Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Corneale endotheelcellen (CECs) spelen een cruciale rol bij het behoud van de helderheid van het hoornvlies door actief te pompen. Een verminderd aantal CEC's kan leiden tot hoornvliesoedeem en verminderde gezichtsscherpte. Echter, menselijke CEC's zijn vatbaar voor een verminderd proliferatief potentieel. Bovendien wordt stimulatie van celgroei vaak gecompliceerd door een geleidelijke endotheliaal-mesenchymale transitie (EnMT). Daarom is het begrijpen van het mechanisme van EnMT noodzakelijk om de regeneratie van CEC's met competente functie te faciliteren. In deze studie bereidden we een primaire cultuur van runder CEC's voor door de CEC's samen met het membraan van Descemet van de hoornvlisknop te pellen en we toonden aan dat runder CEC's het EnMT-proces vertoonden, inclusief fenotypische verandering, nucleaire translocatie van β-catenine en EMT-regulatoren snail en slug, in de in vitro cultuur. Verder gebruikten we een cryo-verwondingsmodel van het rattenhoornvliesendotheel om het EnMT-proces in vivo aan te tonen. Gezamenlijk bieden de in vitro primaire cultuur van runder CEC's en in vivo rattenhoornvliesendotheel cryo-verwondingsmodellen nuttige platforms voor het onderzoeken van het mechanisme van EnMT.
Inleiding
Corneale endotheelcellen (CEC's) spelen een essentiële rol bij het behoud van de corneale helderheid en dus het gezichtsvermogen door het reguleren van de hydratatietoestand van de corneale stroma door actief te pompen1. Vanwege het beperkte proliferatieve potentieel van menselijke CEC's neemt het aantal cellen af met de leeftijd, en het herstel van corneale endotheelwonden na verwonding wordt meestal bereikt door celvergroting en migratie, in plaats van celdeling2. Wanneer het aantal CEC's daalt onder een drempel van ongeveer 500 cellen/mm2, kan de dehydratatietosteand van de corneale stroma niet worden gehandhaafd, wat leidt tot bulleuze keratopathie en visuele beperking3,4.
Het beperkte proliferatieve potentieel van menselijke CEC's is toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder verminderde expressie van het epidermale groeifactor en zijn receptor in verouderde cellen5, antiproliferatieve TGFβ2 in het aqueous humor6, en contactremming2,7. Hoewel sommige groeifactoren, zoals basic fibroblast groeifactor (bFGF), de proliferatie in een gekweekt menselijk cornea-endotheel kunnen verhogen, blijft de kweekefficiëntie beperkt8,9. Bovendien kunnen CEC's een fenotypische verandering ondergaan tijdens ex vivo expansie, vergelijkbaar met epitheliale-mesenchymale overgang (EMT)10-13. Endotheel-mesenchymale overgang (EnMT) wordt gekenmerkt door destabilisatie van celverbindingen, verlies van apicale-basale polariteit, cytoskeletaal herschikking, expressie van alfa gladde spieractine en type I collageensecretie14. Al deze kenmerken kunnen de normale functie van CEC's afbreken, waardoor het gebruik van ex vivo gekweekte CEC's in weefselengineering wordt belemmerd. Bovendien is EnMT geassocieerd met de pathogenese van verschillende corneale endotheelziekten, waaronder Fuchs endotheel corneale dystrofie en retrocorneale membraanvorming15,16. Daarom kan het begrijpen van het mechanisme van EnMT helpen bij het manipuleren van het EnMT-proces en het bevorderen van de regeneratie van CEC's om een competente functie mogelijk te maken.
In deze studie beschreven we een methode voor het isoleren van boviene CEC's van de corneale button. In de primaire cultuur in vitro werd het EnMT-proces waargenomen, inclusief een fenotypische verandering, de nucleaire translocatie van β-catenine, en EMT-regulatoren snail en slug. We beschreven verder een methode voor het aantonen van EnMT in vivo door gebruik te maken van een model van cryo-letsel aan het ratten-cornea-endotheel. Met behulp van deze 2 modellen hebben we aangetoond dat marimastat, een breed-spectrum matrix metalloproteinase (MMP)-remmer, het EnMT-proces kan onderdrukken. De beschreven protocollen faciliteren de gedetailleerde analyse van het EnMT-mechanisme en de ontwikkeling van strategieën voor het manipuleren van het EnMT-proces voor verdere klinische toepassing.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al de gevolgde procedures in deze studie overeenkomen met de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de National Taiwan University Hospital.
1. Isolatie, Primary Cultuur Voorbereiding en Immunokleuring van Bovine CECs
- Verwerven van vers vlees van runderen ogen van een lokale slachthuis.
- Desinfecteren ogen in een 10% w / v povidon-joodoplossing gedurende 3 min. Wassen met zoutoplossing (PBS) oplossing fosfaatgebufferde.
