Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54331

⸱

27 augustus 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor de fabricage van een opkomend driedimensionaal hepatocytencultuurplatform, het omgekeerde colloïdale kristal-scaffold, en de bijbehorende technieken om hepatocytengedrag te beoordelen. De grootte-controleerbare poriën, interconnectiviteit en de mogelijkheid om extracellulaire matrixeiwitten te binden aan het poly(ethyleenglycol) (PEG)-scaffold verbeteren de prestaties van Huh-7.5-cellen.

Samenvatting

Het vermogen om hepatocytfunctie handhaven in vitro, met het oog op het testen van cytotoxiciteit xenobiotica, bestuderen virusinfectie en ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op de lever, is een platform waarin cellen een gedegen biochemische en mechanische signalen. Recente leverweefsel technische systemen zijn driedimensionale (3D) steigers samengesteld uit natuurlijke of synthetische hydrogels gebruikt, gezien hun hoge waterretentie en hun vermogen om de mechanische stimuli die nodig zijn door de cellen. Er is toenemende interesse in de omgekeerde colloïdale kristal (ICC) scaffold is een recent; hoge ruimtelijke organisatie homotypische en heterotypische cel interacties, en cel-extracellulaire matrix (ECM) interactie mogelijk maakt. Hierin beschrijven we een protocol bij het ICC schavot te fabriceren met behulp van poly (ethyleen glycol) diacrylaat (PEGDA) en het deeltje uitspoeling methode. In het kort wordt een rooster gemaakt van microsfeer deeltjes, waarna een pre-polymer wordt toegevoegd, goed gepolymeriseerd, en de deeltjes worden vervolgens verwijderd of uitgeloogd, onder toepassing van een organisch oplosmiddel (bijvoorbeeld tetrahydrofuran). De ontbinding van het rooster resulteert in een zeer poreus schavot met gecontroleerde poriën en interconnectivities waarmee media om cellen gemakkelijker te bereiken. Deze unieke structuur stelt hoog specifiek oppervlak voor de cellen te hechten aan en eenvoudige communicatie tussen poriën, en de mogelijkheid het bekleden van de PEGDA ICC scaffold eiwitten vertoont een duidelijk effect op celprestatie. We analyseren de morfologie van de steiger en de hepatocarcinoma cel (Huh-7,5) gedrag inzake levensvatbaarheid en functie om het effect van ICC structuur en ECM coatings verkennen. Kortom, dit document geeft een gedetailleerde protocol van een nieuwe steiger die brede toepassingen in tissue engineering, met name lever tissue engineering heeft.

Inleiding

De lever is een zeer gevasculariseerde orgel met een veelheid aan functies, ontwenning van het bloed, metabolisme van xenobiotica en de productie van serumeiwitten. Leverweefsel heeft een complexe driedimensionale (3D) microstructuur, bestaande uit meerdere celtypes, galcanaliculi, sinusoïden, en zones van verschillende samenstelling en biomatrix verschillende zuurstofconcentraties. Gezien deze gedetailleerde structuur is het moeilijk om een goede lever model in vitro 1 te creëren. Er is echter een toenemende vraag naar functionele in vitro modellen hosting menselijke hepatocyten als platform voor het testen geneesmiddelentoxiciteit 2 en studeren ziekten geassocieerd met lever 3.

Huidige leverweefsel techniek platforms de complexiteit van de lever vereenvoudigd door het isoleren van één of gericht op enkele van de lever parameters, namelijk co-celkweek 4, biochemische samenstelling van de zonal microenvironments 5, stroomdynamica 6,7 en de configuratie van de biomatrix 8. Configuratie van de biomatrix kan worden onderverdeeld in parameters zoals scaffold materialen, samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM) proteïnen, matrix stijfheid en het ontwerp en constructie van de steiger. Er is een toename in tissue engineering studies met synthetische hydrogelen, met name poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogelen 9 is, krijgt de mogelijkheid om af te stemmen de hydrogel van mechanische eigenschappen, biologische en afbraaksnelheid. Ten aanzien van lever-gerelateerde onderzoek, werd het biocompatibele hydrogel aangevraagd virusinfectie studie van leverziekte 3. Als een hepatocyt platform design, hebben talrijke studies hepatocytenculturen sandwich culturen 10,11 en mobiele inkapseling gebruikt binnen een hydrogel 12,13 aan de 3D-omgeving en cel-ECM en cel-cel interactie die essentieel zijn om na te bootsen in vivo micro-omgeving zijn te verstrekken. However, deze platforms bezitten een hoge mate van controle en ruimtelijke organisatie, wat leidt tot niet-uniforme eigenschappen door de stellage 14.

