Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Samenvatting

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Samenvatting

FINA, filtratie isolatie van nucleïnezuren, is een nieuwe extractie methode die gebruik maakt van verticale filtering via een scheidingsmembraan en absorberend kussen cellulaire DNA uit volbloed extract in minder dan 2 minuten. Het bloedmonster wordt behandeld met detergens, kort gemengd en pipet aangebracht op het scheidingsmembraan. Het lysaat transporteert in de blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van het scheidingsmembraan. Het geëxtraheerde DNA wordt vastgehouden op het membraan tijdens een eenvoudige wasstap waarin PCR-remmers zijn goddelozen in het absorberende blotting pad. Het membraan dat de ingevangen DNA wordt vervolgens toegevoegd aan de PCR-reactie zonder verdere zuivering. Deze eenvoudige methode vereist geen laboratorium uitrusting en kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd met goedkope laboratorium benodigdheden. Hier beschrijven we een protocol voor zeer gevoelige detectie en kwantificering van HIV-1 provirale DNA van 100 gl volbloed als model voor beginFant diagnose van HIV die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere genetische doelwitten.

Inleiding

Verschillende rapporten hebben de ontwikkeling van papier- of een membraan extractiemethoden voor gebruik behandeld in point-of-care (POC) inrichtingen ^1-5 met als doel de uitstekende gevoeligheid en specificiteit van moleculaire diagnostiek voor alle. De World Health Organization (WHO) Seksueel Overdraagbare Aandoeningen Diagnostics initiatief bedacht de term VERZEKERD (Betaalbaar, gevoelig, specifiek, Gebruiksvriendelijk, Snel en Robuust, Apparatuur-vrij en geleverd aan degenen die het nodig hebben) om te beschrijven de ideale kenmerken van een POC -test ^6. Van deze richtlijnen, de apparatuur-vrije eigenschap is bijzonder moeilijk te bereiken voor moleculaire diagnostiek. Toch zal elke innovatie op het gebied van de doelstelling van het bereiken van die in de meeste behoefte te bevorderen, en er is hoop voor verbeteringen op korte termijn in testprestaties door aanpassing van bestaande technologie ^7.

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het extraheren van DNA uit vol bloeddat betekent complexe chemie of laboratorium instrumentatie niet nodig. De FINA (filtratie isolatie van nucleïnezuren) monstervoorbereiding methode werd oorspronkelijk ontwikkeld om leukocyt DNA uit volbloed extraheren om de HIV-1 provirus detecteren van een monster te beantwoorden point-of-care (POC) kwantitatieve PCR (qPCR) vroeg zuigeling diagnostische (EID) platform voor gebruik in beperkte resource-instellingen ^8-11. FINA extractie verschilt van conventionele zuiveringsmethoden die silicamembranen of met siliciumdioxide beklede paramagnetische deeltjes om reversibel binden van DNA in de aanwezigheid van chaotrope middelen ^12. In plaats daarvan gebruikt FINA verticale filtratie via een scheidingsmembraan om cellulaire DNA uit volbloed direct extraheren. Het membraan dat de ingevangen DNA kan direct in een PCR-buis en ofwel direct gebruikt in een PCR-reactie of lucht gedroogd latere amplificatie ^9. Nr chaotrope middelen, fenol, of alcoholen gebruikt in de monstername, EliminaTing het uitgebreid wassen stappen die nodig zijn om krachtige qPCR remmers afgeleid van het extractieproces ^13,14 verwijderen.

De FINA membraan kan zowel cellen ⁹ of genomisch DNA vrijgemaakt door cellysis ¹¹ voordat het monster wordt toegevoegd aan het membraan vast te leggen. Voor de cel opname, wordt bloed direct toegevoegd aan het membraan. De cellen worden vervolgens in het membraan gelyseerd door toevoeging van 10 mM NaOH. Het voordeel van deze methode is dat het gaat slechts 3 stappen: 1) toevoegen van het monster; 2) cellysis / was en 3) filter disk plaatsing in qPCR buis. Het nadeel van deze methode is dat het membraan slechts een bepaald aantal cellen direct evenredig met de diameter van de membraanschijf kan bevatten. De detectielimiet vereist voor EID bereikt, wordt 100 gl volbloed vereist voor monster ingang die een filter die te groot in een qPCR buis geplaatst meebrengt. Lyseren van de bloedcellen met detergent voor het toevoegen van het monster aan de collectiemembraan ligt een verwerkingsstap, maar maakt het gebruik van een kleinere filter voor dezelfde steekproef. We konden hoge reproduceerbaarheid, enkel exemplaar detectie en kwantificering van slechts 10 kopieën van HIV-1 provirale DNA van 100 pl bloed af met de testconfiguratie ¹¹ tonen.

