Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.

Samenvatting

Één klonale tracing en analyse op het hele hart kan tijdens hartontwikkeling cardiale voorlopercellen celgedrag en differentiatie vast, en zorgen voor de studie van de cellulaire en moleculaire basis van normale en abnormale cardiale morfogenese. Recente opkomende technologieën van retrospectieve enkele klonale analyses maken van de studie van de cardiale morfogenese bij enkele resolutie cel haalbaar is. Echter, wordt het weefsel dekking en lichtverstrooiing van het hart als imaging diepte toegenomen hinder hele hart imaging bij enkele resolutie cel. Om deze obstakels, een hele embryo clearing systeem dat het hart zeer transparant voor zowel de belichting en detectie worden ontwikkeld kan maken overwinnen. Gelukkig is in de afgelopen jaren, veel methodieken voor hele organisme clearing systemen zoals DUIDELIJKHEID, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB en PACT gemeld. Dit lab is geïnteresseerd in de cellulaire en moleculaire mechanismen van de kaartiac morfogenese. Onlangs, hebben we enkele cel lineage tracing via de ROSA26-Cre ^ERT2; ROSA26-Confetti systeem om spaarzaam label cellen tijdens de ontwikkeling van het hart. We aangepast enkele hele embryo clearing methodieken waaronder Sca le en CUBIC (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) voor het embryo in combinatie ontruimen met hele mount vlekken op de foto om enkele klonen in het hart. Het hart werd met succes afgebeeld op één resolutie cel. We vonden dat Sca le het embryonale hart kan duidelijk, maar niet effectief duidelijk de postnatale hart, terwijl CUBIC de postnatale hart kan duidelijk, maar schade toebrengt aan het embryonale hart door het oplossen van het weefsel. De hier beschreven werkwijzen zal het onderzoek van genfunctie mogelijk te maken een resolutie kloon gedurende cardiale morfogenese, die op hun beurt kunnen de cellulaire en moleculaire basis van aangeboren hartafwijkingen onthullen.

Inleiding

Cardiale morfogenese is een sequentiële Indien de spatiotemporele organisatie van vier verschillende typen cardiale progenitorcellen in verschillende sectoren van het hart nodig en vereist meerdere genetische regulerende netwerken om dit proces orkestreren de functionele hart ^1,2 vormen ook. Cardiale specificatie, differentiatie, patronen, en kamermuziek rijping worden gereguleerd door cardiogene transcriptiefactoren ^3. Genetische mutatie of posttranscriptionele aberratie van deze factoren in het hart stamcellen zou kunnen resulteren in een van beide embryonische dodelijkheid of aangeboren hartafwijkingen (CHD) ^4. De studie van cardiale morfogenese vereist een begrip van de inherente structurele details in drie dimensies (3D) en single gelabelde cardiale voorlopercellen cel lineage tracing tijdens de ontwikkeling van het hart zal het begrip van cardiale morfogenese te promoten. Een aantal high-resolution sectie, gebaseerd tomografie methoden ontwikkeld in the afgelopen decennia aan het orgel structuur ^5,6; Deze werkwijzen vereisen dure, gespecialiseerde instrumenten, uitgebreide arbeid en gebrek gedetailleerde structurele organisatie op één resolutiecel in de uiteindelijke volumetrische gereconstrueerde beeld ^7,8.

