druppel-concentratie van 30 nM. Omvatten streptavidine in 'testmengsel "(zie tabel 2) bij een uiteindelijke druppel-concentratie van 200 nM.
      LET OP: Dynein hangt af van ATP-hydrolyse voor de stapsgewijze beweging op microtubules. Derhalve omvatten ATP en een ATP-regenererend systeem (met PEP en PK / LDH) in de "assay mix '(zie tabel 2).
      LET OP: Recombinant full-length S. pombe GFP-Cut7 (kinesine-5) werd vriendelijk verschaft door de Diez lab (Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, Dresden, Duitsland), te zien. Recombinant full-length histidine-tag S. pombe GFP-ASE1 werd vriendelijk verschaft door de Jansons lab (Wageningen University, Wageningen, Nederland) en toegevoegd aan het "analysemengsel bij concentraties 80 nM.

5. Imaging

OPMERKING: Tijdens het experiment kan microtubule groei worden geregeld door het veranderen van de temperatuur. Bij de keuze van beeldvormende voorwaarden compromissen moeten worden gemaakt tussen hoge beeldkwaliteit en de mogelijkheid om spileenheid gedurende lange perioden te volgen. Om de kinetiek van de vorming van spindel onder verschillende omstandigheden te vergelijken, kunnen druppels met verschillende inhoud worden gemengd en afgebeeld in dezelfde stroom kanaal.

1. Basic Imaging Settings
   1. Afbeelding in een temperatuur-gecontroleerde omgeving met behulp van een kast. Visualiseren individuele microtubules ~ na 30 minuten bij 26 ° C. Terwijl beeldvorming, bevorderen microtubule-groei door de temperatuur tot -30 ° C.
      LET OP: De sHieronder nstellingen zijn specifiek voor onze microscoop setup en kan variëren met verschillende systemen en verschillende besturingssoftware. Alle van de hier beschreven assays worden afgebeeld op een gemotoriseerde omgekeerde systeem met een draaiende schijf confocale hoofd en bediend met behulp van beeldbewerkingssoftware zoals Andor iQ 3.1. Verkrijgen van alle afbeeldingen met een 100x olie-immersie objectief en EMCCD camera.
   2. Stel excitatie lasers 488, 561 en 641 nm tot ongeveer ~ 10% intensiteit. Ga naar de 'overname' panel, klikt u op de 'AOTF' tab en schuif laser intensiteiten tot 10%. Klik op 'Record' om de instellingen op te slaan.
   3. Voor z -projections, neem stapels met 1 micrometer intervallen (~ 20 beelden / druppel). Ga naar de belangrijkste 'camera' panel, klik op 'bewerken z' en stel 'Z stap' tot 1,0. Klik op 'Next' om de instellingen op te slaan.
   4. Stel maximale lineaire EM-winst door te klikken op de tab 'camera' in de 'overname' paneel en schuif de EM gain bar tot 300. belichting in te stellenDe tijden 200 msec in dezelfde tab. Klik op 'Record' om de instellingen op te slaan.
2. live-Imaging
   1. Voor live imaging, met behulp van de software bediening maken z -projections om de 2 min. voor de duur van 1-2 uur door het verminderen van de belichtingstijden tot ~ 100 msec. (zoals in 5.1.4) en verhogen z -intervals tot 2 pm (zoals in 5.1.3). Stel de tijdreeks in het belangrijkste 'camera' panel, klikt u op 'repeat t' en ingesteld op 2 min. intervallen voor een totale tijd van 120 min.
   2. Voor live assays gebruikt een PDMS kop in plaats van een regelmatige cellen zodat de druppeltjes zo onbeweeglijk mogelijk.
3. Gecombineerde beeldvorming van 2 Voorwaarden
   1. Produceren druppeltjes gebruik microfluïdische en slaan op een PDMS gecoat glasplaatje op ijs. Dit voorkomt microtubule kiemvorming tot de tweede set van druppels is gevormd. Voordat de productie van de tweede set van druppels, spoel de PEEK buizen en microfluïdische chip metMRB80 en volledig vullen microfluïdische chip met de lipide / olie-fase.
   2. Genereer druppeltjes met en zonder fluorescent dextran (of via dextran met verschillende golflengte fluoroforen) om onderscheid te maken tussen druppeltjes met verschillende kleuren. Na het produceren van de tweede partij van de druppels, meng de druppels door pipetteren en laden in een enkele stroom-cell / PDMS-cup.
4. Image Analysis.
   1. Analyseren van beelden met behulp van Fiji (open source software online beschikbaar) ^34.
   2. Voor live-testen, om te zetten in stapels hyperstacks behulp van 'image' - 'hyperstacks' - 'stack naar HyperStack'. Stel de juiste aantal z-plakjes en termijnen.
   3. Om 'beeld' naar z-projecties te maken, kies - 'stacks' - 'z-project'. Kies 'max intensiteit' projectie.
   4. Voor 3D-reconstructies, eerst naar 'image' - 'eigenschappen' en stel de juiste pixel, pixel hoogte, voxel diepte en frame intervallen. Klik op 'OK'. Kies 'image' - 'stacks' - '3D-project', controleer dan de 'interpoleren' en klik op 'OK'.

