Aggregate Size Optimization in Microputjes voor Suspension basis Cardiac Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Summary

Gebruikelijke werkwijzen tot inleiding suspensie geaggregeerde basis cardiale differentiatie van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geplaagd cultuur heterogeniteit met betrekking tot de totale grootte en vorm. Hier beschrijven we een robuuste methode voor cardiale differentiatie gebruik microputjes genereren maat gecontroleerde HPSC aggregaten gekweekt onder omstandigheden cardiale bevorderen.

Abstract

Cardiale differentiatie van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) wordt typisch uitgevoerd in suspensie van celaggregaten. Conventionele aggregaatvorming van hPSC's omvat het dissociëren van celkolonies in kleinere klonten, waarbij de groottecontrole van de klonten grofweg wordt bepaald door het cellensuspensie te pipetteren totdat de gewenste klompgrootte is bereikt. Een van de belangrijkste uitdagingen van conventionele aggregaatgebaseerde cardiac differentiatie van hPSC's is dat cultuurheterogeniteit en ruimtelijke desorganisatie leiden tot variabele en inefficiënte cardiomyocytc yields. Wij en anderen hebben eerder gerapporteerd dat de grootte van aggregaten van humane embryonale stamcellen (hESC) kan worden gemoduleerd om de efficiëntie van cardiac inductie te optimaliseren. We hebben deze uitdaging aangepakt door een schaalbare, microwell-gebaseerde aanpak te gebruiken om fysische parameters van aggregaatvorming te beheersen, specifiek de grootte en vorm van de aggregaten. De methode die we hier beschrijven bestaat uit geforceerde aggregatie van gedefinieerde hPSC-aantallen in microwells, en de daaropvolgende cultivatie van deze aggregaten in omstandigheden die cardiac inductie richten. Dit protocol kan gemakkelijk worden geschaald, afhankelijk van de grootte en het aantal gebruikte wells. Door deze methode te gebruiken, kunnen we consistent kweekoutputs bereiken met cardiomyocytc frequenties groter dan 70%.

Introduction

In vitro celcultuur kan worden uitgevoerd onder een aantal voorwaarden, maar wordt meestal uitgevoerd ofwel in tweedimensionale hechtende voorwaarden of in de driedimensionale ophanging voorwaarden die vollediger recapituleren in vivo systemen uitgevoerd. Bijgevolg is er een toenemende trend in veel onderzoeksgebieden robuuste methoden voor het genereren van driedimensionale weefselconstructen ontwikkelen. In scenario's waarin celtypen en processen vereisen een ondersteunende extracellulaire matrix (ECM) oppervlak en adhesie signalen kunnen driedimensionale kweek worden ingeschakeld via steigers constructen, waarbij cellen worden gekweekt op of in een exogeen ondersteunende matrix ^1. Cellen en processen die niet hechting nodig hebben om een ondersteunende matrix kan in suspensie als unscaffolded systemen vooral of uitsluitend cellen (die dan kunnen overgaan tot hun eigen endogene matrices genereren) ^2,3 samengesteld worden uitgevoerd. Hier presenteren we een protocol voor cardiale differentiatie of menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs - stamcellen kan uitlopen elk type cel in het lichaam, hetzij uit embryonale of andere bronnen) in grootte gecontroleerde, uniform, unscaffolded aggregaten.

Differentiatie van hPSCs als suspensie aggregaten wordt geteisterd door grote variaties in de totale omvang, zowel binnen een run en tussen de runs. Deze variatie is het gevolg van de methode die karakteristiek voor deze aggregaten te genereren, die mechanische dissociatie van celkolonies omvat. Om deze variabiliteit te verminderen, hebben een aantal benaderingen gebruikt om het aantal cellen per aggregaat en aggregaatdiameter en uniformiteit controleren. Voorbeelden omvatten de vorming van aggregaten in microcentrifugebuizen ⁴ of hangende druppels ^5, micropatterning gedefinieerd tweedimensionale HPSC kolonies ⁶ die vervolgens kunnen worden overgedragen suspensie of centrifugering van cellen in U- of V-bodem meerputjesplaten ^{7,8, 9.} Echter, al deze ca.oaches worden beperkt door hun lage omzet van de totale productie. Well-systemen maken gebruik van een soortgelijke benadering V-bodemplaat systemen, maar de kleinere omvang van de microputjes (in dit protocol elk met een breedte van 400 pm) maakt de vorming van grotere aantallen uniforme aggregaten uit een kweek-putje (standaard diameter van ~ 15,5 mm bevattende ~ 1200 microputjes) dan zou worden gegenereerd uit een gehele V-bodemplaat ^10. Gefundeerd aggregaatvorming is gebruikt in een aantal instellingen waaronder differentiatie van hPSCs tot ¹¹ ectodermale, endodermale ^12, mesodermale ¹³ en ¹⁴ extraembryonic lot; chondrogenese van mesenchymale stamcellen ^15; generatie uniform substraten voor toxicologische screening ^16; en onderzoeken van Mechanobiology ^17.