3D volumetrische beeldvorming op enkele cel niveau verschaft een middel om voorlopercellen celdifferentiatie en cellulair gedrag te bestuderen in vivo ^7. Echter, weefsel lichtverstrooiing blijft de belangrijkste hinderpaal voor de beeldvorming van de cellen en structuren in 3D diep in het intacte hart. Lipiden zijn een belangrijke bron van lichtverstrooiing, en het verwijderen van lipiden en / of aanpassing van het brekingsindexverschil tussen lipiden en hun omgeving zijn mogelijke benaderingen voor toenemende weefsel transparantie ^8. In de afgelopen jaren een aantal weefsels clearing methoden ontwikkeld, waarmee weefsel dichtheid en lichtverstrooiing te verminderen, zoals BABB (benzylalcohol en benzyl benzoate mengsel) en DBE (tetrahydrofuran en dibenzylether); maar bij deze werkwijzen, fluorescentiedoving blijft een probleem ^8-10. Het oplosmiddel gebaseerde hydrofiele methoden, zoals SeeDB (fructose / thioglycerol) en 3DISCO (dichloormethaan / dibenzylether), het behoud van fluorescerende signalen, maar niet maken het hele orgel transparant ^7,8,11. Ter vergelijking: de CLARITY weefsel-clearing werkwijze maakt het orgel transparant, maar het vereist een speciale elektroforese apparaat lipiden ^8,12 verwijderen, evenals PACT (passieve duidelijkheid techniek), waarvoor ook hydrogel insluiten ^7,13. Voor gedetailleerde informatie over alle beschikbare weefsel opruimmethoden, zie tabel 1 in Richardson en Lichtman, et al. ^7.

In 2011, Hama et al. Serendipitously ontdekte een hydrofiel mengsel 'Sca le' (ureum, glycerol en Triton X-100 mengsel), die de hersenen van muizen en embryo tran maaktent terwijl volledig behoud fluorescentiesignalen van gelabelde klonen ^14. Dit zorgt voor de beeldvorming van de intacte hersenen op een diepte van enkele millimeters en grootschalige reconstructie van neuronale populaties en projecties bij een subcellulaire resolutie. Susaki et al. verder verbeterd Sca le door het toevoegen van aminoalcoholen en ontwikkelde de 'cubic' (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) weefsel clearing methode, die fosfolipiden oplosbaar verhoogd, verminderde clearing tijd, en toegestaan voor multicolor fluorescerende beeldvorming ^8. In de huidige studie, gebruik te maken van de Sca le en CUBIC weefsel clearing technieken en een hoge resolutie 3D-optische sectie, individuele klonen in het hart tijdens cardiogenese werden opgespoord met behulp van Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ^17, cTnT-Cre ^18, Nfatc1-Cre ¹⁹ en Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ muis lijnen. De combinatie van de werkwijze ganse berg kleuring (WMS) ontwikkeld eerder ^21,22 met weefsel wismethodes verder toegestaan voor de kleuring van andere eiwitten in gelabelde klonen en voor de studie van hun gedrag in een 3D volumetrische context. De combinatie van weefsel en clearing WMS zorgt voor een beter begrip van de rol van de verschillende genen en eiwitten bij ontwikkeling van het hart en de etiologie van aangeboren hartafwijkingen. Dit protocol kan worden toegepast op andere voorlopercellen celdifferentiatie, celgedrag en orgel morfogenese gebeurtenissen bestuderen tijdens de ontwikkeling.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Albany Medical College en uitgevoerd volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Oplossing Voorbereidingen

LET OP: De Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ¹⁷ en Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ muis lijnen werden in de winkel gekochte cTnT-Cre ¹⁸ was een geschenk van Dr. Jiao aan de Universiteit van Alabama Nfatc1-Cre.. was een gift van Dr. Bin Zhou bij Albert Einstein College of Medicine ^19. Muizen werden gedood door inhalatie van kooldioxide in een gesloten kamer gedurende ten minste 60 seconden gevolgd door fysieke middelen dood verificatie door bilaterale thoracotomie, onthoofding of cervicale dislocatie.