Results

De in de vorige delen methoden is het mogelijk de reconstructie van de spil-achtige structuren met toenemende complexiteit met behulp van de geometrische opsluiting van water-in-olie-emulsie druppels. Dit deel beschrijft representatieve resultaten die kwalitatief demonstreren het vermogen van deze assays.

Tijdens mitose, wanneer de bipolaire spil gemonteerd, cellen afronden tot bolletjes vormen met een diameter van ongeveer 15 urn, zoals gemeten voor menselijke cellen. Dit karakteristieke mitotische cel vorm zorgt voor een geometrische grens die zowel beperkt u en regisseert spindel formaat en de richting ^35,36. Microfluïdische technieken zorgen voor een niveau van geometrische opsluiting dat precies lijkt op de situatie waargenomen in levende cellen en daarom maakt het bottom-up reconstructie van mitotische spindels in vitro.

microtubuli asters zijn op zich al in staat complexe gedrag wanneer microtubule groei wordt beperkt door geometrische grenzen. Zoals microtubules groeien drukkrachten opgewekt door het opnemen van nieuwe tubuline dimeren drijven beide centrosomes aan tegenoverliggende zijden van de emulsiedruppeltjes. In eerste instantie centrosomes vrij verspreiden binnen het beperkte volume (figuur 4a, linkerpaneel). Na ongeveer 20-30 min, de eerste microtubules zichtbaar en centrosome diffusie beperkt wordt als microtubuli groeien tegen de cortex in alle richtingen. Asters met microtubuli van tussenstuk (ongeveer 50% van de druppel diameter) kan (sterisch) elkaar afstoten andere, met microtubuli duwen tegen elkaar, de andere centrosomes en de cortex. Dit leidt tot een typische 'bipolaire' spindel-achtige regeling met de twee centrosomes tegenover elkaar (figuur 4a, middelste paneel). Wanneer microtubuli groeien meer dan ~ 50% van de druppel-diameter, krijgt de centrosomes verder geduwd om tegengestelde grenzen van de druppel, met microtubuli groeien langs de druppel cortex (figuur 4a, rechter paneel). Het is belangrijk op te merken dat microtubule groei in deze testen zijn zeer gevoelig voor de temperatuur en tubuline-concentraties. Deze parameters zullen dus sterk van invloed op de tijd waarin nucleatie voor het eerst wordt waargenomen en bij steady-state aster posities worden bereikt.

In cellen, worden corticale trekkrachten opgewekt door de vorming van dragende bevestigingen tussen microtubuli plus-uiteinden en geassocieerde cortex dyneine. In dierlijke cellen, deze associatie afhankelijk van Gai / LGN / NuMA complex dat is gericht op het plasmamembraan via N-terminale myristoylering of Gai ^1. In deze reconstructie testen, is de eis van de Gai / LGN / NuMA complex omzeild door rechtstreeks koppelen dynein om gebiotinyleerde lipiden door devorming van biotine-streptavidine-biotine complexen. Deze obligaties zijn relatief stabiel (K _D ~ 10 ^-14 M) ³⁷ en vormen snel (meestal binnen 10 minuten na emulsie druppelvorming, voordat microtubule nucleatie blijkt) (Figuur 4b). In aanwezigheid van de corticale dynein, centrosomes doen vaak een meer centrale positie, terwijl in de afwezigheid van dyneine, centrosomes worden geduwd om weerszijden van de druppel cortex (Figuur 4c). We beredeneren dit is het resultaat van twee effecten, die verhinderen en tegengaan microtubule duwkrachten. (1) Dynein direct microtubulus rampen, waardoor microtubule lengte beperkt en waardoor buitensporige microtubuli knikken, en (2) corticale trekkrachten tot net centrerende krachten op de afzonderlijke asters ^8, waarbij de aster aster-afstotende krachten tegenwerken.