Een belangrijke uitdaging bij het ontwikkelen van robuuste productie protocollen voor de productie van HPSC-afgeleide cardiomyocytes heeft het gebrek aan reproduceerbaarheid van de cardiale differentiatie efficiency tussen runs geweest. We hebben eerder aangetoond dat deze variabiliteit kan worden toegeschreven aan de heterogeniteit in het uitgangsmengsel HPSC waarin zowel zelfvernieuwend hPSCs en differentiëren van cellen die genen geassocieerd met endoderm en neurale differentiatie ^6,18 expressie omvat. Signalen uitgescheiden door deze cellen differentiëren invloed cardiale inductie. Concreet extraembryonic endoderm bevordert cardiale inductie, terwijl de neurale voorlopercellen remmen cardiale inductie. Bij HPSC aggregatie, cellen in het aggregaat te differentiëren en zo te organiseren dat ongedifferentieerde hPSCs zijn omgeven door een laag van extraembryonic endoderm cellen die zich ontwikkelen op het totale oppervlak ^13. Door het regelen aggregaatgrootte, kunnen we de verhouding van cardiale inducerende endoderm cellen ongedifferentieerde hPSCs (oppervlak tot volumeverhouding) moduleren en deze verhouding te optimaliseren voor maximale cardiale inductie ^13.

Protocol

1. Bereiding van mediumcomponenten

1. Bereid Wash Medium. Per 100 ml van DMEM / F12, voeg 1 ml 100 x penicilline / streptomycine (Pen / Strep), 1 ml 100x L-glutamine en 5 ml serum vervangen.
2. Bereid de chemisch gedefinieerde Basal Cardiac inductiemedium volgens de instructies van de fabrikant.
3. De volgende voorraadoplossingen reagentia voor media die worden gebruikt in dit protocol.
   1. L-Ascorbinezuur: Bereid een voorraadoplossing van 5 mg per ml in 4 ° C, steriel ultrazuiver water op in een conische buis.
      1. Laat deze oplossing op ijs en vortex de buis periodiek totdat de opgeloste stof volledig is opgelost. Filter-steriliseren ascorbinezuur oplossing om met een 0,22 pm spuitfilter.
      2. Bereid 1 ml aliquots van de oplossing ascorbinezuur en deze fracties bewaren bij -20 ° C. Gebruik een vers ontdooide portie telkens medium wordt bereid.
   2. Op de dag van mediumbereidingVerdun 13 pl monothioglycerol (MTG) in 1 ml basaal Cardiac inductiemedium. Gooi ongebruikt, verdund MTG.
   3. Bereid 1 ml aliquots transferrine (30 mg / ml) op te slaan bij -20 ° C. WINKEL ontdooid porties bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
   4. Bereiden 4 mM zoutzuur (HCl) dat 0,1% runderserumalbumine (BSA). In een zuurkast, voeg 30 ul van 6,0 N HCl-oplossing tot 50 ml ultrapuur gedestilleerd water. Filter-steriliseren van de oplossing met behulp van een 0,22 pm spuitfilter. Voeg 2 ml van 25% BSA oplossing voor de 50 ml HCl-oplossing.
   5. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,1% BSA. Voeg 20 pl 25% BSA oplossing per ml PBS.
   6. Bereid Human botmorfogenetisch Protein 4 (BMP-4) stock-oplossing (10 ng / ul). Los 10 g gevriesdroogd BMP-4 in 1 ml van 4 mM HCl-bufferoplossing met 0,1% BSA. Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C.
   7. Bereid menselijke fibroblast groeifactor 2 (bFGF) stockoplossing(10 ng / ul). Los 10 mg gelyofiliseerd bFGF in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,1% BSA. Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C.
   8. Bereid humane vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) stock-oplossing (5 ng / ul). Los 5 mg gelyofiliseerd VEGF in 1 ml PBS met 0,1% BSA. Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C.
   9. Bereid Activin Een voorraad oplossing (10 ng / ul). Los 10 g gevriesdroogd activine A in 1 ml PBS dat 0,1% runderserumalbumine (BSA). Bereid 50 ul aliquots op te slaan bij -20 ° C.
   10. Bereid remmer van Wnt-2 productie (IWP-2) stockoplossing (10 mM). Los 2 mg IWP-2 in 429 gl dimethylsulfoxide (DMSO). Bereid 10 ul aliquots op te slaan bij -80 ° C.
4. Bereid Compleet Cardiale Inductie Medium. Aan 100 ml van Basal Cardiac Inductie Medium, voeg 1 ml 100x Pen / Strep, 1 ml 100x L-glutamine, 500 pi van transferrine, 1ml vers ontdooide ascorbinezuur en 300 pi van MTG. Gooi niet-gebruikte medium.

