RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van heat shock protein 27 (HSP27)-specifiek klein interfererend RNA om de functie van HSP27 te beoordelen tijdens wondgenezing van het hoornvliesepitheel. RNA-interferentie is de beste methode om effectief genexpressie te onderdrukken om de eiwitfunctie in verschillende celtypen te onderzoeken.

Samenvatting

Klein interfererend RNA (siRNA) is een van de meest gebruikte methoden voor RNA-interferentie voor de kortstondige onderdrukking van eiwitcoderende genen. siRNA is een synthetische RNA-duplex die specifiek is gemaakt om een mRNA-transcript aan te vallen om de degradatie ervan te induceren en het is gebruikt om nieuwe paden in verschillende cellulaire processen te identificeren. Er zijn maar weinig rapporten over de rol van gefosforyleerde heat shock-eiwit 27 (HSP27) bij het genezingsproces van het hoornvliesepitheel. Hierbij werden gekweekte menselijke hoornvliesepitheelcellen verdeeld in een groep getransfecteerd met een willekeurige controle-siRNA en een groep getransfecteerd met HSP27-specifieke siRNA. Vervolgens werden scratch-geïnduceerde directionele wondgenezingsassays, western blotting en flowcytometrie uitgevoerd. We concluderen dat HSP27 rollen heeft bij het genezingsproces van het hoornvliesepitheel die mogelijk epitheelcel-apoptose en -migratie omvatten. Hier worden stapsgewijze beschrijvingen van de monstervoorbereiding en het onderzoeksprotocol gegeven.

Inleiding

Corneale epitheliale cellen (LME) continu afgestoten in traanfilm, terwijl ze tegelijkertijd vervangen door cellen van de limbus en corneale epitheliale basale lagen. ¹ verschillende extrinsieke stressoren kunnen de apoptose en afschilfering van CECs induceren. ² De heat shock eiwitten (HSP) zijn sterk geconserveerd en kunnen worden onderverdeeld in twee families op basis van molecuulgrootte. ³ de grootste HSP-familie omvat HSP90, HSP70 en HSP60 en de kleine familie omvat HSP27. ⁴ de fosforylatie van HSP27 speelt een belangrijke rol in celoverleving spelen en is vereist voor celmigratie vanwege de rol van dit eiwit in actine remodellering. ^5-7 Daarom hebben we geprobeerd om de mogelijke rol van HSP27 fosforylatie in CEC migratie en apoptose getest in een in vitro model van epitheliale wondgenezing.

RNA-interferentie (RNAi) met behulp van kleine of korte interfererende RNA (siRNA) heeft generated belangstelling voor zowel fundamenteel als toegepast biologie, omdat het mogelijk maakt de expressie van elk gen van belang worden overreden. ⁸ Hierin gebruikten we HSP27-specifiek siRNA om de bijdrage van HSP27 CEC wondgenezing en apoptose beoordelen. Traditionele werkwijzen voor RNAi gen knock-in cellen gebruiken synthetische RNA duplexen, waaronder twee niet-gemodificeerd 21-meer oligonucleotiden die kunnen worden samengesteld om siRNA's te maken. De RNAi siRNA dat we in deze studie is een eenvoudige en efficiënte methode om cellen te transfecteren, en dit reagens werkt met verschillende geïmmortaliseerde cellijnen. In deze studie tonen we de voor deze analyse methoden, met inbegrip van een scratch-geïnduceerde directionele wond assay, western blotting, siRNA transfectie assay, immunofluorescentietest, en flowcytometrie.

Protocol

1. Cell Line

1. Cultuur 10 ^6-telomerase geïmmortaliseerde humane corneale epitheelcellen (HCECs) in een 6-puts plaat (dichtheid: 1039,9 cellen / mm ²⁾ in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 atmosfeer via luchtwegepitheel groeimedium (BEGM) tot bereiken ze 95% samenvloeiing.

