Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Samenvatting

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Samenvatting

Dendritische cellen (DC's) zijn antigeende presenteercellen van het immuunsysteem die een cruciale rol spelen bij lymfocytresponsen, afweermechanismen van de gastheer en de pathogenese van ontstekingen. Isoleren en bestuderen van DC's is belangrijk geweest in biologisch onderzoek vanwege hun onderscheidende kenmerken. Hoewel ze essentiële sleutelfiguren in het immuunsysteem zijn, zijn DC's zeer zeldzaam in het bloed en maken ze ongeveer 0,1 - 1% uit van het totaal aantal mononucleaire bloedcellen. Daarom zijn alternatieven voor isolatiemethoden afhankelijk van de differentiatie van DC's uit monocyten geïsoleerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's). Het gebruik van geschikte isolatietechnieken die eenvoud, betaalbaarheid, hoge zuiverheid en hoge opbrengst aan cellen combineren, is van essentieel belang. In het huidige onderzoek zullen twee verschillende methoden voor de generatie van DC's worden vergeleken. Monocyten werden geselecteerd door aanhechting of negatief verrijkt met behulp van magnetische scheidingsprocedure, gevolgd door differentiatie in DC's met IL-4 en GM-CSF. Monocyten en MDDC-levensvatbaarheid, proliferatie en fenotypeer werden beoordeeld met behulp van levensvatbaarheidskleurstoffen, MTT-test en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsanalyse door beeldstromende cytometrie. Hoewel de magnetische scheidingsmethode een significant hoger percentage monocyten opleverde met een hogere proliferatiecapaciteit in vergelijking met de adhesiemethode, hebben de bevindingen de mogelijkheid van beide technieken aangetoond om gelijktijdig monocyten te genereren die na zeven dagen in cultuur in staat zijn te prolifereren en te differentiëren in levensvatbare CD11c+ MDDC's. Beide methoden leverden > 70% CD11c+ MDDC's op. Daarom bieden onze resultaten inzichten die bijdragen aan de ontwikkeling van betrouwbare methoden voor isolatie en karakterisering van humane DC's.

Inleiding

Dendritische cellen (DCs) zijn essentiële mediatoren van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Zij functioneren primaire immuunreacties induceren en de ontwikkeling van immunologische geheugen vergemakkelijken. Deze cellen zijn primair verantwoordelijk voor antigen capture, migratie en T-cel stimulatie en worden derhalve aangeduid als professionele antigeen presenterende cellen (APC's) ¹ .Manipulation van DCs kan worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeksgebieden en de klinische setting voor de behandeling van verschillende ontstekingsziekten zoals HIV ^{6,7, 8} kanker, auto-immuunziekten ⁹ en allergische reacties ^10. DC's worden ook gebruikt voor drugsmisbruik onderzoek om onbekende mechanismen en paden, zoals die in verband met afhankelijkheid van alcohol ^11-14, drugsverslaving ^13,15, en de combinatie van HIV-infectie en drugsmisbruik ^16-19 op te lossen. Deze lopende studies en toekomstig onderzoek studies in het gebied van immunologie maken vitro generatie DCs van groot belang voor onderzoek. Er zijn echter een aantal problemen van de isolatie DCs uit menselijk bloed zij slechts 0,1 uitmaken - 1% van de totale mononucleaire cellen ^20.