2. Voorbereiding van de Microwell Plate

LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet.

1. Voeg 0,5 ml wasoplossing (component kit) aan elk putje dat wordt gebruikt op de plaat. Opdat de oplossing in contact komt het gehele oppervlak in elk microputje, centrifuge de plaat bij 840 xg gedurende 2 minuten.
2. Incubeer de plaat gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur.
3. Zuig de spoeloplossing van de putjes. Was elke well tweemaal als volgt: Voeg 1 ml PBS aan elk putje, plaat gecentrifugeerd bij 840 g gedurende 2 min en daarna zuig het PBS.

3. Vorming van HPSC aggregaten in Microwell Plate

LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet.

1. Plaats Wash Medium in een 37 ° C waterbad.
   LET OP: Het volume dat nodig = 1 ml x aantal putten HPSC die zal worden losgekoppeld.
2. Distantiëren hPSCs naar enkele cellen
   OPMERKING: Deze stappen beschrijven de dissociatie van cellen gekweekt op 6 well platen - het reagens volumes kan proportioneel worden geschaald voor andere cultuur formaten.
   1. Zuig het kweekmedium uit elk HPSC cultuur goed voor dissociatie. Spoel elk putje met 1 ml dissociatie enzym en vervolgens onmiddellijk zuig dissociatie enzym uit elk putje.
      OPMERKING: Resterende dissociatie enzym moet voldoende zijn om de cellen te scheiden.
   2. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 3 min.
   3. Voeg 1 ml van wasmedium aan elk putje en mechanisch scheiden van de cellen van het weefsel kweekoppervlak pipetteren het wasmedium met een P1000 micropipettor via weefselkweek oppervlak. Als de dissociatie lijkt onvolledig en celklonten blijven, laat de suspensie door een zeef op dit punt.
   4. Breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis en opslagde buis in de incubator terwijl de celtelling wordt uitgevoerd in de volgende stap.
   5. Voer een celgetal:
      1. Pipetteer 10 ul monster van de celsuspensie verzameld in de vorige stap. Voeg 30 pi van trypan Blue en meng de schorsing goed door pipetteren.
      2. Transfer 10 pi Trypan Blue-gekleurde cellen aan elke kamer van een hemocytometer en visualiseren onder de omgekeerde microscoop met 10x objectief. Tel de cellen.
   6. Vanaf het celgetal resultaten, berekenen hoeveel putten kan worden gezaaid met 1,2 x 10 ⁶ cellen per putje van de microwell plaat. Bereken Aggregatie Medium vereist om de cellen te zaaien op 1 ml per putje.
   7. Bereid aggregatie medium. Per 10 ml van volledige Cardiac inductiemedium, voeg 0,5 pl BMP4 voorraadoplossing (eindconcentratie = 0,5 ng / ml) en Y-27.632 ROCK Inhibitor (eindconcentratie = 10 uM).
   8. Verwijder de conische buis met de hPSCs uit de incubator en centrifugalege de buis bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het wasmedium en resuspendeer de cellen in aggregatie medium bij een dichtheid van 1,2 x 10 ⁶ cellen per ml.
   9. Zuig het PBS-wasoplossing uit elk putje van de microwell plaat. Met een P1000 micropipettor, verdelen en zaad 1 ml van de celsuspensie aan elk putje van de microwell plaat. Een groot aantal putten zaad periodiek vortex de celsuspensie te voorkomen regelen.
   10. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten. De plaat onder de microscoop te bevestigen cellen gecentrifugeerd om de bodem van elk microputje.
   11. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 ° C in een _5% CO2, 5% _O2 (hypoxische) incubator.