1. Bereid Tamoxifen. Los 10 mg Tamoxifen in 10 ml van zonnebloemzaad oil. Zodra het volledig is opgelost, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
2. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Ontbinden Na ₂ HPO ₄ (1,41960 g), KH ₂ PO ₄ (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) en KCl (0,20129 g) in 1 liter gedestilleerd water en breng de pH op 7,4.
3. Bereid PBST: 0,1% Tween-20 in PBS oplossing door het oplossen van 100 ul Tween-20 in 100 ml PBS.
4. Bereid blokkerende buffer. Voeg 3% runderserumalbumine (BSA) blokkeeroplossing door het oplossen van 3 g BSA in 100 ml PBST dat 0,2% Tween-20.
5. Bereid CUBIC-1 (reagens 1). Meng 25 gew% ureum, 25 gew% N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine en 15 gew% Triton X-100 in dH ₂ O.
6. Bereid CUBIC-2 (reagens 2). Meng 50 gew% sucrose, 25 gew% ureum, 10 gew% 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol en 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH ₂ O.
7. Bereid Sca le A2: 4 M ureum, 10% w / v glycerol en 0,1% w / v Triton X-100 in dH ₂ O. Breng de pH op 7,7.
8. Bereid Sca le B4: 8 M ureum en 0,1% w / v Triton X-100 in dH ₂ O. Stel de pH tot 8,7.
9. Bereid Sca le 70: 4 M ureum, 70% w / v glycerol en 0,1% w / v Triton X-100 in dH ₂ O.

2. Tamoxifen Inductie, Embryo Isolatie en Fixation

1. Tamoxifen Inductie en Embryo Isolation
   1. Met behulp van een gebogen voedingssonde goedgekeurde protocol (ACUP 13-12007), maagsonde de vrouwelijke R26Cre ^ERT2 Confetti muizen (gestopt door R26Cre ^ERT2 mannelijke muizen) met 10 ug / g van Tamoxifen op embryonale ontwikkelingsstoornis dag E7.75 ^33. Op embryonale dag 9,5 (E9.5) of E10.5, euthanaseren de vrouwelijke muizen met CO ₂ en cervicale dislocatie.
   2. Na controle van de muis dood (zie paragraaf 1 Opmerking), opent u de muis buikholte met een schaar en ontleden de baarmoeder hoorn, verwijder de eileider lagen met behulp van een schaar en pincet, en release het embryo uit de eileider ^23,24.
      1. Breng de embryo een petrischaaltje met PBS (pH 7,4). Onder de dissectiemicroscoop opheffen van de niet-embryonale lagen (chorion, dooierzak en amnion) met behulp van een pincet.
   3. Met behulp van een pincet en een schaar, het verzamelen van de vrouwelijke muis en embryo staart monsters voor genotypering zoals eerder gemeld ^22. Met een plastic pipet elk embryo een putje van een 48 putjesplaat met 1 ml 1x PBS.
   4. Onder een fluorescentiemicroscoop, identificeren de GFP / RFP / CFP positieve embryo via een omgekeerde microscoop met camera. Schil weg het hartzakje met een pincet en draai het hart / embryo met behulp van gebogen pincet om het aantal fluorescerende klonen aan beide zijden van het hart met de GFP / RFP / GVB filters te bepalen. Geen bezuinigingen nodig zijn.
2. Na het identificeren van GFP / RFP / GVB positieve embryo's snel de embryo's te wassen tweemaal (2 min elk) met 1x PBS in the 48 goed plaat op een bord shaker bij kamertemperatuur (RT). Dit zal overtollig bloed te verwijderen.
3. Bevestig de embryo / embryonale hart met behulp van 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur. De bevestiging is afhankelijk van de embryonale leeftijd en weefselgrootte. Voor E9.5 bevestig de embryo gedurende 2 uur bij KT. De late embryonale stadium embryo's vereisen een langere fixatie tijd, die zelfs kan worden verlengd tot 24 uur voor postnatale hart.
   LET OP: Paraformaldehyde is giftig, contact met de huid, ogen en slijmvliezen vermijden.
4. Na fixatie, was de embryo / hart in de 48 goed plaat twee keer (10 min elk) met 1x PBS op een plaat schudder bij RT. Dit verwijdert het overtollige PFA van het embryo / hart. De embryo's worden dan verder verwerkt voor de hele mount kleuring en weefsel clearing.

