Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Summary

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Abstract

Één klonale tracing en analyse op het hele hart kan tijdens hartontwikkeling cardiale voorlopercellen celgedrag en differentiatie vast, en zorgen voor de studie van de cellulaire en moleculaire basis van normale en abnormale cardiale morfogenese. Recente opkomende technologieën van retrospectieve enkele klonale analyses maken van de studie van de cardiale morfogenese bij enkele resolutie cel haalbaar is. Echter, wordt het weefsel dekking en lichtverstrooiing van het hart als imaging diepte toegenomen hinder hele hart imaging bij enkele resolutie cel. Om deze obstakels, een hele embryo clearing systeem dat het hart zeer transparant voor zowel de belichting en detectie worden ontwikkeld kan maken overwinnen. Gelukkig is in de afgelopen jaren, veel methodieken voor hele organisme clearing systemen zoals DUIDELIJKHEID, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB en PACT gemeld. Dit lab is geïnteresseerd in de cellulaire en moleculaire mechanismen van de kaartiac morfogenese. Onlangs, hebben we enkele cel lineage tracing via de ROSA26-Cre ^ERT2; ROSA26-Confetti systeem om spaarzaam label cellen tijdens de ontwikkeling van het hart. We aangepast enkele hele embryo clearing methodieken waaronder Sca le en CUBIC (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) voor het embryo in combinatie ontruimen met hele mount vlekken op de foto om enkele klonen in het hart. Het hart werd met succes afgebeeld op één resolutie cel. We vonden dat Sca le het embryonale hart kan duidelijk, maar niet effectief duidelijk de postnatale hart, terwijl CUBIC de postnatale hart kan duidelijk, maar schade toebrengt aan het embryonale hart door het oplossen van het weefsel. De hier beschreven werkwijzen zal het onderzoek van genfunctie mogelijk te maken een resolutie kloon gedurende cardiale morfogenese, die op hun beurt kunnen de cellulaire en moleculaire basis van aangeboren hartafwijkingen onthullen.

Introduction

Cardiale morfogenese is een sequentiële Indien de spatiotemporele organisatie van vier verschillende typen cardiale progenitorcellen in verschillende sectoren van het hart nodig en vereist meerdere genetische regulerende netwerken om dit proces orkestreren de functionele hart ^1,2 vormen ook. Cardiale specificatie, differentiatie, patronen, en kamermuziek rijping worden gereguleerd door cardiogene transcriptiefactoren ^3. Genetische mutatie of posttranscriptionele aberratie van deze factoren in het hart stamcellen zou kunnen resulteren in een van beide embryonische dodelijkheid of aangeboren hartafwijkingen (CHD) ^4. De studie van cardia....

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Albany Medical College en uitgevoerd volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Oplossing Voorbereidingen

LET OP: De Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ¹⁷ en Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ muis lijnen werden in de winkel gekochte cTnT-Cre ¹⁸ was een geschenk van Dr. Jiao aan de Universiteit van Alabama Nfatc1-Cre.. was een gift van Dr. Bin Zhou bij Albert Einstein College of Medi....

Results

Beeldvorming van het ontruimde embryonale hart

Gewervelde hartvorming een spatiotemporeel morfogene gereguleerd proces en is afhankelijk van de organisatie en differentiatie van progenitorcellen uit vier verschillende bronnen ^1. Cellen van het eerste hart gebied van cardiale halve maan zal vouw in de richting van de ventrale middellijn om een ​​lineaire hart buis te vormen. De cellen van het tweede hart veld aanvank.......

Discussion

De embryo isolatie is een zeer belangrijke stap. E9.5 embryo's zijn erg kwetsbaar en klein in omvang, dus extra zorg moeten worden genomen van het embryo / hart structuren niet te beschadigen tijdens het isolement. De niet-embryonale extra lagen omhult het embryo / hart moeten zorgvuldig vooral als beeldvorming van de hele embryo worden verwijderd. Dit maakt het mogelijk antilichaam en clearing mengsel penetratie diep in de embryonale weefsels, en helpt ook bij het verwijderen van de achtergrond signaal wanneer beel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2′,2′’-nitrilotriethanol	Sigma Aldrich	90279
4% Paraformaldehyde in PBS	Affymetrix	19943
BSA	Fischer Scientific	BP16000
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Sigma Aldrich	122262
Phosphate Buffer Saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U-1250
Sucrose	Sigma Aldrich	84097
Glycerol	Sigma Aldrich	G8773
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648
Sunflower seed oil	Sigma Aldrich	S5007
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
PECAM (CD31)	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21247
DAPI nuclear stain	Sigma Aldrich	D9542
37oC Incubator	Thermoscientific Fischer	Heratherm, Compact Microbiological Incubators
48 well plates	Cell Treat	229148
Analytical Balance	Metler Toledo	PB153-S/FACT
Confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510 confocal microscope
Disecting Microscope	Unitron	Z850
Fluorescent microscope	Zeiss	Observer. Z1
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer	CellPoint Scientific	GER-5287-120V
Light Source	SCHOTT	ACE I
Pair of Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Petri dish 60 mm x15 mm	TPP Techno Plastic Products AG	93060
Rocker II  Platform Rocker	Boekel Scientific	260350
Scintillating tubes	Fischer Scientific	03-337-26
Transfer pipette	Samco Scientific	202
Tweezers	Fine Science Tools	11251-20