4. Cardiale Inductie Fase 1

1. Een dag na de samenvoeging (dag 1), de voorbereiding van de vereiste volume van fase 1 inductie medium (voor een plaat met 24 putjes, volume = 1 ml x aantal putten). Voor 1 ml compleetcardiale inductiemedium, voeg 1 pl BMP4 voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 10 ng / ml), 0,5 pi bFGF voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 5 ng / ml) en 0,6 ui activine A (eindconcentratie = 6 ng / ml). Plaats het medium in een 37 ° C waterbad gedurende tenminste 15 minuten.
2. Verwijder de microwell plaat uit de incubator. Inspecteer de aggregaten onder de microscoop. In vergelijking met onmiddellijk post-centrifuge aggregatie, moeten ze intact met gladde randen (ronder en minder vierkant dan de vorige dag) verschijnen.
3. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de aggregaten in de microputjes verstoren:
   1. Houd de microwell plaat horizontaal niveau (bijv., Niet kantelen). Voor elke put op de plaat microputje, plaatst de punt van een P1000 micropipettor aan het oppervlak van het kweekmedium en tegen de rand van de put.
   2. Verwijder langzaam het medium voorzichtig de aggregaten niet te verstoren onderaan de microputjes. Na het verminderen van thij gemiddeld niveau tot ongeveer 1 tot 2 mm van de getextureerde microputje oppervlak langzaam kantelen de plaat medium verzamelen aan één zijde van de put (nadat het volume voldoende laag is vloeiende beweging sterk verminderd en is het gemakkelijker om aggregaten voorkomen dat opgeheven uit hun individuele microwells). Langzaam pipet de resterende medium in de put.
4. Om vers Fase 1 Inductie Medium toevoegen terwijl het waarborgen van de aggregaten in hun individuele microwells blijven: Teken 1 ml van fase 1 inductie medium met een P1000 micropipettor. Houd de pipetpunt tegen de binnenrand van de put en langzaam bereid het medium tegen de binnenwand van de put. Herhaal dit voor de resterende putten.
5. Zet de plaat in de incubator onder hypoxische condities gedurende 3 dagen.

5. Cardiale Inductie Fase 2

1. Op dag 4, plaats wasmedium (volume = aantal putten x 2 ml) in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min.
2. Bereid de nodige volume Fase 2 inductiemedium (volume = aantal putten x 1 ml) per ml compleet Cardiac inductiemedium, voeg 2 pl VEGF voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 10 ng / ml) en 0,5 gl IWP-2 stock-oplossing (uiteindelijke concentratie = 5 pm). Plaats de voorbereide Fase 2 Inductie medium in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min.
3. Met een 5 ml serologische pipet, verzamel de aggregaten uit elk putje van de microwell plaat en verzamel het aggregaat suspensie in een 15 ml conische buis (laat maximaal 10 putjes per 15 ml buisje).
4. Laat de aggregaten te regelen voor 15 min in een zuurstofarme incubator.
   OPMERKING: Deze stap is belangrijk om enkele cellen en celresten gescheiden van de intacte aggregaten.
5. Zuig het supernatant en resuspendeer de aggregaten in 10 ml van de voorverwarmde wasmedium om resterende inductieve cytokinen verwijderen (bijvoorbeeld activine A een potent signaalmolecuul zelfs bij zeer lage concentrations).
6. Centrifugeer de aggregaten bij 50 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde aggregaten in de voorverwarmde inductie 2 Medium.
7. Breng de totale schorsing van een 24-well ultra-low attachment (ULA) plaat 1 ml per putje. Let op de aggregaten onder de microscoop als uniforme, strakke cel clusters. Incubeer onder hypoxische condities tot en met dag 6.