De omgekeerde kristal colloïdale (ICC) 14 steiger is een zeer georganiseerde 3D ​​scaffold voor celcultuur die voor het eerst in de vroege jaren 2000 werd geïntroduceerd. unieke structuur van de steiger kan worden toegeschreven aan het eenvoudige fabricageproces onder toepassing van een colloïdaal kristal, een geordende rooster van colloïdale deeltjes met variabele diameter. In het kort, om het proces te vatten, deeltjes zijn netjes gerangschikt en gloeien met behulp van warmte om een ​​rooster te vormen. De uitloging van dit rooster door een organisch oplosmiddel, in een gepolymeriseerde hydrogel leidt tot hexagonaal gepakte bolvormige holten 15 met een groot oppervlak. Deze sterk geordende scaffold is eerder gemaakt met zowel synthetische als natuurlijke materialen, inclusief maar niet beperkt tot, poly (acrylamide) 16-21, poly (melkzuur-co-glycolzuur) 15,22-30, Poly (ethyleenglycol) 31,32, poly (2-hydroxyethylmethacrylaat) 21,33-35, 36-39 en chitosan. ICC scaffolds van non-fouling materialen vaak cellulaire sferoïden binnen de holten 14,23,40 bevorderen. Meerdere celtypen is aangetoond succesvol prolifereren, differentiëren en functie binnen deze configuratie, waaronder chondrocyten 41, beenmergstromacellen 42 en stamcellen 43,44. Hepatocyt betrekking hebben studies uitgevoerd met ICC scaffolds uit Na 2 SiO 3 en poly (acrylamide), maar geen PEG. Met eenvoudige bioconjugatie strategieën (dat wil zeggen, amine koppeling door middel van EDC / NHS), kunnen ECM eiwitten geconjugeerd PEG-gebaseerde steigers worden vervaardigd, die kan blijken te zijn meer mobiele bindingsplaatsen naar een meer in vivo-achtige omgeving en de leverfunctie te verbeteren.

In dit manuscript en de bijbehorende video, we detail de fabricage van het ICC steigergebruik poly (ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) hydrogel en een polystyreen microsfeer rooster, geoptimaliseerd voor hepatocarcinoma (Huh-7,5) cultuur. We tonen de verschillen tussen het algemeen klevend kale PEGDA ICC scaffolds en de met collageen beklede PEGDA ICC scaffold qua steiger topologie en celprestaties. Levensvatbaarheid van de cellen en functie zijn kwalitatief en kwantitatief gemeten om Huh-7.5 cel gedrag te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. ICC steiger Fabrication (figuur 1)

