Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54322

⸱

18 augustus 2016

 ,  ,  , 
1CHU de Québec Research Centre, 2Department of Molecular Medicine, Laval University, 3Department of Surgery, Laval University

In dit artikel

Samenvatting

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Samenvatting

Zoogdiercelcultuur in monolagen wordt algemeen gebruikt om diverse fysiologische en moleculaire processen te bestuderen. Echter, deze benadering van de groeiende cellen te bestuderen genereert vaak ongewenste artefacten. Daarom celkweek in een driedimensionale (3D) omgeving, vaak met behulp van extracellulaire matrixcomponenten, zich tot een interessant alternatief vanwege de grote gelijkenis met de natuurlijke in vivo weefsel of orgaan. We ontwikkelden een 3D celkweek systeem met twee compartimenten, namelijk (i) een centraal compartiment met kanker cellen ingebed in een collageen gel werkt als een pseudo-primaire macrospherical tumor en (ii) een perifere celvrije compartiment gemaakt van een fibrine gel, dat wil zeggen een extracellulaire matrix component verschilt van die in het centrum, die kankercellen kunnen migreren (invasie vooraan) en / of vormen microsferische tumoren die secundaire of satelliet tumoren. De vorming van satelliet tumoren in het perifere compartimentopvallend gecorreleerd aan de bekende agressiviteit metastatische oorsprong van de natieve tumorcellen die deze 3D kweeksysteem uniek. Deze celkweek benadering kan worden gesteld kankercel invasiviteit en motiliteit, cel-extracellulaire matrix interacties als een methode om antikankergeneesmiddel eigenschappen evaluatie uitgevoerd.

Inleiding

De fundamenteel biomedische kenmerken van kankercel invasie / migratie en daaropvolgende metastase inrichting is het onderwerp van intens onderzoek 1,2. Metastase is de ultieme fase van kanker en de klinische behandeling blijft ongrijpbaar. Een beter begrip van metastase op cellulair en moleculair niveau zal de ontwikkeling van efficiëntere therapieën 3 mogelijk.

Verschillende eigenschappen van metastatische cellen kan worden verkend in vitro 4 met inbegrip van hun stemness en potentieel om een overgang staat (bv epithelioid-mesenchymale transitie) te verwerven om te migreren en binnenvallen in en uit de primaire tumor 5. Echter, de in vitro beoordeling van de invasie / metastasering processen een uitdaging sinds het vrijwel exclusief de bijdrage van het bloed / lymfatische circulatie. Organotypische culturen die tumor fragmenten insluiten in collageen gels hebben Previously gebruikt om kanker agressiviteit controleren. Hoewel de complexiteit van tumoren wordt bewaard (bijvoorbeeld de aanwezigheid van niet-kankercellen), tumorfragmenten blootgesteld aan beperkte diffusie medium, steekproeven variatie, en een overmatige groei van bindweefselcellen 6. Een alternatieve werkwijze bestaat erin groeiende kanker cellen in componenten van de extracellulaire matrix (ECM), die de driedimensionale (3D) celomgeving nabootst. De proliferatie van borstkankercellijnen in een collageen gel en / of basismembraan-afgeleide matrix onder de meest bestudeerde voorbeelden van 3D celkweek. Door het gebruik van specifieke 3D celcultuur-omgevingen, kan het ongeorganiseerd assemblage waargenomen voor borstkankercellen gekweekt onder standaard omstandigheden worden omgekeerd om de spontane vorming van de melkklieren acini en buisvormige structuren 7-10. Bovendien is de vorming van multicellulaire bolvormige tumoren afgeleid van adenocarcinoom cellen bijeen met verschillende technieken (bijvoorbeeld, opknoping druppels, drijvende bolletjes, agar inbedding) Nu vormt de meest gebruikte 3D celcultuur assay 11-13. Maar deze assay beperkt door de beperkte set kankercellijnen die sferoïden kunnen vormen en de korte periode om cellen te bestuderen in deze voorwaarden.