6. Cardiale Inductie Fase 3

1. Op dag 6, bereidt de nodige volume Fase 3 Inductie Medium (volume = aantal putten x 1 ml). Voor 1 ml compleet Cardiac inductiemedium, voeg 2 pl VEGF voorraadoplossing (uiteindelijke concentratie = 10 ng / ml) en 0,5 pl voorraadoplossing bFGF (uiteindelijke concentratie = 5 ng / ml). Plaats bereid Fase 3 inductiemedium in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min.
2. Gebruik een 5 ml serologische pipet tot de aggregaten conische buizen overbrengen naar 15 ml, bundelen tot 10 ml aggregaats per buis.
3. Laat 10 min voor de aggregaten te vestigen. Zuig het supernatant en resuspendeer de aggregaten in de voorverwarmde Fase 3 inductiemedium. Met behulp van een 5 ml serologische pipet, te herverdelen de aggregaten in een 24-well ULA plaat 1 ml per putje.
4. Op dag 10, bereidt de nodige volume Fase 3 Inductie Medium (volume = aantal putten x 1 ml) volgens Stap 6,1.
5. Gebruik een 5 ml serologische pipet tot de aggregaten overbrengen naar 15 ml conische buizen, bundelen tot 10 ml per buis aggregaten.
6. Laat 10 min voor de aggregaten te vestigen. Zuig het supernatant en resuspendeer de aggregaten in Fase 3 Inductie Medium. Met behulp van een 5 ml serologische pipet, te herverdelen de aggregaten in een 24-well ULA plaat 1 ml per putje.
7. Incubeer onder hypoxische omstandigheden gedurende twee dagen. Op dag 12, beginnen de cellen te incuberen in normoxische zuurstofniveaus gedurende de rest van de kweekperiode (37 ° C, _20% O2, _5% CO2).
   NOTITIE:Na dit tijdstip, cellen niet meer gekweekt onder hypoxische omstandigheden.
8. Herhaal deze volledige medium uitwisseling (Stappen 6.2 en 6.3) om de 4 dagen, te beginnen op dag 14 tot cel oogst (meestal piek cardiomyocyt concentraties waargenomen na dag 14 van differentiatie).