  1. Bereid de polystyreen (PS) roosters (diameter = 6 mm; 8-13 lagen van kralen).
    1. Om de mal te bereiden, snijd de uiteinden af ​​van 0,2 ml kook-proof microcentrifugebuizen op 40 pi-niveau. Houd u aan de bovenkant van de cut-buizen 24 x 60 mm 2 microscoop dekglas slips met waterdichte lijm.
    2. Zet de PS bolletjes (diameter = 140 pm) opgenomen in een water suspensie in een 20 ml flacon, voorzichtig pipet uit het water schorsing, en voeg 18 ml van 70% ethanol-oplossing in de flacon. Zet de bol oplossing in een ultrasoon bad geaggregeerde sferen los te maken. Herhaal deze wasstap meerdere malen om water en in water oplosbare componenten te verwijderen.
    3. Pipetteer 100 ul ethanol in de mallen.
    4. Snijd de top van een 200 ul micropipet tip van 4 mm. Pipetteer 25 ul van de bollen in de mal tweemaal met de 200 ul micropipet te komen tot eentotaalvolume van 50 pl in elke vorm.
    5. Leg de mallen op een rockende shaker op 120 rpm 's nachts.
    6. Controleer de positie van de bollen in elke vorm onder een optische microscoop. Als de bolletjes niet hexagonaal zijn gerangschikt, voeg 50 pl 70% ethanol en handmatig schudden in de longitudinale en laterale as richting naar de inrichting te corrigeren.
    7. Laat het ethanol verdampen bij kamertemperatuur (KT) gedurende twee nachten. Plaats de mal en kraal complex in een 130 ° C oven gedurende 6 uur aan de PS kralen gloeien.
  2. Het voorbereiden van kaal en-ECM-gecoate PEGDA steigers.
    1. Synthetiseren PEGDA macromeren met behulp van vastgestelde protocollen 45,46 voor acryleren lineaire PEG macromeren (M w = 4,6 kDa).
    2. Bereid 50% (w / v) oplossing PEGDA-de geïoniseerde (DI) water en laat het macromeer goed opgelost door centrifugeren bij 4713 xg tot deze volledig is opgelost.
      1. Voor ECM geconjugeerd ICC steigers, los van een extra10% (w / v) acryloyl-PEG-NHS (Mw = 3,4 kDa) in 50% PEGDA oplossing.
    3. Bereid een 20% (w / v) voorraad oplossing van 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiofenon (PI) in 70% ethanol.
    4. Voeg 50 ul van 20% (w / v) PI voorraadoplossing per 1 ml 50% (w / v) van PEGDA. Pas de benodigde hoeveelheid PI voorraadoplossing basis van het molecuulgewicht van PEGDA.
    5. Vortex het mengsel in de centrifugebuis gedurende 1 minuut tot een homogene oplossing te komen.
    6. Schil de mallen uit de glasplaatje (uit stap 1.1.7), verwijder de lijm uit de mallen, duw de roosters voorzichtig met een spatel en leg elk van hen in een 1,5 ml buis. Pipetteer 300 ul van de oplossing PEGDA en centrifugeer bij 845 xg gedurende 5 minuten om een ​​goede oplossing PEGDA infiltratie in het rooster mogelijk.
    7. Verwijder het rooster van de buis met behulp van een pincet en voorzichtig dep droog overtollige PEGDA oplossing op handschoenen. Plaats het rooster op een paraffine-film bedekt glas met de platte cirname op naar boven.
    8. Expose de PEGDA oplossing geïnfiltreerd steiger tot 365 nm ultraviolet (UV) licht (10,84 mW / cm2) gedurende 5 minuten met behulp van een UV-spot lamp.
    9. Plaats PEGDA-gepolymeriseerd kristal roosters in nieuwe flesjes (ongeveer 10 roosters per flacon) en voeg 20 ml tetrahydrofuran (THF). Schud de flesjes op een orbitale schudinrichting bij 300 rpm. Veranderen THF minstens 3 maal met een interval van 1-2 uur.
      Opmerking: niet volledig verwijderen van THF bij het veranderen van THF om luchtbellen voorkomen dat de steigers, waardoor onvolledige verwijdering van HS kan veroorzaken. Laat voldoende oplossing voor de roosters te dekken en voeg nieuwe THF.
      Opgelet: THF is giftig. Draag handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Voorkom inademing door opererend onder de zuurkast.
    10. Controleer of PS bollen worden opgelost door de invoering van water in de gebruikte THF-oplossing en het observeren van de oplossing kleur. Herhaal stap 1.2.9, indien de PS bollen zijn niet goed opgelost.
      Opmerking: De kleur van de oplossing verandert inwit of er nog resterende PS bollen.
  3. Maak de steigers in de bioveiligheid kast (BSC).
    1. De steigers steriliseren Bereid een 50 ml centrifugebuis met 2 ml 70% ethanol per scaffold en plaats de steigers in de buis met een spatel. Laat de steigers te laten onderdompelen in ethanol gedurende 1 uur. Vanaf deze stap voorwaarts, over tot alle procedures in de BSC.
    2. Giet het ethanol om te vervangen met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (2 ml per skelet) en gecentrifugeerd bij 524 x g gedurende 3 min om luchtbellen te verwijderen. Hou het in de koelkast en verander de PBS een paar keer met een interval van 1-2 uur.
      1. Voor collageen type I bekleed steigers Bereid een 50 ml centrifugebuis die collageen type 1 voorraadoplossing (1 ml per scaffold), breng de gesteriliseerde scaffolds om deze buis met een spatel en centrifugeer bij 524 xg gedurende 3 min. Schud de steigers bij 400 rpm op een ronddraaiende schudder gedurende 30 min en houdt de buis in de koelkasteof 's nachts.
      2. Was de steigers met PBS twee keer voor gebruik door onderdompeling de steigers in verse PBS en vervolgens opzuigen van de PBS.
        Opmerking: andere ECM eiwitten kunnen ook worden gebruikt in plaats van collageen type I omdat de NHS chemie een aminegroep op de binding (figuur 2) te vormen vereist.