In dit rapport beschrijven we de FINA protocol zoals oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik in het laboratorium. Het membraan / filter sandwich zogenaamde FINA monstervoorbereiding module kunnen worden bereid in grote partijen en opgeslagen voor later gebruik. Wanneer specimens worden geëxtraheerd dit duurt 2 min en kunnen worden uitgevoerd in verschillende grootte batches. De qPCR kan onmiddellijk worden uitgevoerd of de filters die de ingebedde DNA kan worden opgeslagen totdat het handig om qPCR voeren. Deze methode is erg handig voor routine-analyse van monsters in zowel lage als hoge resource-instellingen.

Protocol

Ethiek statement: De gehele bloedmonsters die in deze studie worden niet beschouwd als onderzoek waarbij menselijke proefpersonen zijn. De monsters werden verkregen voor klinische diagnostische doeleinden, die zijn voldaan en het resterende gedeelte van deze monsters werd bepaald de FINA onderzoekstest. De monsters werden zodanig dat de onderzoekers waren niet in staat om de identiteit van personen gemakkelijk vaststellen gecodeerd.

1. Voorbereiding van de FINA Monstervoorbereiding Module

1. Bereid vloeipapier pad door het snijden van een 35 x 35 mm ² van een 2,6 mm dik 100% katoen pad. Snijd één pad per exemplaar.
2. Bereid plastic paraffine folie met een papieren beschermlaag door een snij stuk paraffine film (25 mm (h) van 50 mm (w)) en vervolgens ponsen een gat 7,14 mm diameter in het midden van de band met een hamer aangedreven perforator. Bereid een tape per exemplaar.
3. Bereid een gebonden glas bloed separator membraan (capture membraan) disk door ponsen een cirkel met een diameter van 8,35 mmmet een hamer gedreven perforator. Punch één schijf per exemplaar. De schijf heeft een partikelretentie vermogen van 2,3 urn.
4. Monteer de FINA monstervoorbereiding module door het plaatsen van de vangst schijf in het midden van de blotting pad met behulp van een tang. Plaats de paraffine film tape over de vangst schijf, zodat het gat van de paraffine band verlaat het centrum van de vangst schijf blootgesteld.
5. Zorgen voor maximaal contact tussen de schijf en de blotting pad door het uitrekken van de paraffine tape iets naar blotting pad te dekken en stevig indrukken van de paraffine tape te houden aan de blotting pad om alle randen van de schijf.
6. Maak zoveel modules, dat bij experiment of voorraad voor toekomstig gebruik.

2. Voorbereiding van de qPCR Tube

1. Bereid een 5,1 mm schijf tape dat de cel vangen membraan verankeren aan de zijkant van de buis te voorkomen qPCR het membraan blokkeert de fluorescentiedetectie door ponsen een cirkel dubbel beklede polyester de diagnostische tape met een hamer gedreven punch uit een plaat van de band. Bereid een tape schijf per exemplaar.
2. Verwijder de ene kant van de sticker liner van de tape. Plaats de tape in een 200 ui PCR tube, plakken het op één zijde en naar de bodem van de buis. Verwijder de tweede sticker liner. De buis is nu klaar om voorbereid schijf te ontvangen.
3. Produceren vele buizen, dat bij experiment of voorraad voor toekomstig gebruik.

3. Contrive Blood Specimen

Let op: Als een echt monster wordt voorbereid, ga dan naar stap 4.

1. Dooi 8E5-LAV cellen ¹⁵ herbergen een enkele kopie van het HIV-1 provirus verkregen uit de Virologie Quality Assurance Laboratory (VQA; Rush Presbyterian / St Luke's Medical Center, Chicago, IL.).
   Opmerking: Deze worden opgeslagen als bevroren celpellets in een concentratie van 4000 cellen / ul. Celgetal werd geverifieerd zoals eerder ⁹ beschreven.
2. Bereid serial verdunning in invriesmedium (90% foetaal runderserum, 10% dimethylsulfoxide) concentraties variërend 1-400 cellen / ul.
3. Pipet 10 pi cellen uit elk van de seriële verdunningen in een microcentrifugebuis. Voeg 100 ul van verse HIV-1 negatieve EDTA behandeld volbloed monster aan elke buis om een ​​standaard curve van 8E5-LAV kopie nummers 10-4,000 creëren. Meng door voorzichtig flicking de bodem van de buis 5 maal.