De diffundeerbare cross-linker ASE1 induceert forces die de neiging hebben het overlappende gebied van anti-parallelle microtubuli ²⁹ verhogen. In overeenstemming hiermee, in aanwezigheid van ASE1 (en afwezigheid van dynein) centrosomes dicht bij elkaar gevonden ASE1 lokaliseren aan interpolaire microtubuli (figuur 4d) gebundeld. De leden van de kinesine-5 familie rijden centrosome scheiding door te duwen krachten vanuit de as (zie inleiding). In aanwezigheid van Cut7 (het S. pombe kinesine-ortholoog 5) worden geduwd om centrosomes weerszijden van de emulsie druppeltjes, zelfs in aanwezigheid van ASE1 (figuur 4e). Door het combineren van corticale en inter-polaire kracht generatoren, kan de complexiteit verder worden verhoogd in deze experimenten, uiteindelijk leidend tot een beter begrip van bipolaire mitotische spindle assembly. Een gedetailleerde beschrijving van deze kwantitatieve resultaten zullen in de toekomst (Roth et al., Manuscript in voorbereiding).

Naast het waarnemen van de positie van de centrosomes op vaste tijdstippen, en hun gedrag met betrekking tot de waargenomen lengte van de microtubuli, waardevolle informatie kan worden verkregen door de positioneerproces boven tijd. Door het verminderen belichtingstijden en laserintensiteiten, is het nu mogelijk om aster positionering volgen op 2 minuten intervallen gedurende ten minste 1 uur met slechts ~ 30% bleken. Dit zorgt voor de opvolging van de aster montage en positionering van vrij diffunderen centrosomes (0 min.) Via gecentraliseerd (12 min.) Naar decentrale asters (36 min en verder) (Figuur 5c). Dit vergemakkelijkt het onderzoek van zowel steady-state gedrag spileenheid kinetiek. Door het combineren van druppeltjes met verschillende inhoud in hetzelfde monster is bijvoorbeeld mogelijk om direct centrosome positionering en spileenheid kinetiek vergelijken druppeltjes met en zonder corticale kracht generatoren (figuur 5b).