figure-protocol-1
Figuur 1. Overzicht van de ICC fabricage. PEG-gebaseerde ICC steigers worden vervaardigd met behulp van microfabricage technieken met en zonder ECM-functionalisering. ECM-gecoate ICC scaffolds vereisen PEG-NHS en PEGDA (zoals aangegeven in figuur 2). De PS rooster heeft een diameter van 6 mm en een hoogte van 8-13 kraal lagen. PS, polystyreen; PEGDA, poly (ethyleenglycol) diacrylaat; UV ultraviolet; THF, tetrahydrofuran; ECM, extracellulaire matrix. Dit cijfer is gewijzigd en worden met toestemming van Wiley 47. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. ICC Structuur karakterisering

  1. ICC structuur analyseren dan niet geconjugeerde eiwitten, gebruikt scanning elektronenmicroscopie (SEM) 47.
    1. Bevestig de steigers met 4% paraformaldehyde (PFA), serieel dehydrateren ze in 25, 50, 75, 95 en 100% ethanol oplossingen, en bewaar ze bij -80 ° C totdat de ethanol volledig verdampt.
    2. Droge monsters in een vriesdroger gedurende 48 uur.
    3. Bevestig het monster op monsterhouder met behulp van carbon tape en plaats in een sputter coater.
    4. Na de automatische stofzuigen, jas met een Pt-film van 10 nm dik door sputteren gedurende 60 seconden bij 20 mA.
    5. Afbeelding ICC draagstructuren via SEM bij een spanning van 5 kV (figuur 3A, figuur 4A).
  2. De poriën meten eninterconnectie diameter holten analyseren SEM microfoto behulp beeldanalysesoftware 48 (bijvoorbeeld ImageJ Figuur 3B, C).
  3. De geconjugeerde collageen de scaffold zonder cellen, fluorescent label visualiseren collageen via antilichamen (1: 100) tegen collageen type I en beeld met confocale laser scanning microscopie 47 (CLSM Figuur 4B).

3. Huh-7.5 Cell Cultuur en zaaien

  1. Cultuur Huh-7,5-cellen in een zaaidichtheid van 2-2,5 x 10 6 cellen / ml in 100 mm celcultuurschalen met 10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine (groeimedium) bij 37 ° C en 5% CO 2. Verandering de media om de drie dagen in de BSC tot zij 75-80% confluentie hebben bereikt.
  2. Bereid de steigers voor cel zaaien in de BSC.
    1. Plaats het scaffjarigen in een 24-wells plaat met het platte vlak naar boven.
    2. Naar het schavot, pipet was 2 ml PBS aan elk putje met een steiger. Zuig het PBS en pipet 2 ml vers PBS in elk putje.
    3. Zuig het PBS en pipet 2 ml groeimedium (zie stap 3.1) en laat gedurende 30 min. Zuig het medium en laat het schavot drogen 1 uur.
  3. Maak confluent Huh-7.5-cellen (uit stap 3.1) van de cultuur plaat in de BSC met behulp van de trypsine spijsvertering methode.
    1. Aspireren media van de plaat, voeg 4 ml PBS om hechtende cellen te wassen en vervolgens te zuigen PBS.
    2. Pipetteer 0,75-1 ml 0,25% trypsine en plaats in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 3 minuten.
    3. Verwijder plaat uit incubator en pipet 5 ml media om de trypsine reactie te stoppen. Pipette media, vrijstaande cellen, en trypsine mengsel in een 15 ml buis.
    4. Centrifugeer bij 524 xg gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml media.
  4. Aantal cellen met een hemocytometer en bereken het volume van de celsuspensie die cellen op doelnummer N 0 bevat, per 25 pl (voor standaard experiment N 0 is 1 x 10 6 cellen).
    Het volume van celsuspensie = (beoogde aantal cellen) / (concentratie van de celsuspensie)
  5. Langzaam Pipetteer 25 ul celsuspensie (die N 0 cellen) direct op elkaar steiger (uit stap 3.1.4). Plaats de 24-wells plaat in de incubator.
  6. Na 12 uur en spoel de steigers zorgvuldig met behulp van een spatel in een nieuwe 24-well plaat en pipetteer 2 ml medium in elk putje. Plaats de 24-wells plaat in de incubator.
  7. Wijzig de media om de 3 dagen of afhankelijk van wanneer media wordt verzameld voor eiwit uitscheiding analyse (zie stap 5.1).