Tot op heden enkele gevestigde werkwijzen voor het genereren van DCs in vitro uit kunststof of glas hechting van monocyten ^21,22, dichtheid gradiënt centrifugatie ²³ specifieke merker gebaseerde scheiding zoals magnetische geactiveerde celsortering ^22, fluorescent geactiveerde celsortering ^24, positieve selectie van CD14 + monocyten met behulp van dextran beklede magnetische nanodeeltjes ²⁵ en snelle isolatie van sterk gezuiverde monocyten met behulp van volledig geautomatiseerde negatieve celselectie ^26. De beste methode van keuze blijft controversieel. Daarom DC generatietechnieken verbeteren, zijn verschillende methoden ontwikkeld waarbijde zuiverheid van deze cellen sterk vergroten door differentiatie van gezuiverde CD34 + progenitor cellen en monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) ^27. Zoals voorafgaand genoemd, een veel gebruikte en populaire werkwijze voor het genereren van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) is het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) ^21,22,27 verkennen. De hechting werkwijze is een snelle en eenvoudige methode die het gebruik van complexe apparatuur vereist. Echter enige nadelen van deze werkwijze omvatten lymfocyt besmetting geringe flexibiliteit en monocyt voorbijgaande manipulatie ^28. Een alternatieve methode om de hechting methode is de magnetische isolatie van monocyten van totaal PBMC's, met name het gebruik van een menselijke monocyt verrijking kit, die is ontworpen om monocyten uit PBMC geïsoleerd door negatieve selectie ^26. Tijdens deze procedure worden ongewenste cellen gericht te verwijderen met tetrameerantilichaamcomplexen en dextran-beklede magnetische deeltjes. Het voordeel van deze isolatiewerkwijze is dat de ongewenste gemerkte cellen worden gescheiden met een magneet terwijl doelcellen vrij kan worden afgegoten in een nieuwe buis zonder de noodzaak voor kolommen. Tot op heden, door de beschikbaarheid van specifieke monoklonale antilichamen die unieke celpopulaties kunnen etiketteren, de magnetische scheidingstechniek is geworden, niet alleen een extra methode, maar een noodzaak voor het isoleren van zeldzame cellen op het gebied van immunologie. Bijvoorbeeld technieken zoals magnetische celsortering met een commercieel verkrijgbare paramagnetische MACS-nanodeeltjes hebben de ontwikkeling mogelijk van nieuwe benaderingen voor onderzoek en klinische toepassingen ^22,29. Bovendien hebben recente studies vergelijken DC generatie van monocyten hechting en MACS technologie methoden een hogere DC zuiverheid en levensvatbaarheid aangetoond met behulp van MACS gescheiden monocyten ^22,30.

De huidige studie presenteerteen vergelijking tussen twee werkwijzen voor het genereren van humane DCs van monocyten geïsoleerd uit PBMC: 1) isolatie van monocyt aanhechting en 2) monocyt isolatie door negatieve selectie met behulp van een commerciële kit menselijke monocyt verrijking. Deze studie geeft aanwijzingen dat de negatieve selectie magnetische scheidingswerkwijze om monocyten te isoleren genereert de hoogste opbrengst van monocyten geen significant verschil in de levensvatbaarheid van monocyten in vergelijking met monocyten geïsoleerd door hechting methode. Op zijn beurt, na zeven dagen, de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding onderverdeeld in MDDCs duidelijk hogere prolifereren en grotere hoeveelheid cellen die dubbel positief (CD11c + / CD14 +) fenotype zonder dat MDDC levensvatbaarheid. Kortom, de huidige studie verschilt van de vorige studies bovengenoemde aangezien toont het vermogen van beide technieken gelijktijdig genereren monocyten die kunnen prolifereren en differentiëren tot zijn CD11c +MDDCs (> 70%) na zeven dagen in de cultuur, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid. Daarnaast is de huidige benadering voorziet voor het eerst karakterisatie van verschillende CD11c / CD14 MDDCs populaties door beeldvorming flowcytometrie.

Kortom, omdat DCs een brandpunt rol ten aanzien van onderzoek op het gebied van de immunologie spelen, verschillende parameters moet rekening worden gehouden bij het overwegen van hoe ze worden afgeleid en welke methoden worden gebruikt voor het isoleren en kweken ze in vitro. Daarom is deze studie heeft tot doel inzicht te verschaffen over twee verschillende methoden van monocyten isolatie en hoe deze methoden differentieel invloed monocyten levensvatbaarheid en de opbrengst uiteindelijk van invloed zijn dendritische levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie en fenotype. Deze bevindingen sterk zal bijdragen aan het gebied van immunologie en zal een gedetailleerd protocol van DC isolatie, zuivering en karakterisatie verschaffen.

Protocol

Over het algemeen menselijk bloed studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van FIU, IRB protocol goedkeuring # IRB-13-0440 goedgekeurd. Human leukopaks werden gekocht van de gemeenschap bloedbank in Miami, FL.