2. Western Blot Analyse Na het aanmaken van Epitheliale Scratch Wonden

1. Streak een steriele 200 ul pipetpunt over het oppervlak van een putje van confluente cultuur HCECs viermaal per schaaltje in een biologische veiligheidskast (klasse II, Type A2) en incubeer HCECs afzonderlijk in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 atmosfeer gedurende 1, 5, 10, 30, 60 en 120 min.
2. Gebruik een 6-wells plaat zes verschillende monsters volgens de incubatietijd na corneale epitheel verwonding.
3. Wassen gewonden HCEC monolagen driemaal met 1x PBS en voeg 2,0 ml BEGM aan elk putje.
4. Maak HCECs gebruik van 2ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) per putje gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 5 min in een 15 ml buis en zuig trypsine-EDTA met een 1 ml pipet.
5. Schorsen HCECs met 1 ml 1x PBS en overbrengen naar een 1,5 ml buis.
6. Centrifugeer HCECs bij 10.000 xg gedurende 15 sec en zuig 1x PBS onder toepassing van een 1 ml pipet.
7. Resuspendeer HCECs in 100 ul ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride [PMSF], proteaseremmers [1 pM pepstatine A, 1 uM leupeptine en 0,1 uM aprotinine] en 0,5% Triton X-100 [pH 7]) en goed mengen.
8. Incubeer cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellysis te induceren.
9. Centrifugeer lysaten bij 4 ° C bij 10.000 xg gedurende 15 min, en vervolgens over supernatanten vers 1,5 ml buisjes (90 gl aliquots) en bewaar ze bij -80 ° C.
10. Bepaal totale eiwitconcentraties van cellysaten met behulp van de Bradford protein assay. ⁹
11. Load 30 ug totaal cel eiwitten in een 10% of 12% acrylamide gel voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en daarna elektroforetisch overdracht gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose filters met een 200 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C te gebruiken in western blot assays.
12. Blok nitrocellulose filtermembranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur, voeg primaire konijnen polyklonale antilichamen tegen niet-gefosforyleerd HSP27 (1: 1000 verdunning) of primaire konijnen polyklonaal antilichaam tegen gefosforyleerd HSP27 (1 : 1000 verdunning) in 5% runderserumalbumine (BSA), en incubeer de membranen overnacht bij 4 ° C op een schudder.
13. Detecteren immuunreactieve banden middels mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn antilichamen (1: 10.000 verdunning) in 5% BSA na het wassen gedurende 10 minuten 3 keer met TBST.
14. Incubeer het membraan in de western blotting luminol reagentia (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membraan) gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
15. Verwijder het membraan uit reagens oplossing verwijdert overtollige vloeistof met een absorberende handdoek, en plaats in een plastic zeil protector.
16. Werken in een donkere kamer met een kluis licht, plaatsen bedekt membraan in een film cassette met eiwit zijde naar boven.
17. Plaats röntgenfilm bovenop membraan en blootgesteld gedurende 1 minuut.

3. siRNA Transfectie Assay ¹⁰

1. Cultuur HCECs bij 5 x 10 ⁵ cellen / putje in een 6-wells plaat in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 atmosfeer via BEGM totdat ze 95% confluentie bereiken.
2. Verdun de transfectiereagens (2,5 of 7,5 pl) met 100 ul verminderde serum medium voor transfectie (de verdunningsfactor was 41 of 14,3) en los de HSP27-specifieke en scrambled controle siRNA in 100 pl gereduceerd serum medium te creëren 10 of 50 nM HSP27-specifieke en scrambled siRNA controle.
3. Meng 100 μ; L siRNA oplossing met 100 gl verdunde transfectiereagens (1: 1 verhouding) en incuberen van het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg de siRNA-lipidecomplexen aan cellen. Dan na 4 uur veranderingsmedia voltooid BEGM en incubeer de cellen gedurende 2 dagen bij 37 ° C.
5. Analyseer getransfecteerde cellen door western blotting, zoals beschreven in de secties 4,1-4,7.