4. levensvatbaarheid van de cellen

  1. Om kwalitatief analyseren levensvatbaarheid van de cellen, gebruik fluorescente live / dead kleuringskits aan de cellen en de afbeelding met behulp van C vlekLSM.
    1. Na kit instructie, een oplossing met 4 uM calceïne AM en 8 uM ethidium homo-dimeer-1 in de media (zie stap 3.1.3).
      Opmerking: optimaliseren afhankelijk van het aantal cellen. Gebruik het dubbele van de hoeveelheid reagens, als cellen zich vermenigvuldigen en dubbele van het aantal (ongeveer 2 miljoen).
    2. In de BSC, aspiraat media in elk putje met een steiger (stap 3,7) en Pipetteer 500 ul van de bereide oplossing. Incubeer monsters in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
    3. Bedek de platen in folie om de monsters te beschermen tegen het licht bij het verwijderen van de plaat uit de incubator. Afbeelding monsters met behulp van CLSM49.
  2. Voor een kwantitatieve beoordeling cellevensvatbaarheid meten enzymatische activiteit (in levende cellen) via colorimetrische assays 50 (dat wil zeggen 2- (2-methoxy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) 2H-tetrazolium (monosodium-zout reagens)).
    1. Maak een standaard curve voor het Internationaal Strafhof platform (dat wil zeggen, een grafiek van de absorptie (OD) versus bepaalde cel nummer).
      Opmerking: Cell zaaien is niet 100% efficiënt in vergelijking met andere platforms, aangezien cellen door de holten van steigers kunnen passen.
      1. Bepaal de cel enten aantallen, N 0 die wordt gebruikt om de standaardkromme te maken.
        Opmerking: Kies een bereik dat het aantal cellen die worden geraamd in het experiment omvat. Bijvoorbeeld, als de eerste cel nummer 5 x 10 5 cellen en er is een benadering ~ 3-voudige toename van de laatste dag van het experiment, kies 2,5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, en 2 x 10 6 cellen N 0.
      2. Voer cel zaaien in het ICC steigers (één N 0 per schavot met zaaien volume van 25 pl), zoals beschreven in de stappen 3,1-3,6.
      3. Na 6 uur, breng de stellingen naar een andere 24-well plaat vormt. Selecteer een tijd die cel hechting mogelijk maakt, maar niet proliferatie.
      4. Voer cel tellen op de overgedragen ICC schavot.
        1. Verdun 10x monosodium-zout reagens (MSR) oplossing voor 1x met media in de BSC en pipet 500 ul 1x MSR-oplossing in elk putje met een steiger. Incubeer de 24-well plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur.
        2. Uit elk putje, overdracht 100 pl in een 96-wells plaat ook. Als blanco, pipet 100 ul vers 1x mononatriumzout zout reagens oplossing in verschillende putjes van de 96-well plaat. Handmatig verwijderen van eventuele luchtbellen aanwezige met een droge pipet tip en hebben betrekking op de 96-well plaat in folie om het te beschermen tegen licht.
        3. Meet OD bij λ = 450 nm lezing met een spectrofotometer. Trek de lege OD van andere waarden naar de juiste OD 51 te vinden.
      5. Tel het aantal cellen (N L) nog in de put na het overbrengen van het skelet (stap 4.2.1.3) met een hemocytometer.
        Opmerking: gebruik 300 ul van trypsine aan de cellen trypsinize.
      6. Bereken het werkelijke aantal cellen N A.
        eigenlijke =aanvankelijke - links op goed
        N A = N 0 N L
      7. Maak standaard curve door het uitzetten van OD verkregen bij Stap 4.2.1.4.3 vs. werkelijke aantal cellen (N A) en dit gebruiken om het aantal cellen in de experimenten te schatten.
        Opmerking: Maak een nieuw standaard curve eventueel ICC parameters (dat wil zeggen, porogeen grootte, de afmetingen van de steiger, ECM-eiwit, enz.) Worden gewijzigd.

