We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Één klonale tracing en analyse op het hele hart kan tijdens hartontwikkeling cardiale voorlopercellen celgedrag en differentiatie vast, en zorgen voor de studie van de cellulaire en moleculaire basis van normale en abnormale cardiale morfogenese. Recente opkomende technologieën van retrospectieve enkele klonale analyses maken van de studie van de cardiale morfogenese bij enkele resolutie cel haalbaar is. Echter, wordt het weefsel dekking en lichtverstrooiing van het hart als imaging diepte toegenomen hinder hele hart imaging bij enkele resolutie cel. Om deze obstakels, een hele embryo clearing systeem dat het hart zeer transparant voor zowel de belichting en detectie worden ontwikkeld kan maken overwinnen. Gelukkig is in de afgelopen jaren, veel methodieken voor hele organisme clearing systemen zoals DUIDELIJKHEID, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB en PACT gemeld. Dit lab is geïnteresseerd in de cellulaire en moleculaire mechanismen van de kaartiac morfogenese. Onlangs, hebben we enkele cel lineage tracing via de ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Confetti systeem om spaarzaam label cellen tijdens de ontwikkeling van het hart. We aangepast enkele hele embryo clearing methodieken waaronder Sca le en CUBIC (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) voor het embryo in combinatie ontruimen met hele mount vlekken op de foto om enkele klonen in het hart. Het hart werd met succes afgebeeld op één resolutie cel. We vonden dat Sca le het embryonale hart kan duidelijk, maar niet effectief duidelijk de postnatale hart, terwijl CUBIC de postnatale hart kan duidelijk, maar schade toebrengt aan het embryonale hart door het oplossen van het weefsel. De hier beschreven werkwijzen zal het onderzoek van genfunctie mogelijk te maken een resolutie kloon gedurende cardiale morfogenese, die op hun beurt kunnen de cellulaire en moleculaire basis van aangeboren hartafwijkingen onthullen.
Inleiding
Cardiale morfogenese is een sequentiële Indien de spatiotemporele organisatie van vier verschillende typen cardiale progenitorcellen in verschillende sectoren van het hart nodig en vereist meerdere genetische regulerende netwerken om dit proces orkestreren de functionele hart 1,2 vormen ook. Cardiale specificatie, differentiatie, patronen, en kamermuziek rijping worden gereguleerd door cardiogene transcriptiefactoren 3. Genetische mutatie of posttranscriptionele aberratie van deze factoren in het hart stamcellen zou kunnen resulteren in een van beide embryonische dodelijkheid of aangeboren hartafwijkingen (CHD) 4. De studie van cardia....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Albany Medical College en uitgevoerd volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Oplossing Voorbereidingen
LET OP: De Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17 en Rosa26-mTmG (mTmG) 20 muis lijnen werden in de winkel gekochte cTnT-Cre 18 was een geschenk van Dr. Jiao aan de Universiteit van Alabama Nfatc1-Cre.. was een gift van Dr. Bin Zhou bij Albert Einstein College of Medi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Beeldvorming van het ontruimde embryonale hart
Gewervelde hartvorming een spatiotemporeel morfogene gereguleerd proces en is afhankelijk van de organisatie en differentiatie van progenitorcellen uit vier verschillende bronnen 1. Cellen van het eerste hart gebied van cardiale halve maan zal vouw in de richting van de ventrale middellijn om een lineaire hart buis te vormen. De cellen van het tweede hart veld aanvank.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De embryo isolatie is een zeer belangrijke stap. E9.5 embryo's zijn erg kwetsbaar en klein in omvang, dus extra zorg moeten worden genomen van het embryo / hart structuren niet te beschadigen tijdens het isolement. De niet-embryonale extra lagen omhult het embryo / hart moeten zorgvuldig vooral als beeldvorming van de hele embryo worden verwijderd. Dit maakt het mogelijk antilichaam en clearing mengsel penetratie diep in de embryonale weefsels, en helpt ook bij het verwijderen van de achtergrond signaal wanneer beel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
We danken de leden van het M.W. laboratorium voor de wetenschappelijke discussie. Dit werk wordt ondersteund door AHA [13SDG16920099] aan M.W., en door National Heart, Lung, and Blood Institute subsidies [R01HL121700] aan M.W. Beelden werden vastgelegd in de Imaging Core Facility aan het Albany Medical College.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Zonnebloemzaadolie | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nucleaire kleuring | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 welplaten | Cell Treat | 229148 | |
| Analytische weegschaal | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocale microscoop | Zeiss | Zeiss 510 confocale microscoop | |
| Dissectiemicroscoop | Unitron | Z850 | |
| Fluorescentiemicroscoop | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Lichtbron | SCHOTT | ACE I | |
| Schaar | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petrischaal 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillatiebuizen | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transferpipet | Samco Scientific | 202 | |
| Pincet | Fine Science Tools | 11251-20 |
Referenties
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
