Methodenartikel

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

DOI:

10.3791/54300

⸱

27 september 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het laatste decennium is er een opleving in het gebruik van plantaardige protoplasten die variëren van model soort tot soort gewas, voor de analyse van signaaloverdracht, transcriptionele regulatorische netwerken, genexpressie, genoom-editing, en gen-silencing is geweest. Bovendien is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de regeneratie van planten uit protoplasten, die nog meer belangstelling voor het gebruik van deze systemen voor plantengenomics heeft gegenereerd. In dit werk is een protocol ontwikkeld voor de automatisering van protoplastisolatie en transformatie van een 'Bright Yellow' 2 (BY-2) tabak schorsing cultuur met behulp van een robot platform. De transformatie procedures zijn gevalideerd met een oranje fluorescerend eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) onder controle van de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (35S). OFP expressie in protoplasten werd bevestigd door epifluorescentie microscopie. Analyses omvatte ook protoplast efficiëntie van de productie methoden waarbij propidium jodide. Tenslotte werden goedkope food-grade enzymen die voor de protoplast isolatiewerkwijze, omzeilen de noodzaak van lab-klasse enzymen die kosten prohibitief in high-throughput geautomatiseerde protoplastisolatie en analyse. Op basis van het protocol ontwikkeld in dit werk, kan de volledige procedure van protoplastisolatie transformatie worden uitgevoerd in minder dan 4 uur, zonder enige inbreng van de operator. Terwijl de ontwikkelde in dit werk protocol werd gevalideerd met de BY-2 celkweek, moeten de procedures en methodes vertaalbaar naar alle planten schorsing cultuur / protoplast-systeem, dat de versnelling van het gewas genomics onderzoek moet mogelijk te maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten 1 te overwinnen, schenken herbicide weerstand 2, overleggen droogte 3,4 en zouttolerantie 5 geweest, herbivorie 6 te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst 7 en celwand weerspannigheid verlagen 8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en 9, en silencing tot dsRNA 10, 11 miRNA en siRNA 12. Hoewel deze technologieën het genereren van transgene planten hebben vereenvoudigd, hebben ze ook een bottleneck, waarbij het grote aantal transgene planten gegenereerd kunnen niet worden gescreend met behulp van traditionele systemen die afhankelijk zijn van planten regeneratie. Voor dit knelpunt, terwijl zwijgen en genoom-editing constructen kunnen snel in planten worden ingebracht, velegerichte eigenschappen niet het gewenste effect, die vaak niet ontdekt tot planten worden geanalyseerd in de kas te produceren. In dit werk hebben we een werkwijze voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten ontwikkeld, specifiek de huidige bottleneck begin screening van grote aantallen genoom-editing en silencing streefwaarden.

Het gebruik van protoplasten, in tegenstelling tot intacte plantencellen, heeft een aantal voordelen voor de ontwikkeling van een geautomatiseerd platform. Eerst worden protoplasten geïsoleerd na digestie van de plantencelwand, en deze barrière niet meer aanwezig, wordt transformatie-efficiëntie verhoogd 13. In intacte plantencellen zijn er slechts twee gevestigde methoden voor transformatie, biolistica 14 en Agrobacterium-gemedieerde transformatie 15. Geen van deze methoden kan gemakkelijk worden vertaald naar liquid handling platforms, zoals biolistica vereist gespecialiseerde apparatuur voor transformatie, terwijl Agrobacterium-gemedieerde transformatie vereist co-cultuur en de daarop volgende verwijdering van de bacteriën. Niet vatbaar voor high throughput methode. Bij protoplasten, transformatie wordt routinematig uitgevoerd met polyethyleenglycol (PEG) bemiddelde transfectie 16, die op verschillende oplossing vereist uitwisseling, en is ideaal voor vloeistofverwerking platforms. Anderzijds protoplasten per definitie zijn eencellige kweken, en dus de problemen van klontering en ketenvorming in plantencelkweken, worden niet waargenomen in protoplasten. In termen van een snelle screening met behulp van een plaat gebaseerde spectrofotometer, samenklontering van cellen, of cellen in meerdere vlakken zal leiden tot moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente metingen. Aangezien protoplasten ook dichter dan de kweekmedia ze bezinken op de bodem van putjes, waarbij een monolaag, die bevorderlijk is voor platen gebaseerde spectrofotometrie. Tot slot, terwijl de fabriek celsuspensieculturen zijn primarily afgeleid van callus 17, kunnen protoplasten worden verzameld van verschillende plantenweefsels, waardoor de mogelijkheid om weefselspecifieke expressie te identificeren. Bijvoorbeeld, het vermogen om wortel- of blad-specifieke expressie van een gen te analyseren kan zeer belangrijk fenotype te voorspellen. Daarom werden de die in dit werk protocollen gevalideerd middels protoplasten geïsoleerd uit de veel gebruikte tabak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow '2 (BY-2) suspensiekweek.