1. Isolatie van PBMC door Standard Density Gradient Technique

1. Voer een 1: 1 verdunning van bloed met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing in een T75 kolf.
2. Pipetteer 15 ml van dichtheidsgradiënt oplossing in 50 ml centrifugebuizen en voorzichtig laag (25 - 30 ml / tube) van het verdunde bloed over dit verloop.
3. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij versnelling van 1 en vertraging van 0.
4. Na centrifugeren, verzamel de grensvlaklaag (witte bloedcellen) in een nieuwe 50 ml centrifugebuis en wassen cellen tweemaal in PBS (3 min bij 1080 x g). Gooi supernatant elke keer.
5. Behandel cellen met ammonium-chloride-kalium lyseren (ACK) buffer (om rode bloedcellen te lyseren). Voeg 10 ml buffer encubate gedurende 15 min bij 4 ° C.
6. Was de cellen tweemaal met PBS, centrifugeer gedurende 3 min bij 1080 x g en verwijder het supernatant elke keer.
7. Sla de korrel, die de PBMC's zal bevatten.
8. Doorgaan met monocyt zuiveringswerkwijze van keuze.

2. monocyten Zuivering door Adherence Method

1. Bereid volledige celcultuur medium dat L-glutamine (300 mg / ml) en aangevuld met penicilline (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) en 10% foetaal runderserum.
2. Sta PBMC te houden gedurende ongeveer 2 uur door ze te kweken in een T75 kolf bij een concentratie van 5 x 10 ⁷ cellen per 10 ml compleet medium bij 37 ° C en 5% _CO2 in een bevochtigde incubator.
3. Na incubatie verwijdert niet-hechtende cellen van drijvende kweekfles en voorzichtig te wassen hechtende cellen tweemaal met PBS.
4. Incubeer hechtende cellen volledig celkweekmedium aangevuld met 2 pl / ml humaan granulocyt-macrophage-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 4 (IL-4) opgeslagen bij een voorraad concentratie van 10 ug / ml.
5. Verander de helft van het medium en vul cytokines elke 48 uur.
6. Laat 5-7 dagen voor de differentiatie van monocyten in MDDCs.

3. monocyten Zuivering door magnetische scheidingswerkwijze

1. Verzamelen PBMC van standaard dichtheidsgradiënt techniek, giet in een 5 ml polystyreen buis en resuspendeer in PBS buffer bij een concentratie van cellen / ml.
2. Voeg menselijke monocyt verrijkingscocktail gebruik 50 ul / ml cellen, goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
3. Na incubatie voeg magnetische deeltjes middels 50 ul / ml cellen, goed mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
4. Breng celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml door toevoeging van PBS buffer, meng goed door en neer te pipetteren 2-3 keer.
5. Plaats de polystyreen buis zonder kap in het magnetisch apparaat en weggezet bij kamertemperatuur 2.5 minuten.
6. Na incubatie en in één vloeiende beweging, halen de magneet en giet de gewenste gezuiverde monocyten fractie in een schone 50 ml centrifugebuis.
7. Incubeer hechtende cellen volledig celkweekmedium aangevuld met 2 pl / ml humaan granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine 4 (IL-4) opgeslagen bij een voorraad concentratie van 10 ug / ml.
8. Elke 48 uur, veranderen de helft van het medium, spin down bij 1.080 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer pellet met nieuwe media (CRPMI) en cytokines.
9. Laat 5-7 dagen voor de differentiatie van monocyten in MDDCs.

4. trypanblauwexclusie levensvatbaarheid Assay

Opmerking: Gebruik deze techniek om de cel opbrengst en de levensvatbaarheid van PBMCs, monocyten en MDDCs verkrijgen.

1. Oogst cellen met standaard trypsine-EDTA en voer wassen van de kolven en de celpellet middels PBS. Afhankelijk van de grootte van de pellet, reschorsen 5-10 ml PBS om de pellet op te lossen.
2. In een micro-centrifugebuis Voer een 1: 1 verdunning van trypan blauw reagens verdund celpellet.
3. Vanuit deze mix, aliquot 10 pi in een cel tellen glijbaan en lezen resultaten met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter volgens het protocol van de fabrikant. Als een geautomatiseerde celgetalmeter niet beschikbaar is, een soortgelijke cellen is mogelijk met een hemocytometer of handmatige teller.