- Oogst de corneale knoop met een scalpel en schaar onder steriele omstandigheden. Verwijder het membraan van Descemet met een tang onder een stereomicroscoop (merk op dat in deze studie werden runderen ogen enucleated door plaatselijk slachthuis, dus de eerste studie procedure desinfectie van de preenucleated ogen in het laboratorium).
- Incubeer de membraan van Descemet in 1 ml trypsin bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Verzamel de runder LME door centrifugatie bij 112 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in 1 ml aangevuld hormonale epitheliale medium (SHEM) die gelijke hoeveelheden van HEPES-gebufferde Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium en Ham's F12 medium, aangevuld met 5% foetaal runderserum, 0,5% dimethylsulfoxide, 2 ng / ml humaan epidermale groeifactor, 5 mg / ml insuline, 5 mg / ml transferrine, 5 ng / ml seleen, 1 nmol / l choleratoxine, 50 mg / ml gentamycine en 1,25 mg / ml amfotericine B.
- Zaad de cellen (ongeveer 1 x 10 5 cellen per oog) in een 6 cm schotel. Cultuur hen in de SHEM. Incubeer de schotel bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Verander het kweekmedium om de 3 dagen.
- Wanneer de cellen samenvloeiing bereiken, wassen in PBS en incubeer ze in 1 ml trypsine bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Verzamelen door centrifugatie bij 112 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml van de SHEM.
- Tel de cellen in een hemocytometer. Zaad de cellen op dekglaasjes bij een dichtheid van 1 x 10 4 per putje in een 24-well plaat, en de cellen te kweken in de SHEM. Voor het onderzoeken van de EnMT-onderdrukkende effect van marimastat, incubeer de cellen in SHEM met 10 uM van marimastat toegevoegd aan het kweekmedium, en verander het kweekmedium om de 3 dagen.
- Fixeer de cellen op een aangegeven tijdstip met 250 ui 4% paraformaldehyde, pH 7,4, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Permeabilize met 250 pl 0,5% Triton X-100 gedurende 5 minuten. Blok met 10% runderserum albumine gedurende 30 minuten.
- Incubeer de cellen met primaire antilichamen tegenover actieve beta-catenine (ABC), slak en naaktslak nacht bij 4 ° C. De verdunning van de primaire antilichamen gebruikte 1: 200. De antilichamen werden verdund in antilichaam verdunningsmiddel bestaande uit 10 mM PBS, 1% w / v runderserumalbumine en 0,09% w / v natriumazide.
- Was de cellen tweemaal met PBS gedurende 15 min, en incubeer dem met Alexa Fluor-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 100 in antilichaamverdunningsmiddel) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Tegenkleuring de celkern door het bedekken van de cellen met 2 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, was de cellen tweemaal met PBS gedurende 15 minuten, en zet deze met anti-fading bevestigingsoplossing.
- Verkrijgen immunofluorescentie beelden op golflengten van 405 en 488 nm met behulp van een laser scanning confocale microscoop met 20x objectiefvergroting.
2. Rat hoornvliesendotheel Cryoinjury Model en intracamerale Injection
- Verdoven 12 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten met intramusculaire injecties van 2% xylazine (5,6 mg / kg) en tiletamine plus zolazepam (18 mg / kg). Knijp voorzichtig in de huid van de dieren om de juiste verdoving in de afwezigheid van de huid spiertrekkingen bevestigen.
- Inboezemen een daling van 0,5% proparacaïne hydrochloride aan het rechter oog van elke rat om pijn aan de ogen en de knipperreflex minimaliseren. inboezementetracycline zalf het linkeroog cornea voorkomen droogheid.
- Afkoelen een roestvrij stalen sonde (diameter = 3 mm) in vloeibare stikstof. Breng de roestvrij stalen sonde naar de centrale cornea van het rechteroog voor 30 sec. Vaak druppelen PBS rechts oog tijdens de procedure corneale uitdroging te voorkomen.
- Inboezemen 0,1% atropine en 0,3% gentamicinesulfaat onmiddellijk na cryoinjury en eenmaal daags oculaire pijn als gevolg van ciliaire spasmen te verlichten en om infectie te voorkomen.
- Na de procedure, blijven de ratten te verwarmen met behulp van een warmtelamp, en observeer hun herstel om de 15 min na de anesthesie totdat ze motorische controle te herwinnen. Bijkomend nemen tetracycline zalf op het rechteroog hoornvlies droog tijdens de herstelperiode voorkomen.
- Herhaal het corneale cryoinjury gedurende 3 opeenvolgende dagen.
- Voor het afgeven marimastat of bFGF in de voorste kamer van de rat ogen verdoven de ratten zoals eerder beschreven. Inboezemen één druppelvan 0,5% proparacaïne hydrochloride in het rechter oog in oog pijn en het knipperen reflex een minimum te beperken.