7. Flowcytometrieanalyse van troponine T (cTnT) Expression Frequentie van Microwell Cultuur Output

1. Distantiëren de aggregaten als volgt:
   1. Gebruik een 5 ml serologische pipet 1 en aggregaten overbrengen naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer de aggregaten bij 50 xg gedurende 2 min en voorzichtig zuig de supernatant.
   2. Voeg 1 ml vers opgelost 1 mg / ml collagenase type II oplossing van de aggregaten. Breng de aggregaat suspensie naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Incubeer de aggregaten collagenase type II een nacht bij kamertemperatuur.
   3. De volgende dag, gebruik een P1000 micropipettor voorzichtig dissociëren de aggregatenin een homogene enkele celsuspensie. Wanneer de aggregaten niet gemakkelijk dissociëren de aggregaten bezinken, zuig de supernatant en incubeer de aggregaten in 700 pl dissociatie enzym gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Voorzichtig pipet de aggregaten 1-2 maal met een P1000 micropipettor dissociëren.
   4. Verdun de dissociatie enzym Voeg 700 ul van wasmedium met 14 ui van 1 mg / ml DNAse voorraadoplossing. Neem een ​​10 ul monster tot een celgetal uit te voeren, en centrifuge de resterende suspensie met behulp van een bench-top microcentrifuge bij 300 g gedurende 2 minuten.
2. Voer een celtelling: Vlekken de telling 10 pl monster met een gelijk volume van trypan blauw en tellen met een hemocytometer.
3. Verwijder de microcentrifugebuis van 1,5 ml dat de resterende cellen van het microcentrifuge. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in een concentratie van 200.000 tot 500.000 cellen per 100 pl, in Hanks gebalanceerde zoutoplossing bevattende2% foetaal runderserum (HF).
4. Voor elke voorwaarde, overdracht 100 ul celsuspensie per putje tot 2 putjes van een 96-well plaat (een putje wordt gekleurd met de cTnT antilichaam en de ander het secundaire antilichaam controle heeft).
5. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant met een meerkanaals micropipettor.
6. Fixeer de cellen Voeg 200 pl fixeeroplossing (kit component) per putje en incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
7. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 minuten. Gebruik een meerkanaals micropipettor aan het supernatant voorzichtig terugtrekken uit de putjes. Gooi de bovenstaande vloeistof in een container paraformaldehyde afval.
8. Was de vaste cellen tweemaal Voeg 200 ul van HF aan elk putje. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en herhaal het wassen stap nog een keer. Gefixeerde cellen kan worden bewaard tot een week in HF bij 4 ° C.
9. Permeabilize de cellen:
   1. Centrifugeer de plaat bij 300xg gedurende 2 minuten.
   2. Voeg 100 ul van permeabilisatie oplossing (component kit) aan elk putje en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
   3. Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 2 min en zuig de supernatant.
10. Bereid een master mix van anti-cTnT in HF in de optimale concentratie voor het gegeven partijnummer (De optimale verdunning wordt bepaald door titratie en typisch varieert van 1: 500 tot 1: 2000).
11. Voor elke voorwaarde (2 waterputten per conditie), voeg 100 ul van master mix tot een goed (gekleurd monster) en 100 pl vlakte HF aan de andere goed (secundair antilichaam controle). Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
12. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 2 min. Zuig het supernatant en voeg 200 ul per putje van HF. Herhaal deze wasstap nog een keer.
13. Bereid een master mix van het secundaire antilichaam. Breng een hoeveelheid van HF die overeenkomt met 100 gl van elk putje (secundair antilichaam controle en-CTnT gekleurd) behandeld. Voeg 1 pl geit anti-muis secundair antilichaam APC per 200 gl HF (1: 200 verdunning).
14. Vlekken op de monsters. Voeg 100 gl kleuroplossing aan elk putje (zowel het secundaire antilichaam controle en anti-cTnT gekleurd putjes). Incubeer cellen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 min (houd de plaat bedekt of in het donker na toevoeging fluorescerend secondair antilichaam te voorkomen fotobleken).
15. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 2 min. Zuig het supernatant en voeg 200 ul per putje van HF. Herhaal deze wasstap nog een keer.
16. Breng de monsters 5 ml ronde bodem flowcytometer analyses buizen voeren flowcytometrie voor signaalverwerking in de APC kanaal met de standaardprotocollen voor het instrument ^19.

Results

-Size gecontroleerde aggregaten van hPSCs effectief kan worden gevormd met het microputje systeem, slechts afhankelijk van de concentratie van cellen en de microwell oppervlak. Na een korte centrifugatie waaraan onvoldoende aantallen cellen (1000 in dit protocol) samengebracht in elk microwell (Figuur 1A). Belangrijk is dat deze cellen herstellen intracellulaire verbindingen binnen 24 uur, en mag niet langer goed te vullen het, maar verschijnen als compact aggregaten met gladde randen (Figuur 1B). Deze aggregaten vormen de uitgangsmaterialen voor verdere differentiatie naar een cardiale lot. Als de cellen niet te strak clusters te vormen, suggereert dit mogelijk celdood volgende dissociatie en reaggregation, en de geschiktheid van enkele cel passage en ROCK inhibitor concentraties voor een bepaalde cellijn moeten worden onderzocht. De volgende drie dagen in microwells laten weinig verandering in het totaal morphology, hoewel sommige groei evident. Wanneer ze uit de microwells Aggregaten moeten hun ronde dicht opeengepakte morfologie behouden en zijn van een vergelijkbare grootte op elkaar (figuur 1C). ULA cultuur in 24-well platen verdere celexpansie en groei toestaan.