4. Voer FINA Extraction

1. Lyse bloedcellen door het toevoegen van Triton-X100) tot een uiteindelijke concentratie van 1% (11 ui 10% Triton-X100 bij 110 gl volbloed en cellen uit stap 3.3).
2. Meng door voorzichtig flicking de bodem van de buis 5 maal. Het bloed moet doorzichtig rood.
3. Pipet al het bloedmonster op de vangst schijf.
   Opmerking: Een waterdichte afdichting tussen de paraffine tape en de vangst membraan zorgt ervoor dat het bloed stroomt door het membraan, en een goed contact tussen de vangst membrane en deppen pad montage zorgt voor een snelle steekproef wicking.
4. Laat het monster om te genieten door het filter.
   Opmerking: Het bloed lysaat wieken in het blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van de schijf opname. Het lysaat is gedrenkt in de disk als het mat verschijnt.
5. Voeg 600-1000 pi 10 mM NaOH druppelsgewijs op de vangst schijf.
   Opmerking: De wasbuffer kan ook worden toegevoegd als een bulk toevoeging van 600 pi. De buffer zal een druppel op de hydrofobe paraffine band vormen en lont door het gat om de schijf ongeveer 20 sec. Het filter zal veranderen van rood naar wit te geven klaring van hemoglobine.
6. Scheid de schijf uit het pad blotting met een pincet en de schijf gelden voor de band in de bereide PCR buis. Als er een rode kleur op het filter voeg 50-100 ul wasbuffer het filter te verwijderen alvorens deze in het buisje.
   Let op: Zelden overdruk toegepast tijdens de bereiding vande FINA modules resulteert in een verdeling van het membraan lagen tijdens scheiding van de blotting pad. Gooi deze schijven en voor te bereiden een vers monster.
7. Nadat het filter is geplaatst in de PCR-buis, analyseert de monsters meteen. Als alternatief, droge overnachting in een doos met calciumsulfaat droogmiddel, dan de dop en plaats in een folie zakje met silica droogmiddel en op te slaan totdat klaar voor analyse.

5. qPCR Reaction

1. Bereid 100 pi qPCR master mix per reactie met behulp van HIV specifieke primers en sondes zoals eerder beschreven ^9,11. Een in- amplificatiecontrole te controleren op de aanwezigheid van remmers en amplificatie te verifiëren dat een negatief monster een echte negatieve. Wees er zeker van dat filter volledig bedekt is met master mix en dat het filter blijft bevestigd naar de andere kant van de buis tijdens de gehele reactie.
2. Amplificatie uit te voeren met een real-time PCR inrichting zoals hierboven beschreven ^9.

Resultaten

De workflow voor het extraheren van proviraal DNA uit vol bloed waaraan 8E5-LAV-cellen wordt getoond in Figuur 1. Figuur 2 toont de FINA monster module en bereid qPCR buis. Deze werkwijze maakt efficiënte amplificatie van HIV-1 provirus van 8E5-LAV cellen bij verschillende kopie-aantallen, zoals in de standaardcurve van gezochte monsters (figuur 3). PCR had een rendement van 103%, zoals berekend uit effect = -1 + 10 ^{(-1 / helling).<...}

Discussie

EID gekoppeld aan een snelle behandeling toegang is aangetoond kindersterfte verminderen door HIV infectie ^16. Vanwege de aanhoudende maternale antilichamen in het bloed van een kind, zijn snelle HIV antilichamentests beperkt nut bij het bepalen van de status van HIV-blootgestelde zuigelingen. De WHO beveelt aan dat alle baby's van HIV-1-positieve moeders moeten worden getest bij 4-6 weken oud, met een virologisch onderzoek ^17. We hebben gemeld de ontwikkeling van een test voor de detectie en k...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fusion 5	GE Healthcare Life Sciences	8151-9915
707 blotting pad	VWR International	28298-014
PARAFILM M	VWR International	52858-000
3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape	3M Medical Specialties	9965
200 µl qPCR strip tubes	Agilent	401428
optical strip caps	Agilent	401425
Mx3005p qPCR System	Agilent	401456
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	A.C.S. Reagent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	BioXtra
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	for molecular biology
fetal bovine serum, certified, U.S. origin	Thermo Fisher Scientific	16000-044
Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm)	McMaster Carr	3424A16
Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm)	McMaster Carr	3424A19
Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm)	McMaster Carr	3424A23