Method Article

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

DOI:

10.3791/54307

⸱

August 7th, 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een werkwijze wordt beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische correlatieve studies van humane pathologie weefsel met behulp groothoek fluorescentie lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Het protocol wij epoxy ultradunne coupes van humane tumor somatostatinoma immunolabeled Een primair antilichaam tegen somatostatine, gevolgd door een gebiotinyleerd secundair antilichaam en visualisatie met streptavidine geconjugeerd 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QD) tonen. De secties zijn gemonteerd op een TEM monster raster vervolgens op een glasplaatje geplaatst voor observatie door groothoek fluorescentie licht microscopie. Lichtmicroscopie onthult 585 nm QD etikettering als fel oranje fluorescentie de vorming van een korrelige patroon binnen de tumorcel cytoplasma. Bij lage tot mid-range vergroting met lichtmicroscopie de etikettering patroon gemakkelijk kan worden herkend en het niveau van niet-specifieke of achtergrond labeling beoordeeld. Dit is een kritiekestap voor daaropvolgende interpretatie van de immunokleuring patroon met TEM en evaluatie van de morfologische context. In dezelfde paragraaf wordt vervolgens droog gedept en bekeken door TEM. QD probes gezien worden gehecht aan amorf materiaal op individuele secretoire granules. Beelden worden verkregen uit dezelfde regio van belang (ROI) gezien door lichtmicroscopie voor correlatieve analyse. Overeenkomstige beelden uit elke modaliteit kan dan worden vermengd om de fluorescentie gegevens overlay over TEM ultrastructuur van de betrokken regio.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een krachtige benadering voor de analyse van transiënte dynamische gebeurtenissen 1, zeldzame gebeurtenissen 2, 3 en complexe systemen 4. Er zijn veel verschillende technische permutaties beschikbaar 5 afhankelijk van de vraag gesteld echter een gebruikelijke voorwaarde is dat dezelfde structuur in een enkel monster 6 wordt afgebeeld door meerdere modaliteiten microscopie. De specifieke benadering Clem ontwikkeld voor de studie van archivistische humane pathologie weefsel en het geval gebruikt is goed gekarakteriseerd en eerder gepubliceerd 7. Het ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tissue Dissection en Fixation

  1. tissue Dissection
    1. Ontleden weefsel stukken uit een chirurgisch weggesneden tumor specimen of weefsel biopsie.
      Opmerking: Het weefsel toegepast bij dit onderzoek werd routinematig gefixeerd in formaline maar vers weefsel ook geschikt. Wij selecteerden een gebied bevestigd en gemeld door een anatomische patholoog somatostatinoma tumor bevatten na routinematige histologische kleuring en anti-somatostatine immunokleuring (niet getoond).
    2. Gebruik weefsel stukken niet groter dan ongeveer 1,0 mm 3.
  2. Bereiding cacodylaatbuffer
    1. Bereid e....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De somatostatinoma tumor specimen gebruikt voor deze studie omvatte tumorcellen vormen ductale structuren gemengd met collageen stoma weefsel. Met behulp van fluorescentie microscopie licht, individuele tumorcellen die overvloedige secretoire korrels bevatte toonde positieve etikettering van de somatostatine-hormoon. Kernen verscheen als donkere gaten met minimale niet-specifieke labeling detecteerbaar (Figuur 1). Bij lage vergrotingen werd variabel intense granulaire fl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie heeft de potentiële bruikbaarheid van QD universele probes voor CLEM studies aangetoond. De 585 nm QD nanodeeltjes gebruikt toonde lichte en stabiele fluorescentie wanneer bekeken door groothoek licht microscopie en waren direct waargenomen door TEM. Een eerdere studie van een van de onderhavige auteurs aangetoond QD ook geschikt voor superresolutie lichtmicroscopie 7 zijn. Hun fotostabiliteit was vooral handig voor langere periodes bekijken en lange imaging belichtingen. QD kan ook worden gebruik.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have no conflict of interest to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium cacodylateProscitechC0205Harmful chemical
Osmium tetroxideProscitechC010Use only in fume hood
Uranyl acetateUnivar-Ajax569Hazardous chemical
Ethanol 100%FronineJJ008
Acetone 100%FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Sodium metaperiodateAnalar BDH10259
anti-somatostatin antibodyDakoA0566
Antibody diluentDakoS3022
Qdot 585 Streptavidin Conjugate InvitrogenQ10113MP
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibodySigmaB7389-1ML
Glutaraldehyde 50%EMS16320
Normal goat serumInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid BR0014G
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
MicromouldsProscitechRL063
Diamond knifeDiatomeUltra 45
Transmission electron microscopeFEIMorgagni 268D
Fluorescence light microscopeCarl ZeissAxioscope A1
Grids 300 mesh nickel (thin bar)Agar ScientificG2740N
UltramicrotomeRMCPowertome
TEM camera control softwareSoft Imaging SystemAnalySISVersion 3.0
Image processing softwareAdobe Systems IncorporatedPhotoshop CS2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron micr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Correlative Light Electron MicroscopyQuantum Dot NanoparticlesImmunocytochemical StudiesTransmission Electron MicroscopyWidefield Fluorescence MicroscopySomatostatinoma Tumor TissueStreptavidin Conjugated QDsNickel Grid PreparationAntibody Labeling ProtocolFluorescence TEM Overlay

Related Articles