Overdag 8 na toediening eerste activine signalering en Wnt inhibitie, wordt de aggregaten beginnen te verschijnen als grotere en helderder aggregaten (figuur 1D). Tijdens deze periode, zal een aanzienlijke cellulaire puin duidelijk aan de onderkant van elk putje en moet worden verwijderd doordat aggregaten bezinken voordat u media. Af en toe zal een groot aantal aggregaten samensmelten. Dit zal de differentiatie van andere aggregaten in de put remt, hoewel deze "super aggregaten" meestal niet de morfologische veranderingen waargenomen met kleinere aggregaten vertonen en minder kans om volledige differentiatie te ondergaan.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> de differentiatie leidt tot opvallende morfologische veranderingen in de aggregaten met een verhoogde grootte en het uiterlijk van georganiseerde vezelige gebieden. Overdag 12, kan de aanbestedende aggregaten worden waargenomen. Deze zullen altijd worden samengesteld uit grote, transparante cellen en vaak ook grote extracellulaire matrix buiten het aggregaat (figuur 2). Terwijl de totale hele contracties wijzen op een succesvolle differentiatie, kan hartmerkers expressie ook worden waargenomen in aggregaten die niet lijken te contracteren. Na dissociatie van aggregaten en immunokleuring, zal een meerderheid van de cellen positief voor de cardiomyocyten marker cTnT door flowcytometrie (figuur 3) zijn. De expressie van deze marker is stabiel in de cellen en kunnen aggregaten worden waargenomen laat dag 19 van differentiatie.

1.jpg "/>
Figuur 1: Chronologie van HPSC gedifferentieerd naar een cardiale lot Onmiddellijk na aggregatie, cellen bijna elke microwell (A) in te vullen.. Een dag later, lijken de aggregaten gecondenseerd en glad (B). Deze morfologie blijft zelfs wanneer de aggregaten van de microwells verwijderd en uitgeplaat in putjes (C). Per dag 8, aggregaten beginnen uit te breiden en te verschijnen lichter van kleur (D). Schaal bar:. 250 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Aggregaten Begin Contracting door Dag 12 van Differentiatie Na zes dagen in de Cardiale Inductie Fase 3 Medium, krachtig aggregaat-brede contracties werden waargenomen (bovenste paneel. Relaxatie, middenpaneel: contractie). Het onderste paneel is afgeleid van het aftrekken van de bovenste en middelste panelen, met de meest significante verschillen te zien zijn als zwart of wit (pijlpunten). Schaal bar:. 250 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3:. Immunokleuring voor cardiale troponine T in gedifferentieerde hPSCs op dag 17, de meeste van de cellen positief zijn voor cardiale troponine T door flowcytometrie (dichte histogram). Ook getoond zijn cellen gekleurd met secundair antilichaam alleen (ongevuld histogram). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het is waargenomen dat efficiënte cardiale differentiatie van pluripotente stamcellen is een zeer variabel proces. Hoewel het niet verrassend dat verschillende cellijnen vertonen variërende neigingen tot differentiatie vermogen om specifieke celtypen, is waargenomen dat de cardiale differentiatie efficiëntie sterk schommelt tussen repliceren loopt via dezelfde cellijn ^6. De hier beschreven protocol richt zich op een belangrijke bron van deze variabiliteit door het direct regelen van de ingang van het aantal cellen per aggregaat. Verder te verminderen variabiliteit tussen runs, wordt aanbevolen HPSC lijnen aangepast voor enkele cel passage gebruikt, aangezien deze soort HPSC uitbreiding en onderhoud geeft consistenter pluripotente populaties met betrekking tot expressiefrequenties van pluripotentie markers (bijv Oct4, Nanog, Tra-1-60, enz.).

Het protocol zoals hier geschreven specificeert een totale grootte van 1000 cellen voor optimale cardiale inductie van het HES-2 embryonale stamcellijn. Om dit protocol om verschillende cellijnen toe te passen, is het essentieel dat een eerste aggregaat grootte van het scherm worden uitgevoerd om de cellijn-specifieke optimale aggregaat maat te bepalen. Hoewel het de procedures niet direct van invloed om hier te volgen, herinneren we de lezer dat veranderingen in de totale omvang en de totale celdichtheid wordt verwacht dat zij zuurstof levering beïnvloeden. Dit kan een relevante overweging in downstream-toepassingen. Bovendien apoptotische celdood is een probleem bij dissociatie van hPSCs enkelvoudige cellen. Daarom is het essentieel om te waarborgen dat ROCK toegediend tijdens geforceerde celaggregatie in microwells aanwezig is. Tenslotte is het essentieel dat op dag 4 van differentiatie de aggregaten goed gewassen verwijderen sporen activine A in de Inductie 1 Medium, voorafgaand aan resuspensie in Induction 2 Medium. Na 4 dagen van differentiatie, activine A bevordert endoderm differentiatie ten koste van mesoderm inductie ^20.