Figuur 1: krachten op de mitotische spoel Verschillende krachtgenererende moleculen werken op microtubuli van de mitotische spindel vorming en positionering spindel bevorderen.. Microtubuli die groeien in de cel cortex genereren van een duwkracht op de centrosome. Corticale dynein (paarse) vangt depolymeriseren van microtubuli en genereert een trekkracht op de centrosomes. Binnen de spindel, Kinesin-5 / Cut7 motor-eiwitten zorgen voor een naar buiten glijden werking op anti-parallelle microtubuli, terwijl cross-linkers van de familie PRC1 / ASE1 genereren een tegengestelde naar buiten schuiven van kracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Figuur 2:. Microfluïdische chip design (A) Ontwerp van 4 inch fotomasker met 4 microfluïdische chips. (B) De gedetailleerde weergave van een enkele chip. Chips bevatten één afvoerkanaal en drie inlaatkanalen gevolgd door een stof-filter. Inlaatkanaal 1 bevat de waterfase, kan kanaal 2 het lipide / olie-fase en kanaal 3 worden de gevormde druppels extra lipide / oliefase verdunnen. (C) gedetailleerde weergave van de splitsing waar de lipide / olie-fase (vanuit de bovenste en onderste) voldoet aan de waterfase (die van links). Bij de kruising zullen druppeltjes en stromen naar het uitlaatkanaal rechts. (D) Gedetailleerde weergave van een stof-filter met 2 micrometer kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3:. Methodologie voor water-in-olie emulsie druppelvorming (A) microfluïdische chip en microfluidics slang op een helder-veld microscoop. Zowel de water- en lipide / oliefase buizen zijn verbonden met de chip inlaten 1 en 2 respectievelijk. (B) Beperking van microfluidics chip waar de water- en lipide / olie-fase te voldoen. Door de druk, kunnen druppels maat worden gecontroleerd. (C) Het ontwerpen van PDMS gecoate stroom-cellen. Na het laden van de druppels in de stroom-cel, worden de open einden afgesloten met extra valap. (D) Schematische voorstelling van druppelvorming. Druppels worden gebruikt om centrosomes, tubuline en aanvullende componenten nodig voor mitotische spindle vorming kapselen. (E) Schematische voorstelling van corticale dyneine targeting. Gebiotinyleerd (Bio) dynein is gericht op gebiotinyleerde lipiden door middel van streptavidine (Strp). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4:. Representatieve resultaten van de As-reconstructies met toenemende complexiteit (A) Maximale intensiteit projecties van druppeltjes met twee centrosomes toont voorbeelden van korte, tussenliggende en lange microtubuli. Centrosomes en microtubuli worden zichtbaar gemaakt door de toevoeging van 10% HiLyte-488 gelabeld tubuline. Schaalbalken = 10 urn. (B) Lokalisatie van GFP-biotine dyneine-TMR in afwezigheid (-, links) en met (+, rechts) van streptavidine (Strp). (C) microtubules aster positionering in de afwezigheid (-, links) of aanwezigheid (+, rechts) Corticale GFP-biotine dyneine-TMR. (D) van microtubuli aster (linker paneel, grEen) positionering in de aanwezigheid van ASE1 (middenpaneel rood). (E) van microtubuli aster (linker paneel, groen) positionering in de aanwezigheid van ASE1 en Cut7 (kinesine-5) (middelste paneel, red). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Positionering Imaging Aster Dynamics in vitro (A) Ontwerp van een PDMS beker die druppel beeldvorming toelaat gedurende verschillende uren.. (B) Generation, de opslag en de beeldvorming van druppels (overdraagbare) met verschillende inhoud, geïllustreerd door afwezigheid (links) integratie (rechts) van TL-dextran (Alexa 647). (C) enkel vlak beelden van een 60 min time-lapse (2 min intervallen) genomen van een z-stack (2 urn afstanden) van adroplet met een enkele centrosome. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De werkwijzen hier beschreven onderhavige recente inspanningen om te mitotische spoelen reconstitueren in water-in-olie-emulsie druppeltjes. Studeren spileenheid binnen geometrische grenzen biedt tal van voordelen. Belangrijke terugkoppelingsmechanismen bestaan ​​tussen microtubuli van de mitotische spoel en de geometrische beperkingen waarin zij worden geassembleerd. Microtubuli kan genereren duwkrachten als ze groeien in geometrische grenzen, wat kan leiden tot mitotische spindle verplaatsing. Bovendien groeien tot een fysieke barrière kan microtubule rampen induceren. Ook kan spileenheid in een beperkte geometrie leidt tot een geleidelijke uitputting van afzonderlijke componenten, zoals tubuline, waardoor de microtubule groei ³⁶ rechtstreeks beïnvloedt. Dit zijn allemaal essentiële determinanten van spileenheid, die kunnen worden bestudeerd met de hier beschreven bepalingen.

De beschreven testen zijn zeer gevoelig voor kleine concentratie differences van de druppel componenten. Dit geldt voor tubuline, waarbij geringe concentratieverschillen kunnen tot een te laag of te snelle groei van microtubuli. In dit geval microtubule groei kan vaak nog worden gecorrigeerd door de temperatuur tijdens de eerste ~ 30 minuten van het experiment. Mitotische spoel montage en positionering is ook zeer gevoelig voor variaties in de concentratie (corticaal) kracht generators. Dit hangt waarschijnlijk af van de concentratie, zuiverheid en activiteit van de gezuiverde componenten en moet zorgvuldig worden getitreerd voor elk nieuw gezuiverd eiwit.

Bovendien zijn bepaalde compromissen moeten worden gemaakt in imaging instellingen, afhankelijk van de aard van de test. Aanvankelijk hoge niveaus van oplosbare fluorescerende tubuline dimeren bemoeilijken beeld individuele microtubules. Zoals microtubuli langer groeien en oplosbare tubuline langzaam uitgeput, de signaal-ruisverhouding geleidelijk hoger en kan de beeldvorming van individual microtubules. In tegenstelling tot opstellingen met open systemen, de geometrische beperking verhindert de uitwisseling van fluorescerende moleculen en zuurstof scavenger systeemcomponenten binnen een massareservoir, wat resulteert in aanzienlijke bleking. Speciaal voor bewaking spil montage en positionering in de tijd, is het vereist om beeld met lage lichtintensiteiten, zelfs in aanwezigheid van een sterke zuurstofwegvanger systeem.