4. Western Blot Assay voor siRNA getransfecteerde cellen ¹¹

1. Extract HSP27-specifieke en scrambled controle-siRNA getransfecteerde HCECs in een biologische veiligheidskast met 100 ul ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), proteaseremmers en 0,5% Triton X-100, pH 7).
2. Incubeer cellen gedurende 30 minuten op ijs om cellysis te induceren.
3. Pellet lysaten bij 10.000 g gedurende 15 min en vervolgens over te dragen supernatanten frisse 1,5 ml tubes (90 gl aliquots) en bewaar ze bij -80 ° C.
4. Bepaal proteïneconcentraties van de cellysaten met behulp van de Bradford eiwit assay. ⁹
5. Laad monsters met gelijke hoeveelheden van de totale celeiwitten op een 10% of 12% acrylamidegel, onderwerpen de gel aan SDS-PAGE en elektroforetisch overdracht van de gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose filters met een 200 mA gedurende 1 uur bij 4 ° C gebruikt in western blot assays.
6. Blok nitrocellulose filtermembranen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur, voeg primaire antilichamen tegen gefosforyleerd en niet-gefosforyleerd HSP27 (1: 1000 verdunning), gefosforyleerde Akt (1: 1000 verdunning), niet-gefosforyleerde Akt (1: 1000 verdunning gebruikt als celoverleving marker), Bcl-2-geassocieerde X eiwit (1: 1000 verdunning gebruikt als een pro-apoptotisch eiwit) en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200 verdunning gebruikt als beladingscontrole) in 5% runderserumalbumine (BSA), enIncubeer de membranen overnacht bij 4 ° C op een schudder.
7. Detecteren immuunreactieve banden middels mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn antilichamen (1: 10.000 verdunning) in 5% BSA na 3 keer wassen met TBST, 10 min per wasbeurt.
8. Incubeer het membraan in de western blotting luminol reagentia (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membraan) gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
9. Verwijder het membraan uit reagens oplossing verwijdert overtollige vloeistof met een absorberende handdoek, en plaats in een plastic zeil protector.
10. Werken in een donkere kamer met een kluis licht, plaatst het overdekte membraan in een film cassette met het eiwit zijde naar boven.
11. Plaats röntgenfilm bovenop het membraan en blootgesteld gedurende 1 minuut.

5. Scratch-geïnduceerde Directional verwonden Assay Evaluatie van de Cel Migratie ¹²

1. In een biologisch veiligheidskabinet, maak een wond door over het oppervlak te slepen een steriele pipet tip van een goed die confluente culturen vanHSP27-specifieke siRNA getransfecteerde of roerei controle-siRNA getransfecteerde HCECs.
2. Onmiddellijk na verwonding, was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en te onderhouden in BEGM culturen in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 atmosfeer gedurende 24 uur na verwonding.
3. Fotograferen HCEC beelden met behulp van een rechtopstaande microscoop bij 100X vergroting 24 uur na verwonding en uit te voeren achtergrond afvlakking met behulp van de Filter commando in beeldanalyse software.
4. Met behulp van de opdracht Select Metingen, bepalen de Area of ​​Interest (AOI) met dezelfde grootte veelhoekige vorm die loodrecht kan dekken van begin tot eind van de oorspronkelijke wond, en het bepalen van drie verschillende AOI in het gewonde gebied van elk monster.
5. Automatisch tellen het aantal cellen in elk veld met behulp van de graaf / Size Maatregel menu-opties.