In dit gevisualiseerd techniek we hierin introduceren geavanceerde 3D ​​celkweektest wanneer kankercellen plaats zijn ingebed in een collageengel om de in vitro vorming van een pseudo-primaire tumor die als alternatief kan worden bekleed met een kelder membraan-afgeleide matrix mogelijk. Eenmaal gevormd wordt de pseudo-primaire tumor dan ingeklemd in een acellulair matrix (fibrine gel in het onderhavige geval), waardoor de kankercellen aan het grensvlak tussen de twee compartimenten matrix kan passeren (zie figuur 1). Interessant secundaire tumor-achtige structuren afkomstig van de pseudo-primaire tumor met agressieve kankercellen verschijnen in hetfibrinegel. 3D dergelijk teeltsysteem biedt de vereiste flexibiliteit te onderzoeken, bijvoorbeeld antikankergeneesmiddelen, genexpressie en cel-cel en / of cel-ECM interacties 14-16.

figure-introduction-1
Figuur 1:.. Overzicht van de methode Schematisch overzicht van de methode om de 3D-celcultuur systeem als een model voor kanker studies genereren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Geen ethiek overweging sinds dierlijke en menselijke kankercellen werden gekocht of welwillend ter beschikking gesteld aan ons.

1. Het maken van Collageen pluggen (Pseudo-primaire tumor)

  1. Bereid een collageen dispersie. Type I collageen uit rattenstaart pezen (RTT) kan zowel worden gewonnen en gesteriliseerd zoals eerder gemeld 17, of direct te bestellen. Verspreiden gevriesdroogde RTT collageen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N azijnzuur) met behulp van een blender (high speed-instelling; vijf runs 2 min) voor een uniforme menging.
  2. Harvest (trypsine-EDTA, meestal) en gebruik trypan blauw exclusie voor het tellen van levensvatbare cellen met een hemocytometer. Stel de gewenste celdichtheid (5 x 10 4 cellen per plug).
  3. Bereid alle oplossingen (NaOH, foetaal runderserum, DMEM 5x, NaHCO3) afzonderlijk (tabel 1) onder steriele omstandigheden en houden op ijs gekoeld. Opmerking: De volgorde van toevoeging van de verschillende oplossingen is belangrijk om osmotische schokken of zuur in cellen voorkomen.
  4. Uitvoeren cel dispersie (1,25 x 10 6 cellen) in de uiteindelijke collageen oplossing (5 ml) zo snel mogelijk. Meng goed (door en neer te pipetteren) terwijl het vermijden van luchtbellen, en dan snel distribueren 200 ul van de kant-en-klare oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. Voorzichtig staking van de multi-well plaat op het werkgebied oppervlak van de celkweek kap om luchtbellen te verwijderen en om de oplossing gelijkmatig verdeeld in de putten.
  5. Na het bijvullen alle putjes (deze stap duurt ongeveer 15-20 minuten per 96-well plaat), opslaan in de incubator.
  6. Incubeer de plaat bij 37 ° C van 2 uur 's nachts. Collageen gelering (dwz fibrillogenese) plaatsvindt binnen 30 minuten. Voeg cultuurmedium (100 pl / putje) aan de kweek van een nacht incuberen voeren.