3. Hele Mount kleuring

OPMERKING: Nadat PFA fixatie het embryo / hart als volgt wordt onderworpen aan ganse berg vlekken.

1. Permeabilize het embryo / hart in een 48 goed plaat met behulp van 1 ml 0,1% PBST gedurende 2 uur op plaat schudder bij kamertemperatuur.
2. Na permeabilisatie, dompel de embryo / hart in 1 ml van het blokkeren van buffer, gedurende 2 uur of 's nachts op een plaat schudder bij 4 ºC.
3. Dompel het embryo / hart naar de endotheelcel-specifiek antilichaam PECAM (CD31), verdund (1: 100) in 0,3 ml blokkerende buffer gedurende 48 uur op plaat schudder bij 4 ° C.
4. Was de embryo / hart met behulp van PBST 5 keer, 30 min elk bij RT op plaat shaker. Dit verwijdert de overmaat niet-specifiek gebonden primair antilichaam uit het weefsel.
5. Dompel het embryo / hart in Alexa Fluor 647 geit anti-rat secundair antilichaam, verdund (1: 1000) in 1 ml blokkeerbuffer gedurende 48 uur op plaat schudder bij 4 ° C.
6. Herhaal stap 3,4 aan het secundaire antilichaam was.
7. Post-fix het embryo / hart met 4% PFA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op plaat schudder en tweemaal wassen met PBS 5 minuten elk.
8. Vlekken op het embryo / hart met de nucleaire vlek 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdund in PBST bij een concentverhouding van 0,01 mg / ml) gedurende 10 min op plaat schudder bij kamertemperatuur. Volg met PBS twee wassingen van 5 minuten elk.

4. Embryo / hart Clearing met Sca l e of CUBIC Method

LET OP: Na het ganse berg kleuring, wordt het embryo / hart onderworpen aan ofwel de Sca le of KUBIEKE weefsel clearing methode. De wijze is afhankelijk van de weefselgrootte en embryonale leeftijd. Voor E11.5 of jongere leeftijd embryo's, gebruik Sca l e weefsel clearing methode, terwijl voor oudere embryo's of postnatale harten de CUBIC weefsel clearing methode heeft de voorkeur.

1. Schaal Tissue Clearing Methode
   1. Incubeer de embryo / hart met 1 ml Sca l e A2 oplossing in een scintillatieflesje (verpakt in aluminiumfolie) waarbij af en toe voorzichtig schudden (handmatig) gedurende 48 uur bij 4 ° C.
   2. Na Sca l e A2 incubatie Incubeer de embryo / hart met 1 ml Sca l e B4 oplossing bij 4 ° C in dezelfde flacon af en toe lichtjes schudden Anothaar 48 uur.
   3. Incubeer de embryo / hart voor een 48 uur met 1 ml Sca l e 70 bij 4 ° C met af en toe voorzichtig schudden. Mount embryo met behulp van 90% glycerol (zie paragraaf 5.1).
2. CUBIC Tissue Clearing Methode
   1. Voor de hele embryo / hart CUBIC clearing, dompel elk embryo / hart in 1 ml kubieke-1 met af en toe voorzichtig schudden gedurende 48 uur bij 37 ° C ^7. Na 48 uur werd de oplossing vervangen met hetzelfde volume verse CUBIC reagens 1 en incubeer het monster gedurende nog 48 uur bij 37 ° C met af en toe schudden met de hand.
   2. Was de CUBIC-1 behandelde hart / embryo met 1x PBS meerdere malen bij kamertemperatuur onder zacht schudden met de hand. Dit verwijdert de overtollige CUBIC-1 oplossing.
   3. Na uitwassen CUBIC-1 met PBS, dompel de embryo's / hearts in kubieke-2-oplossing (1 g per embryo / heart) gedurende 48 uur bij 37 ° C met af en toe lichtjes schudden met de hand. Dit volgt embryo / heart montage met behulp van glycerol (zie hoofdstuk 50,2).