De belangrijkste toepassing van deze techniek is te aggregeren maten die efficiënt cardiale differentiatie bevorderen screenen. Een van de beperkingen van de huidige techniek is dat het een uitdaging om cardiale productie klinisch relevante niveaus middels microwell platen schaal. Opschaling van cardiale differentiatie wordt meestal uitgevoerd in bulk kweekomstandigheden in geroerde suspensie bioreactoren ²¹ uitgevoerd. Daarom, zodra het microwell systeem is gebruikt om aanvaardbare reeksen aggregaatgrootte bepalen efficiënte cardiale inductie, de volgende stap te schalen is bioreactor waaier snelheden die de gewenste celaggregaatafmeting kunnen gegenereerd moet worden.

Een van de belangrijke verschillen van deze techniek met betrekking tot andere werkwijzen voor samengevoegde gebaseerde cardiale differentiatie dat daardoor direct onderzoek naar het moduleren van de effecten van endogene signalering in aggregaten ende co-cultuur van inductieve / remmende weefseltypes met de hPSCs in totaal ^13. Deze types van onderzoeken kan proces ontwikkeling van grootschalige cardiale productie te informeren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologische veiligheidskast
Pipetthouder
Serologische pipetten (5 tot 25 ml)
Aspirator
Aspirator of Pasteur pipetten
15 en 50 ml kegelbuisjes
Afzuigkap
0,22 µm spuitfilter
5% CO2, 5% O2, en vochtigheid gecontroleerde cellen kweek incubator			Hypoxic (lage zuurstof) incubator
5% CO2, 20% O2, en vochtigheid gecontroleerde cellen kweek incubator
Lage snelheid centrifuge met een zwevende emmer rotor voorzien van een platenhouder
P2, P20, P200, en P1000 micropipetten en bijbehorende tips
Omgekeerd microscoop met 4X, 10X en 20X fase objectieven
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 wel platen	Corning/Costar	3473
1,5 ml microcentrifuge buisjes
Bench-top microcentrifuge
L-Ascorbic Zuur	Sigma-Aldrich	A4403
Steriele Ultrapuur gedistilleerd water	Sigma-Aldrich	W3500
Vortex
IJs
-20 °C vriezer
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxisch; Aliquoting van MTG wordt sterk aanbevolen om oxidatie door herhaald openen te minimaliseren. Aliquots kunnen tot 3 maanden bij 4 °C worden bewaard, -20 °C wordt aanbevolen voor langdurige opslag.
StemPro-34 Medium	Thermo Fisher Scientific	10639-011	Basal Cardiac Induction Medium; Het supplement wordt bewaard bij -20 °C en het basale medium bij 4 °C.
Transferrine	Roche	10652202001
BMP-4	R&D Technologies	314-BP
bFGF	R&D Technologies	233-FB
VEGF	R&D Technologies	293-VE
Activine A	R&D Technologies	338-AC
IWP-2	Reagents Direct	57-G89
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
Bovien Serum Albumine (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
Zoutzuur	Sigma-Aldrich	258148	Corrosie
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660
100x Penicilline/Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140
100x L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
TrypLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563	Dissociatie enzym
Hemocytometer
Trypan Blauw
Aggrewell 400 platen	StemCell Technologies	27845	Microwell Platen
Aggrewell Spoel Oplossing	StemCell Technologies	7010	Microwell Spoel Oplossing
Y-27632 ROCK Inhibitor	Tocris	1254
Collageenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14025092
Foetaal bovien serum	Thermo Fisher Scientific	12483
96 wel plaat (voor FACS kleuring)
Intraprep Permeabilisatie Reagens	Beckman Coulter	IM2389	Kit met 2 onderdelen: Fixatie Oplossing en Permeabilisatie Oplossing; Toxisch
cTnT antilichaam	Neomarkers	MS-295
geit anti-muis-IgG APC antilichaamThermoFisher	Molecular Probes	A865
5 ml ronde bodem flow cytometry buisjes	FACS machine afhankelijk