2. Eerste laag van fibrine gel

  1. Fibrinogeen Solution Voorbereiding.
    LET OP: De dezelfde partij van fibrine gel moet idealiter worden gebruikt voor meer reproduceerbare results, fibrine gelvorming kan variëren tussen de verschillende batches van commerciële gevriesdroogde fibrinogeen.
    1. Gebruik altijd een vers bereide fibrinogeen-oplossing. Breng het gevriesdroogde fibrinogeen op kamertemperatuur voor het openen van het flesje te hydrateren kristalvorming te voorkomen.
    2. Geleidelijk los het fibrinogeen in voorverwarmde (37 ° C) Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met Ca2 + / Mg2 + in een werkende concentratie van 3 mg / ml (eens het bereiden van een 15% overmaat van de minimale vereiste eindvolume : bijvoorbeeld 17,25 mg in 5,75 ml van een 5 ml oplossing).
      1. Add voorverwarmde HBSS druppelsgewijs bij eerste fibrinogeenfragmenten solubiliseren. Breek grotere fragmenten met een spatel in de beker. Schud de beker af en toe mengen te vergemakkelijken. Gebruik geen opruier plaat tijdens de procedure. Los het resterende poeder door pipetteren de schorsing op en neer.
    3. Houd de fibrinogeen oplossing lauwe terwijl SteriLIZING de oplossing te leiden door een 0,22 urn filter. Opmerking: Als de HBSS is niet warm genoeg of fibrinogeen niet volledig is opgelost, kan de oplossing van het filter verstoppen. Eventueel vervangen filter of twee keer, waarbij het fibrinogeen concentratie kan verlagen en daardoor fibrinestolsel stijfheid.
    4. Suspendeer de cellen van belang (bijvoorbeeld endotheelcellen) in kant-en-klare fibrinogeenoplossing tijdens het instellen van het eindvolume, als alternatieve procedure.
  2. De voorbereiding van de trombine Solutions.
    1. Bereid een voorraadoplossing in DDH 2 O (50 NIH eenheden / ml), vervolgens gesteriliseerd met behulp van een 0,22 pm filter.
    2. Gebruik een fibrinogeen / trombine verhouding ≥1: 0,0075 (v / v) om de fibrine gel genereren.
  3. Het genereren van de fibrine Gel.
    1. Houd de steriele fibrinogeen en trombine voorraad oplossingen op ijs tijdens de volgende stappen. De fibrinegelen mogen vormen in 24-well platen.
    2. Onmiddellijk overlay the oppervlak van elk putje met de fibrinogeen-oplossing (200 ul / putje) met vermijding luchtbelvorming. Werkwijze 6 putjes tegelijk.
    3. Zodra de fibrinogeenoplossing het oppervlak van de putjes volledig bedekt, tilt de plaat bij 45 ° en voeg 1,5 pl trombine oplossing van de eerste put door laten vallen van de trombine in het midden van de put, en dan voorzichtig zwenken de plaat horizontaal voor 1-2 sec.
      1. Laat de plaat in een stabiele positie onder de laminaire stroming kap (5-10 min) tot de gelering / stollingsproces heeft gedaan (NB: het polymerisatieproces mogen niet worden gestoord, bijvoorbeeld door het transporteren van de plaat naar de incubator).
    4. Zodra de eerste zes putten polymeriseren, herhaal dezelfde volgorde (dat wil zeggen de 3 voorgaande stappen) voor de komende zes putten, totdat alle putten zijn verwerkt.

3. De tweede laag van fibrine Gel en ingeklemd Collageen Plug

  1. KeuzeA: (Met behulp van de Collagen Plug Direct).
    1. Zorg ervoor dat de eerste laag van fibrine gel in alle putjes gepolymeriseerd door subtiel het kantelen van de plaat. Plaats de 96-well plaat met de collageengel pluggen aan de zijde van de 24-well plaat (die de fibrine gels) overdracht van de collageen pluggen verlichten.
    2. Één druppel HBSS in elk putje van de plaat dat het collageenmateriaal pluggen.
    3. Verwijder elke collageen stekker uit de put met een dunne naald bevestigd aan een injectiespuit (gebruikt als een handvat) of met behulp van een micro-lepel (zie video). Transfer elk collageen plug op de eerste fibrine gel laag met behulp van een of twee micro-lepels, terwijl ervoor te zorgen dat het collageen plug goed is gecentreerd in de put en dat steriliteit is goed onderhouden.
    4. Overlay de eerder gevormde fibrine gel met de tweede laag fibrinogeenoplossing (300 gl / putje) en het trombine te voeren als beschreven in 2.3, waarbij minimaal 1:. 0,0075 ratio en een reeks van zes putjes tegelijk
  2. Optie B (Coating de Collageen Plug met een dun laagje van Growth Factor-gereduceerde Basement Membrane (GFRBM)).
    1. Koel alle bereide oplossingen en instrumenten vooraf en bewaar ze bij 4 ° C of op ijs (bijvoorbeeld pipetten, tips, reageerbuisjes) tijdens hanteren aangezien ingevroren aliquots van GFRBM zijn zeer gevoelig voor oververhitting frequentie tijdens ontdooien (de instructies van de fabrikant) .
    2. Na verwijdering uit de putjes, genieten van elk collageen plug gedurende 2 minuten in een 1,5 ml centrifugebuis op ijs met 100 ul van een pure GRFBM oplossing.
    3. Transfer elk gecoat plug op de eerste fibrine laag en tegelijkertijd is het goed gecentreerd, zoals eerder beschreven. Incubeer de plug-bevattende platen bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de GRFBM vorming van een gel. Voeg de tweede fibrine laag als in stap 3.1.4.