- Irrigeren het oogoppervlak met steriele PBS. Voer voorste kamer paracentesis onder een operatiemicroscoop door het met een 30 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit op paralimbal heldere cornea in een vlak boven en evenwijdig aan de iris.
- Draai de naald bevel op, en iets druk het hoornvlies wond om wat waterig vocht af te voeren en de intra-oculaire druk te verminderen. Injecteren 0,02 ml van het geneesmiddel intracamerally. Voorzichtig comprimeren van de naald-darmkanaal met een wattenstaafje in de loop van de naald terugtrekken.
- Fotografeer de externe oog op een aangegeven tijdstip in het kader van het operationele microscoop.
3. Het oogsten van de Rat cornea knop en Immunokleuring
- Om de ratten euthanaseren, plaats ze in een euthanasie kamer en bezielen 100% CO 2 bij een fill rate van 10-30% van de kamer volume per minuut. Handhaaf CO 2 infuus voor eenextra minuten na het ontbreken van ademhaling en vervaagde oogkleur.
- Doordringen in de rat oog op de limbus met een scherp mes. Snijd de hoornvliezen met hoornvlies een schaar langs de limbus. Strijk het hoornvlies op een dia. Maak extra radiale incisies als de hoornvliezen opkrullen.
- Bevestig de cornea met 250 ui 4% paraformaldehyde, pH 7,4, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Permeabilize met 250 pl 0,5% Triton X-100 gedurende 5 minuten, en blokkeren met 10% runderserum albumine gedurende 30 minuten.
- Incubeer de cornea met primaire antilichamen tegen ABC overnacht bij 4 ° C met een verdunning van 1: 200 in antilichaam verdunningsmiddel. Was de cornea tweemaal met PBS gedurende 15 minuten en incubeer ze met het secundaire antilichaam (1: 100 in antilichaamverdunningsmiddel) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Tegenkleuring de celkern door het bedekken van de cellen met 2 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, en was de cellen tweemaal met PBS gedurende 15 minuten.
- Monteer de hoornvliezen in anti-fading montage oplossing. obtain de immunofluorescentie beelden op golflengten van 405 en 561 nm met een laser scanning confocale microscoop bij 20X objectiefvergroting.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na de isolatie van runderen CECs, de cellen werden gekweekt in vitro. Figuur 1 toont de fasecontrastbeelden van runderen LME. De zeshoekige vorm van de cellen op confluentie aangegeven dat de cellen niet werden aangetast door corneale stromale fibroblasten gedurende celisolatie. Figuur 2 toont de immunokleuring die werd uitgevoerd met antilichamen tegen ABC, slak en slak op een aangegeven tijdstip. Naast fenotypische veranderingen in het in ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
ME-landen staan bekend om hun neiging om EnMT ondergaan tijdens cel proliferatie. Strategieën te ontwikkelen voor het onderdrukken van de EnMT werkwijze voor therapeutische doeleinden, een grondig begrip van de EnMT mechanisme noodzakelijk. We beschreven 2 modellen om EnMT, namelijk het runder CEC in vitro cultuur model en rat hoornvliesendotheel cryoinjury model te onderzoeken. Onze resultaten toonden de EnMT proces in beide modellen. Bovendien is de EnMT-onderdrukkende effect van marimastat werd opgenomen i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te verklaren.
Dankbetuigingen
We danken het personeel van de Second Core Lab, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital voor hun technische ondersteuning.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| trypsine | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s gemodificeerd Eagle-medium en Ham's F12-medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| foetaal bovien serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| menselijke epidermale groeifactor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insuline, transferrine, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicine | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amfotericine B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| boveine serumalbumine | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-actief bèta-catenine-antilichaam | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail-antilichaam | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug-antilichaam | Santa cruz | sc15391 | |
| geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaam | ThermoFisher Scientific | A-11001 | voor kleuring van ABC van boviene CEC's |
| geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaam | ThermoFisher Scientific | A-11003 | voor kleuring van ABC van rat cornea endotheel |
| geit anti-konijn IgG (H+L) secundair antilichaam | ThermoFisher Scientific | A-11008 | voor kleuring van snail en slug van boviene CEC's |
| antilichaam verdunningsmiddel | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-fenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| montagemedium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laserscanning confocal microscoop | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinair geneesmiddel |
| proparacaine hydrochloride oogdruppels | Alcon | N/A | veterinair geneesmiddel |
| 0,1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | klinisch geneesmiddel |
| 0,3% gentamicinesulfaat | Sinphar Group | N/A | klinisch geneesmiddel |
| basische fibroblastengroeifactor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | klinisch geneesmiddel |
Referenties
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
- Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
- Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
- Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
- Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
- Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
- Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
- Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
- Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
- Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
- Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
- Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095(2013).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
- Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
- Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
- Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
- Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
- Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
- Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
- Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
- Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