5. Cell Functie

  1. Analyseer eiwitsecretie door Huh-7,5-cellen (dat wil zeggen, albumine, ureum) uit de verzamelde media (van stap 3,7) door enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA) 52.
    Opmerking: Verdun de media, afhankelijk van het aantal cellen gezaaid en de hoeveelheid media verzameld. Voor 5 x 10 5 cellen gezaaid in ICC, gebruik dan een ~ 1: 25-verhouding, vóór de invoering van het aan het antilichaam-voorbeklede putten.
  2. Kwalitatief analyseren celfunctie, immunostain specifieke intracellulaire proteïnen(Dat wil zeggen, albumine), enzymen (bijv CYP450), vlek structurele componenten (bijv cellulaire actine) en de kernen en het beeld met CLSM 49.
    1. Aspireren media (uit stap 3.7) en de pipet 2 ml PBS aan de cel beladen ICC steigers te wassen.
    2. Pipetteer 1 ml van 4% PFA en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur fixeren.
    3. Was 3x met 2 ml PBS.
    4. Permeabel membraan door incuberen van de steigers in 1 ml 0,1% 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol (surfactant) gedurende 30 min.
    5. Wash 3x met 2 ml PBS om eventuele lekken eiwitten te verwijderen.
    6. Pipetteer 500 ul 1% runderserumalbumine (BSA) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur blokkeren aspecifieke binding.
    7. Bereid verdunde primaire antilichaam (dat wil zeggen, albumine, CYP450) oplossing.
      1. Pipetteer 500 ul van 1% BSA oplossing in een 15 ml buis en voeg 4,5 ml van 0,1% oppervlakteactieve tot een totaal van 5 ml 0,1% BSA-oplossing te bereiden.
      2. Pipetteer 98 ul van 0,1% BSA oplossing in een 200 ui microcentrifugebuis en 2 pl van het primaire antilichaam aan een 1:50 produceren (primair antilichaam: 0,1% BSA) primaire antilichaamoplossing.
    8. Pipetteer 40 ul van de primaire antilichaamoplossing op het schavot en bedekken van het substraat met paraffine film. Wikkel de 24 wells plaat met aluminiumfolie en bewaar de schaal bij 4 ° C gedurende de nacht.
    9. Wash 3x met 2 ml PBS en schud de plaat voorzichtig in tussen wassen.
    10. Bereid verdund gebiotinyleerd secundair antilichaam (dat wil zeggen, anti-muis antilichaam) stock oplossing.
      1. 100 (secundair antilichaam:: 0,1% BSA) secundair antilichaam oplossing pipet 198 ul 0,1% BSA-oplossing en 2 pl tweede antilichaam om een ​​1 te produceren.
      2. Bereid een 0,1% voorraadoplossing van rhodamine of fluoresceïne gemerkt phalloidin (de cellulaire actine filamenten vlekken) in 0,1% BSA-oplossing.
      3. Pipetteer 25 ul van elke oplossing in een buis en meng well.
    11. Pipetteer 50 ul van het secundaire antilichaam voorraadoplossing op het schavot. Bedek het schavot met paraffine film, wikkel de schaal met aluminiumfolie en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    12. Was 3x met 2 ml PBS.
    13. Pipetteer 200 ul van 0,2% 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; kern kleuring) oplossing op de steiger en laten KT 2-3 min. Bedek de plaat met aluminiumfolie.
    14. 2x wassen met 2 ml PBS.
    15. Met behulp van een druppelaar, plaats een druppel van de montage van de media op het substraat.
    16. Voorzichtig zet de steiger op een glasplaatje en beeld met behulp van CLSM 47.
  3. Beoordeel de genexpressie door Real-time PCR (qPCR). Gebruik standaard kits voor reverse transcriptase PCR (RT-PCR) 53 en qPCR 54 volgens instructies van de fabrikant. Pak het RNA uit de cellen, zoals hieronder beschreven.
    1. Plaats de steiger (uit stap 3.7) in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    2. Pipetteer 1 ml van een RNA extractieoplossing in de buis en bewaar in een sonicator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Pipet 200 ul van chloroform in elk microcentrifugebuis en schud de buis krachtig in de hand voor 15-20 sec. Houd de buizen bij kamertemperatuur ~ 3 min tot de fasen gescheiden.
    4. Centrifugeer het monster bij 13.000 xg, 4 ° C gedurende 15 minuten en verwijder de buizen zorgvuldig, zodat fasen gaan niet samen.
    5. pipet zorgvuldig 500-600 pl van de bovenste waterfase van de eerste buis in een tweede microcentrifugebuis.
    6. Voeg een gelijk volume (500-600 ul) isopropanol deze tweede buis.
    7. Keer de buis 3-5 keer en laat de buis staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    8. Centrifugeer het monster bij 13.000 xg, 4 ° C gedurende 15 minuten.