Het BY-2 suspensiekweek is beschreven als het "HeLa" cel van hogere planten door zijn alomtegenwoordige gebruik in moleculaire analyse van 18 plantencellen. Onlangs BY-2 cellen werden gebruikt om de effecten te bestuderen van plantaardige stressoren 19-22, intracellulair eiwit lokalisatie 23,24 en fundamentele celbiologie 25-27 tonen de brede bruikbaarheid van deze culturen in plantenbiologie. Een bijkomend voordeel van BY-2 culturen demogelijkheid om de kweken te synchroniseren met aphidicoline, wat kan leiden tot verbeterde reproduceerbaarheid genexpressiestudies 28. Bovendien zijn werkwijzen ontwikkeld voor de extractie van BY-2 protoplasten met behulp van goedkope enzymen 29,30, enzymen traditioneel gebruikt voor het genereren van protoplasten onbetaalbaar voor high-throughput systemen. Als zodanig heeft de hieronder beschreven protocol gevalideerd met de door-2 suspensiekweek, maar het moet geamendeerd om alle planten celsuspensie cultuur. Proof-of-concept experimenten uitgevoerd met een fluorescentie eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) vanaf het harde koraal Porites Porites 31 onder de controle van de CaMV35S-promoter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. De vaststelling van Suspension Cell Cultures

  1. Bereid vloeibare BY-2 media door het toevoegen van 4,43 g Linsmaier & Skoog basale media, 30 g sucrose, 200 mg KH 2PO 4 en 200 ug van 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (2,4-D) aan 900 ml gedestilleerd water en pH 5,8 met 0,1 M KOH. Na het aanpassen van de pH, aan te passen uiteindelijke volume tot 1000 ml met gedestilleerd water en autoclaaf. Media kunnen tot 2 weken bewaard bij 4 ° C.
  2. Inoculeren een 250 ml Erlenmeyer fles met 100 ml vloeibaar BY-2 media en één stuk BY-2 callus (> 1 cm in diameter) gekweekt op vaste BY-2 medium (vloeistof BY-2 medium met de toevoeging van 1% agar) en sluit af met aluminiumfolie. Incubeer kweken bij 28-30 ° C onder schudden gedurende 5 dagen.
    LET OP: BY-2 eelt wordt gehandhaafd op vaste media voor langdurige opslag, zoals vloeibare kweken snel zal overwoekeren. Kweekvolume kan zodanig aangepast, kenmerkend een 100 ml kweek in staat zijn het laden drieëndertig 6-well platen.
  3. Overdracht 2 ml log fase BY-2 cultuur tot 98 ml vers BY-2-media en incubeer gedurende 5-7 dagen bij 28-30 ° C onder schudden.
    OPMERKING: Sub-kweken van gevestigde vloeibare kweken kan worden uitgevoerd regelmatig met 1: 100 verdunningen van 5-7 dagen oude kweken, in plaats van inoculatie met callus.
  4. Meng de cultuur grondig, als cellen zich snel zal vestigen, en de overdracht 6 ml van de celkweek aan een 15 ml conische bodem centrifugebuis en laat de cellen genoegen nemen met ten minste 10 min. Stel het gepakte celvolume tot 50% van het totale volume door het verwijderen van supernatant.
  5. Schud de buis door het omkeren en pipet 500 ul in elk putje van een 6-wells plaat voor de spijsvertering. Gebruik wide-bore pipetten aan de cellen dragen in dit stadium, omdat ze dicht en verstoppen standaard pipetpunten.