4. celkweekmedium Voorwaarden

  1. Vul elk putje kweekmedium (400 ui). De kweekmedia en supplementen worden geselecteerd op basis van de cellijn en de testomstandigheden.
  2. aprotinine, een antifibrinolytisch agent kweekmedium voegen tot een eindconcentratie van 100 kallikreïneremmer eenheden (KIE) / ml.
    OPMERKING: Bewaar de platen in een celkweek incubator onder de voor de cellijn geteste omstandigheden.
  3. Vullen kweken met vers medium om de dag of volgens het testschema en voeg aprotinine. Voor het toevoegen vers medium, enigszins kantelt de plaat (een 30-35 ° hoek) en hellen de pipet tegen de zijkant van de put terwijl voorzichtig afzuigen het geconditioneerde medium voortdurend onder toezicht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals eerder vermeld, een interessant kenmerk van deze 3D celkweek test is dat kankercellen niet alleen kunnen migreren van het collageen stekker aan de aangrenzende fibrinegel, maar het ook tot secundaire tumoren (bijvoorbeeld satelliet tumor-achtige structuur). Dit kan direct worden waargenomen met een omgekeerde fase contrast microscoop bij lage en hoge vergroting door de gel dikte, vooral met een lange werkafstand condensor (figuur 2). Met deze 3D celkweek w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Als belangrijke technische voetnoot, is het essentieel dat geen ruimte bij het grensvlak tussen de centrale en perifere gelen. Anders kan het het vermogen van de cellen om te migreren / binnenvallen fibrinegel verminderen. Een ruimte tussen het collageen en fibrine gels kunnen gedurende de eerste 24 uur van de cultuur vormen indien trombine niet correct werd verdund. Het is ook mogelijk dat de cellijn getest kan de collageengel tot krimpen tijdens kweken, waarbij een relatief grote ruimte waardoor vormen tussen beide ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen openbaarmaking.

Dankbetuigingen

Werk gedeeltelijk gefinancierd door Prostate Cancer Canada (subsidie # D2014-4 aan SG en CJD) en de Canadian Institutes of Health Research (subsidie # MOP-111069 aan SG). We willen Dr. Richard Poulin bedanken voor redactionele bijstand en mevrouw Chanel Dupont voor technische bijstand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lyofilisaat collageenSigma-AldrichC7661van rattenstaartpees (oplosbare dispersie) of zelfgemaakt (zie Rajan et al., ref.#14)
Fibrinogeen (gevriesdroogd)Sigma-Aldrich F8630Type I-S, 65 - 85% eiwit met ≥ 75% van het eiwit is klonterbaar
TrombineEMD Chemicals Inc.605157 Gibbstown, NJ; NIH eenheden/mg drooggewogen gewicht 
Growth factor-reduced Matrigel Corning356234Voorheen van BD Biosciences
AprotinineSigma-AldrichA6279  oplossing bij 5 - 10T IU/ml (Trypsine Inhibitor Unit) 
 Micro-lepelsFisher Scientific2140115Fisherbrand Handi-Hold Microspatula
96-wells plaat, ronde bodemSarstedt3925500
24-wells plaatSarstedt3922
Dulbecco's aangepast Eagle's MediumSigma Chemical, Co.D5546DMEM
Foetaal RundserumVWRCAA15-701FBS, Canadese oorsprong.
Trypsine-EDTASigma Chemical, Co.T4049
Hank's Balanced Salt Solution Sigma Chemical, Co.H8264HBSS

Referenties

  1. Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
  2. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
  3. Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
  4. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  5. Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
  6. Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
  7. Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  9. Shaw, L. M. Tumor cell invasion assays. Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).
  10. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
  11. Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
  12. Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
  13. Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
  14. Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
  15. Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
  16. Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
  17. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
  18. Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  19. Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387(2014).
  20. Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
  21. Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
  22. Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5(2013).
  23. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  24. Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
  25. Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
  27. Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Inbedding in collageengelfibrinogel-overlaymigratie van kankercellenapoptose van tumorcellenevaluatie van anticancermiddelencomponenten van de extracellulaire matrixcelluultuurassay
Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.