5. Sample Montage en Imaging

LET OP: De ontruimde embryo's of organen in Sca l e 70 of CUBIC-2-oplossing kan direct respectievelijk worden afgebeeld met schaal 70 en CUBIC-2-oplossing als de beeldvormende medium. Echter, gezien de kwetsbaarheid van de embryonale monsters clearing reagentia, indien de monsters worden niet onmiddellijk worden afgebeeld, maar opgeslagen langdurige monsters worden in 90% glycerol de onderstaande protocol.

1. Direct dompel de Sca le ontruimd monster in 1 ml van 90% glycerol en bewaar bij 4 ° C tot beeldvorming.
2. Was de kubische behandelde monster met 1x PBS tweemaal 5 min elk en achtereenvolgens incuberen van het monster met 1 ml van 30%, 50%, 70% en 90% glycerol oplossing elke 30 minuten.
3. Voor beeldvorming, breng het monster glazen bodem petrischaal met een minimale hoeveelheid van 90% glycerol en beeld klonen met een confocale microscoop met twee foton mogelijkheden.
4. Afbeelding het hart of embryo in de glycerol met een 10X / 0.3 NA, een 25X / 0.8 NA onderdompeling, of een 40X / 1.2 NA water corrigerende objectief. Afbeelding DAPI met behulp van 2-foton excitatie van een coherent titanium: saffier kameleon laser. De keuze van de microscoop objectieflens zal afhangen van het doel van de experimenten, bijvoorbeeld voor superresolutie kan een lichtwaaier fluorescentiemicroscoop worden gebruikt.

Resultaten

Beeldvorming van het ontruimde embryonale hart

Gewervelde hartvorming een spatiotemporeel morfogene gereguleerd proces en is afhankelijk van de organisatie en differentiatie van progenitorcellen uit vier verschillende bronnen ^1. Cellen van het eerste hart gebied van cardiale halve maan zal vouw in de richting van de ventrale middellijn om een ​​lineaire hart buis te vormen. De cellen van het tweede hart veld aanvank...

Discussie

De embryo isolatie is een zeer belangrijke stap. E9.5 embryo's zijn erg kwetsbaar en klein in omvang, dus extra zorg moeten worden genomen van het embryo / hart structuren niet te beschadigen tijdens het isolement. De niet-embryonale extra lagen omhult het embryo / hart moeten zorgvuldig vooral als beeldvorming van de hele embryo worden verwijderd. Dit maakt het mogelijk antilichaam en clearing mengsel penetratie diep in de embryonale weefsels, en helpt ook bij het verwijderen van de achtergrond signaal wanneer beel...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,2′,2′’-nitrilotriethanol	Sigma Aldrich	90279
4% Paraformaldehyde in PBS	Affymetrix	19943
BSA	Fischer Scientific	BP16000
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Sigma Aldrich	122262
Phosphate Buffer Saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U-1250
Sucrose	Sigma Aldrich	84097
Glycerol	Sigma Aldrich	G8773
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648
Zonnebloemzaadolie	Sigma Aldrich	S5007
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
PECAM (CD31)	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21247
DAPI nucleaire kleuring	Sigma Aldrich	D9542
37oC Incubator	Thermoscientific Fischer	Heratherm, Compact Microbiological Incubators
48 welplaten	Cell Treat	229148
Analytische weegschaal	Metler Toledo	PB153-S/FACT
Confocale microscoop	Zeiss	Zeiss 510 confocale microscoop
Dissectiemicroscoop	Unitron	Z850
Fluorescentiemicroscoop	Zeiss	Observer. Z1
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer	CellPoint Scientific	GER-5287-120V
Lichtbron	SCHOTT	ACE I
Schaar	Fine Science Tools	14084-08
Petrischaal 60 mm x15 mm	TPP Techno Plastic Products AG	93060
Rocker II  Platform Rocker	Boekel Scientific	260350
Scintillatiebuizen	Fischer Scientific	03-337-26
Transferpipet	Samco Scientific	202
Pincet	Fine Science Tools	11251-20