2. protoplastisola-

  1. Zet alle componenten van het robotsysteem (Figuur 1A) en open de plaat mover taak plannen zachteware. De taak planningsprogramma integreert de microplaat mover met de andere apparatuur om de overdracht van de platen tussen elk apparaat mogelijk te maken.
  2. Voorafgaand aan experimenten, bepalen de technische specificaties voor laboratorium (bijvoorbeeld borden, deksels) die in het protocol, en begin- en eindposities voor elk stuk laboratorium, in de plaat mover software als volgt:
    1. Klik op Setup van de belangrijkste werkbalk in de plaat mover-software en selecteer het beheren Container Types commando.
    2. Als het type container in de bestaande soort container bibliotheek wordt vermeld, selecteer vervolgens de juiste container.
    3. Als het type container niet in de bestaande soort container bibliotheek wordt weergegeven en klik vervolgens op Toevoegen om een nieuwe container opgeven.
    4. Na het toevoegen van een nieuw type container, plaatst u de afmetingen van de nieuwe container (hoogte, breedte, stapelen dimensies en grijper offset) in de juiste tabbladen en klik op Opslaan.
      1. Als de juiste afmetingen zijn niet verkrijgbaar bij de fabrikant, vervolgens nauwkeurig alle dimensies op de millimeter te bepalen met behulp van remklauwen. Fouten in het meten van de container afmetingen zal leiden tot het falen van de plaat mover.
    5. Herhaal de stappen 2.2.2 tot 2.2.4.1 voor elk type container die de plaat verhuizer zal tegenkomen. Na voltooiing van deze stap voor laboratorium, is het noodzakelijk om het begin- en eindpunt van elke container (stap 2.2.6) definiëren.
      LET OP: Voor dit protocol het laboratorium bevat de 6-wells plaat, de deep-well plaat, en de 96-well fluorescerende screening plaat.
    6. Aan het begin en einde positie van elke container te definiëren, klikt u op het tabblad Start / End in een specifiek protocol. Selecteer eerst de startpositie van elke container. Vervolgens vinkt u het vakje voor Dekselkisten / Unlidded op zowel de begin- en eindstand. Herhaal dit voor alle containers.
      OPMERKING: Als de container zal worden overgelaten aan een ander stuk van equipment (in plaats van de plaat mover) het einde locatie kan worden ingevuld.
  3. Op dit moment staat alle platen laden in de uitgangspositie voor de gehele workflow. Laad de 96-well fluorescerende zeefplaten in hotel 2, 6-well platen met BY-2 cellen in hotel 3, een 96 deep-well plaat die wordt gebruikt voor transformatie op plaat verwarmer / koeler nest 2, en een 50 ml conische buis die het enzym oplossing (zie Hulp File, paragraaf 1.2.2) op de multi-mode dispenser.
    1. Als de transformatie in het protocol zal worden uitgevoerd, pre-laad de 96 deep-well plaat met 10 ul van plasmide-DNA per putje (1 ug / ul, A 260/280> 1.8) die het OFP reporter construct en broeden op de plaat verwarmer / koeler bij 4 ° C. Elk putje wordt gebruikt voor een enkele transformatie, waardoor het aantal putten gevuld is afhankelijk van de experimentele opstelling.
  4. Laad alle leveringen en platen op het automatiserend liquid handling platform in de aangewezen locaties en bepalen de positie van elk item in de automatisering controle software (Figuur 1B).
    1. Plaats een 96-wells plaat voorgeladen met 200 pi 40% PEG in MMG (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) in kolom 1, 200 ul propidiumjodide (PI, 1 ug / ml) in kolom 2, en 200 ui ethanol in kolom 3 (nest 2), en een doos van pipet tips in het nest 8.
    2. Om de locatie van het laboratorium in de software van de geautomatiseerde liquid handling platform, selecteer Tools in het menu te definiëren en klik op Labware Editor.
    3. Selecteer het type laboratorium uit het pulldown menu of definieer een nieuw laboratorium in met behulp van het nieuwe Laboratoriumbestek knop.
    4. Bepaal de positie van elk stuk van laboratorium geselecteerd door het tabblad Main Protocol en klik op Configure Labware. Zorg ervoor dat elk stuk van laboratorium geplaatst op de geautomatiseerde verwerking vloeistof platform isgedefinieerd vóór het uitvoeren van het protocol.
    5. Om de geautomatiseerde protocollen starten, klikt u op de Profile Explorer-venster en selecteer de naam van het protocol worden uitgevoerd (protoplastisolatie, celgetal, en PEG-gemedieerde transformatie).
    6. Klik op Uitvoeren om alle apparaten die worden gebruikt in het protocol initialiseren.
    7. Ten slotte is in het venster Work Explorer, klikt u op Toevoegen Work Unit om alle containers / laboratorium in het systeem te controleren en beginnen met het automatische protocol.
      OPMERKING: Volledige gegevens van geautomatiseerde protocollen zijn opgenomen in de aanvullende bestand.