5. MTT assay

1. Plaat cellen bij een concentratie van 4 x 10 ^4/100 gl volledig medium in elk putje in een 96-well plaat. Laat 24 uur voor de cellen aan te passen aan de cultuur.
2. Incubeer en uitvoeren aflezingen bij respectievelijk 0 (dag 0), 36 (dag 3) en 84 (dag 7) uur.
3. Bij voltooiing van de gewenste incubatie, verwijder de media en te vervangen door 100 ul van PBS alleen.
4. Bereid 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide oplossing (MTT) (5 mg / ml) door toevoeging van 10 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) aan 1 g natriumdodecylsulfaat (SDS).
5. Voeg 10 ul (5 mg / ml) MTT-oplossing aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 extra uren.
6. Na incubatie, verwijder supernatanten die PBS en onbekeerde MTT mengsel (geel-kleur oplossing) bevatten.
7. Voeg 100 pl SDS-DMSO oplossing in elk putje en incubeer gedurende een extra uur.
8. Lees absorptie bij 540 nm met een microplaat reader.

6. celoppervlak kleuring Analyse door Imaging flowcytometrie

1. Na 7 dagen differentiatie van gezuiverde monocyten, afzien 1x10 ⁶ cellen hoeveelheden van de van monocyten afgeleide dendritische cellen in het juiste aantal 1,5 ml buizen.
2. Start celoppervlak kleuring blokkeert cellen middels 50 pl door hitte geïnactiveerd (HI) humaan serum, incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
3. Na incubatie Centrifugeer cellen bij 720 g gedurende 5 min, gooi supernatant.
4. Om pelle celt, voeg respectieve fluorochroom-geconjugeerde antilichamen (bijvoorbeeld anti-CD 11 c of anti-CD14) en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten beschermd tegen licht. In afzonderlijke buizen, bereiden single-fluorochroom gekleurde samples / ml), omdat ze nodig zijn voor compensatie.
5. Na incubatie, wassen cellen tweemaal in 1 ml PBS buffer en centrifugeer telkens bij 720 xg gedurende 5 minuten.
6. Het houden van cellen beschermd tegen licht, opnieuw te schorten in PBS buffer bij een concentratie van cellen / 100 pl voor flowcytometrie-analyse.
7. Om hek aan levensvatbare cellen, voeg 1 pl DAPI aan elke buis vóór het verwerven van de cellen op de cel imaging flowcytometrie instrument volgens de instructies van de fabrikant.

7. Statistische analyse

1. Input alle gegevens in een spreadsheet.
2. Vergelijk resultaten middels t-test van de student en / of one-way ANOVA waar nodig.
3. Beschouw verschillen statistisch significant als p <0,05 is.

Resultaten

Monocyten Yield door magnetische scheiding is hoger in vergelijking met monocyten Yield door Adherence Method

Gegevens in Figuur 1 tonen PBMC en monocyten celtellingen door de trypan blauw exclusie werkwijze op de dag van isolatie van PBMC en scheiding van monocyten. Gemiddeld monocyten geïsoleerd door hechting werkwijze voor ongeveer 6,2 procent van de totale PBMCs terwijl monocyten geï...

Discussie

Gebaseerd op de bekende problemen isoleren en het genereren MDDCs uit humaan bloed, deze studie gericht op een uitgebreide vergelijking van twee gevestigde werkwijzen voor het genereren van MDDCs verschaffen. De eerste methode vergeleken is een gevestigde traditionele werkwijze voor het MDDCs door gebruik van het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) ^21,22,27. De hechting werkwijze is snel en kostenbesparend, en niet het gebruik van ingewikkelde apparatuur. Echter, een aantal...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	Moet bij RT worden gebruikt
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	10010-023
ACK Lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
RPMI 1640 medium	Life Technologies	22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
RoboSep buffer	StemCell	20104
EasySep Human monocyte enrichment kit	StemCell	19059
TC20 Automated cell counter	Bio-Rad	145-0101
FITC-Dextran	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%)	Life Technologies	15250-061
Synergy 2 multi-mode reader	Biotek	7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT)	Sigma Aldrich	X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS)	Sigma Aldrich	D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)	Sigma Aldrich	m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO)	Sigma Aldrich	P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum	Chemicon	S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Accuri	653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer	EMD Millipore	100300