Deze methoden maken het mogelijk bottom-up reconstructie van vereenvoudigde spindel-achtige structuren in vitro. Naast de genoemde componenten geïntroduceerd zijn vele andere factoren beschreven bipolaire spindle vorming, positionering, oriëntatie, vormen, enz ³ beïnvloeden. Dit systeem kan verder worden uitgebreid naar de afzonderlijke en gecombineerde effect van aanvullende kracht generatoren bestuderen. Belangrijke bijdragen aan spindel formatie die momenteel afwezig in dit systeem zijn de mitotische chromosomen. Mitotische chromatine is aangetoonddirecte vorming spindel door (1) chromokinesins die kan genereren zogenaamde polar-ejectie krachten ^'3, (2) de vorming van een RanGTP gradiënt door de chromatine gebonden RanGEF RCC1 ^38, (3) kinetochoren die kunnen communiceren met (depolymeriseren ) microtubules ³⁹ en (4) het chromatine zelf, die kan functioneren als een mechanische veer daartussen tegengestelde microtubuli ^40.

Tot slot, het beschreven systeem biedt momenteel beperkte ruimtelijke en temporele controle over de activiteit en de lokalisatie van introduceerde force-generatoren. In cellen, vele spileenheid factoren lokaliseren specifieke compartimenten of zijn actief binnen een beperkte tijd-venster. Een treffend voorbeeld is de activiteit van dyneine, die specifiek aan de postérieure zijde van de C. verrijkt elegans één-cellig stadium embryo asymmetrische Spilpositionering en celdeling bevorderen. In dit systeem zijn we momenteel het verkennen van de mogelijkheid van het nabootsen van een dergelijke temporal en asymmetrische activiteit met behulp van methoden geleend van opto-genetische technieken. Bovendien, zoals het geval is voor C. elegans embryo en cellen met een rigide celwand, veel cellen niet afronden in mitose. De vorm van de geometrische opsluiting zal van wezenlijk belang voor de krachten die op de as ⁴¹ hebben. Het zal dus belangrijk zijn om assemblage van de spoel en positionering in niet-sferische druppeltjes reconstrueren zo goed, mogelijk met behulp van meer complexe microfluïdische systemen die het mogelijk maken de vormgeving en opslag van emulsie druppeltjes ^42,43. Tenslotte, in weefsels, cel-cel en cel-substraat signalering en bevestiging bieden externe stimuli die kunnen worden omgezet in gericht spiloriëntatie, zoals vaak waargenomen in epitheel cellen en stamcellen. Al deze gespecialiseerde aspecten geen rekening is gehouden in de huidige studie en wellicht toekomstige uitdagingen om te bouwen naar meer in vivo-achtige reconstructies van mitotische spindle assemb biedenly en positionering.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Preparation of microfluidic chips
Photomask (Photomask on film substrate)	Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025	MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats)	WRS Materials	4P0SSP-005
Spin coater	Polos	SPIN150I
PDMS pre-polymer RVT615 A+B	Lubribond	9481
Corona treater	Electro-technic products	BD-20ACV
2. Microfluidic setup
Name	Company	Catalog Number	Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)	Avanti Polar Lipids	840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))	Avanti Polar Lipids	870285
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498
Glass pipets
Glass tubes
Vacuum pump	Laboport	KNF
Vacuum chamber	Kartell	Polypropylene Vacuum Desiccator
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Surfactant (Span80)	Sigma-Aldrich	85548
Sonicator	Branson	M2800H
Coverslips			24 mm x 60 mm, thickness 1.5
Glass-slides			26 mm x 76 mm
Puncher	Harris Uni-Core	135840/135841/135843
Laboratory sealing film	Parafilm
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)			Home made
Brightfield Microscope	Leica	PMIRB	Any inverted brightfield would suffice
Pressure controler	Fluigent	MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing	Cluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)	VWR, The Netherlands
3. Reconstituting spindle formation and positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)	Life Technologies
Tween-20	Sigma-Aldrich
BSA - Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	G8270
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)	Sigma-Aldrich	G6125
DTT (DL-dithioltheitol)	Sigma-Aldrich	646563
Catalase (Catalase form bovine liver)	Sigma-Aldrich	C9322
Tubulin (Tubulin from bovine brain)	Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)	Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	51120
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk)	Sigma-Aldrich	C0406
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)	Beckman-Coulter	CLS
4. Introducing spindle-assembly factors
Name	Company	Catalog Number	Comments
Neutravidin	Sigma-Aldrich	A2666
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A9187
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic))	Sigma-Aldrich	P0564
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)	Sigma-Aldrich	P0294