3. Vaststelling van Standard Curve voor celtellingen

  1. Handmatig concentreren protoplasten bij een concentratie van 1 x 10 6 protoplasten / ml in een volume van 1 ml. Centrifugeer protoplasten bij 1000 xg gedurende 10 min, en verwijder supernatant.
  2. Voeg 900 pl 70% ethanol (gehandhaafd op 4 ° C) aan de protoplast pelleten resuspendeer de pellet. Incubeer gedurende 10 min op ijs om cellen te repareren.
  3. Voeg 100 ul van PI (1 ug / ml) aan de protoplasten om de kernen te labelen en waarmee de aanwezigheid van de plaatlezer.
  4. Load 80 ul van vloeistof BY-2 media in elke kolom en rij van de 96-well fluorescerende screening plaat te beginnen bij kolom 2.
  5. In kolom 1 van een 96-well fluorescerende schermplaat, voeg 70 ul van protoplasten en 50 gl BY-2 medium aan elk putje van de kolom.
  6. Plaats de plaat in nest 6 van de geautomatiseerde liquid handling-platform, en uitvoeren van een 2-voudige seriële verdunning.
    1. Een seriële verdunning van de geautomatiseerde vloeistofverwerking platform voeren op starten seriële Wizard verdunning en het volume overdracht (60 ui), aantal mixen en volume (2, 70 ui), aanvankelijk putjes (kolom 1, rijen AF), verdunning aanpassen Wells (Kolommen 2-11, Rijen AF), en aspireren en afzien eigenschappen (0,5 mm uit goed onder).
    2. Na het instellen van de parameters, behalve eend het protocol uit te voeren.
      Opmerking: Aangezien alle protoplasten worden gelabeld met PI (vanwege fixatie van cellen), de fluorescentie is evenredig met de concentratie protoplast.
    3. Nadat de seriële verdunning is voltooid, verwijdert u de plaat uit nest 9 en in te voegen in de plaat lezer en voer de standaard curve protocol in de plaat lezer software.
      OPMERKING: Een standaard curve wordt dan gegenereerd door vergelijking van de fluorescentie van PI (excitatie 536 nm / emissie 620 nm) in elk putje met bekende concentratie protoplast.
  7. Na voltooiing van de plaat lezer protocol, verwijder de plaat en het verzamelen van elke transgene cellen voor behandeling in een autoclaaf of andere de-vitalisering procedures zoals gedefinieerd in bioveiligheid protocollen '.

4. Microscopische analyse van Transformatie

  1. Verwijder plaat met getransformeerd protoplasten (het product van Automated Protocol 3, Aanvullende File) van Hotel 1 van het robotsysteem.
  2. Beurtop omgekeerde microscoop, camera, en tl-lamp.
  3. Selecteer de 10X doelstelling voor de initiële focus op de protoplasten, zet de halogeenlamp, en sluit de sluiter voor de tl-lamp.
  4. Load plaat op microscopische systeem en de focus op de protoplasten met behulp van helderveld.
  5. Na de nadruk op protoplasten, uitschakelen van de halogeenlamp en open de sluiter voor de tl-lamp.
  6. Selecteer de CY3 / TRITC filterset voor visualisatie van de pporRFP eiwit door de transgene protoplasten uitgedrukt.
  7. Scannen elk putje het aantal protoplasten expressie pporRFP de fluorescente merker bepalen.
  8. Bereken de transformatie-efficiëntie als het totaal aantal protoplasten uiting van de fluorescente merker het totaal aantal protoplasten.
  9. Verzamel elke platen met transgene cellen in goedgekeurde bioveiligheid zakken voor een autoclaaf of andere de-vitalisering procedures zoals gedefinieerd in bioveiligheid protocollen '.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige studie, de verdubbelingstijd percentage BY-2 varieerde 14-18 uur afhankelijk van de temperatuur waarbij de kweken werden geïncubeerd, in overeenstemming met eerdere rapporten van een gemiddelde lengte van de celcyclus van 15 uur. Met deze verdubbeling rate, een 1: 100 werd beginnen entstof gebruikt om culturen te initiëren, wat leidt tot culturen met een hematocriet (PCV) van 50% in 5-7 dagen. In het huidige protocol, waarin kweken werden gekweekt in 200 ml medium, een PCV ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierboven beschreven protocol is met succes gevalideerd voor protoplastisolatie, telling, en transformatie met behulp van de door-2 tabak schorsing celkweek; echter, kon het protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar alle planten schorsing cultuur. Op dit moment heeft protoplastisolatie en transformatie gerealiseerd in tal van planten, met inbegrip van maïs (Zea mays) 10, wortel (wilde peen) 32, populier (Populus euphratica) 33, druif (Vitis vinifera)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financieel belang.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award nr. DE-AR0000313.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware gebruikt om protocollen te controleren en te schrijven voor Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software voor het bedienen van Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware gebruikt om te controleren en protocollen te schrijven voor MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FVoorheen Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13(2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831(2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protoplast TransformationHigh throughput ScreeningBY 2 TobaccoEnzyme DigestionFluorescent MicroscopyPropidium IodideOrange Fluorescent ProteinPolyethylene Glycol

Gerelateerde artikelen