6. Flowcytometrieanalyse van apoptose

1. Cultuur HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde en controleiRNA getransfecteerde HCECs bevattende 10 nM siRNA elk bij een concentratie van 5 x 10 ⁵ cellen / putje in 6-putjesplaten tot de cellen bereikt 95% confluentie in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 atmosfeer in BEGM.
2. Los HCECs gebruik 2 ml 0,25% trypsine-EDTA per putje gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 5 min in een 15 ml buis en zuig trypsine-EDTA met een 1 ml pipet.
3. Was de cellen tweemaal met koud PBS en resuspendeer de cellen in 1x bindingsbuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl en 25 mM _CaCl2) bij een concentratie van 10 ⁶ cellen / ml.
4. Transfer 100 ul celsuspensie (1 x 10 ⁵ cellen) in een 5 ml cultuur buis.
5. Voeg 5 ul fluorescéine isothiocyanaat-geconjugeerd annexine V en 5 ui propidium iodide.
6. Voorzichtig vortex de cellen en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
7. Voeg 200 ul van 1 x bindingsbuffer aan elke buis en analyseren van de cellen door een stroom cytometer binnen 1 uur.

Resultaten

De expressie van HSP27 gefosforyleerde significant verhoogd 5, 10 en 30 minuten na kras verwonding vergeleken met verwonde HCECs ^13. Western blot analyse toonde dat de expressie van HSP27 en gefosforyleerde Akt gefosforyleerd waren beide aanzienlijk verminderd, terwijl de expressie van Bax aanzienlijk HSP27-specifieke siRNA getransfecteerde HCECs (Figuur 1A-E) verhoogd. De gefosforyleerd HSP27 expressie werd verminderd met 30% en 40% in 10 nm en 50 nm van HSP2...

Discussie

In deze huidige studie hebben we de potentiële rol van HSP27 in wondgenezing van het hoornvliesepitheel geëvalueerd met behulp van in vitro benaderingen. De cruciale stappen omvatten siRNA-transfectie voor HSP27 knock-down om de functie van HSP27 in cellen die aan stress werden blootgesteld te observeren. Opmerkelijk was dat een rol voor HSP27 werd onthuld door deze experimenten in epitheelcelmigratie en apoptose tijdens wondgenezing van het hoornvliesepitheel. In tegenstelling tot eerdere studies¹⁰ d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biologische veiligheidskast	CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republiek Korea	CHC-777A2-06	Klasse II, Type A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; versleutelde controle-siRNA en HSP27-specifiekere siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Bronchiaal epitheel groeimedium
Protease remmer	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340,P7626	1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinine
Bradford eiwit assay	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Bradford eiwit assay
Nitrocellulose filters	Amersham, Little Chalfont, UK	RPN3032D	Western blotting membraan
Non-gefosforyleerd HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	1:1,000 verdunning (Totaal HSP27)
Gefosforyleerd HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	1:1,000 verdunning HSP27 werd gefosforyleerd bij Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagens	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Transfectiereagens
Gefosforyleerd Akt (Ser473)	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	Nr. 4060	1:1,000 verdunning Akt werd gefosforyleerd bij Ser473 (celoverlevingsmarker)
Non-gefosforyleerd Akt	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	Nr. 4061	1:1,000 verdunning (Totaal Akt)
Bcl-2-geassocieerd X-eiwit	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	Nr. 4062	1:1,000 (anti-apoptotisch eiwitmarker)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	Nr. 4063	1:1,000 ladingscontrolemarker (huishoudgen)
Paardenradijs peroxidase-geconjugeerde geiten anti-konijn antilichamen	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	1:10.000 verdunning
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	gereduceerd serummedium voor transfectie
Beeldanalysesoftware	Olympus, Inc., Tokyo, Japan	Image-Pro Plus 5.0
Skim melkpoeder	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Duitsland	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	Nr.-0497
Natriumchloride	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	Nr.-0241
Zes wel cultuurbord	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35,00 mm diameter / wel
24-wel cultuurbak	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Orbitaal shaker	N-Bioteck, Inc., Seoul, Zuid-Korea	NB1015
Rundserum albumine	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Flow cytometry
X-Ray Film	Kodak, Rochester, NY		Medische X-Ray Cassette met Green 400 Scherm
Western blotting luminol reagens	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547