      1. Als een pellet niet zichtbaar op de bodem van de buis, opnieuw centrifugeren gedurende 5 min.
        Opmerking: Als er nog steeds geen zichtbare pellet, kan het bedrag van RNA onvoldoende zijn.
    9. iknvert buizen met de kap open voor supernatant en pipet gooi in 1 ml 70% ethanol verdund in DEPC water in de buis.
    10. Iets vortex de buis, zodat de pellet los van de wand van de buis en laat vervolgens de buis aan de lucht drogen.
    11. Voeg 50 ul van DPEC water om de pellet te resuspenderen.
    12. Blijf pipetteren totdat de pellet oplost.
    13. Blijf gedurende 10 minuten bij 55 ° C om het dubbelstrengs RNA denatureren in enkelstrengs RNA.
    14. Licht trommel vingers op de onderste buis en centrifugeer de buizen kort (7500 xg, 4 min, 4 ° C).
    15. Houd de buizen in ijs tot het uitvoeren van reverse transcriptase 55 en real-time PCR zoals beschreven 56.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De representatieve resultaten voor de structurele karakterisering van het ICC steiger en de vergelijking van de werkzaamheid elk ICC schavot staat in het kweken van hepatocyten worden getoond en toegelicht. De ICC scaffold gebruikte omstandigheden zijn voorspelbaar collageen bekledingen van 0 ug / ml (Blank), 20 ug / ml (Collageen 20), 200 ug / ml (Collageen 200) en 400 ug / ml (Collageen 400) en de eerste huh-7.5 cel zaaien nummer is 1x10 6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Scaffolds evolueren snel alle fysische en biochemische signalen nodig te regenereren, handhaven of te herstellen weefsel ter uitvoering van orgaanvervanging, bestuderen ziekte, de ontwikkeling van geneesmiddelen en vele anderen 57 verschaffen. In leverweefsel engineering primaire humane hepatocyten verliezen snel hun stofwisseling eenmaal geïsoleerd uit het lichaam, waardoor een grote behoefte aan scaffolds en ontwikkeling platforms om de leverfunctie te handhaven. De huidige in vitro hepatocyt cultu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs willen steun erkennen van een National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) en Competitive Research Programme (NRF-CRP10-2012-07).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 ml PCR tubeAxygen ScientificPCR-02D-CBoil-proof
Gorilla GlueGorilla Glue, Inc.Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slidesVWR631-1575Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheresFisher ScientificTSS#4314ADiameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
EthanolMerck1.00983.1011absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic BathElmaS10HEquiment
FurnaceNaberthermN7/HEquipment
200 µl pipette tipAxygen ScientificT-210-Y-R-S
Rocking shakerVWR444-0142
Polyethylene Glycol (PEG)Merck1.09727.0100Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
CentrifugeBeckman Coulter392932Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl ValerateLaysan BioACRL-PEG-SVA-3400-1gMw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenoneSigma Aldrich410896
VortexVWR58816-123Equipment
MicrocentrifugeEppendorf5404 000.413
Paraffin FilmParafilm M #PM996Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlightBlaze Technology 120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF)Merck107025
Orbital shakerHeidolph543-123120-00-5
Collagen Type ISigma AldrichC3867-1VLFrom rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco20012-02716% W/V AQ. 10 x 10 ml
ParaformaldehydeVWR43368.9MEquipment
Freezone 4.5 freeze drierLabconco7750020Equipment
Sputter coaterJeol Ltd.JFC-1600Equipment
Scanning Electron MicroscopeJeol Ltd.JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type IAbcamab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) Bio-Rev PTE LTD3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		Lonza12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS)GibcoA15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S)Life Tchnologies15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishesSigma AldrichCLS430591
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorsThermofisher Scientific371
Hausser Bright-Line Phase HemacytometerThermofisher Scientific02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cellsLife TechnologiesL3224 
CCK-8 AssayDojindo LaboratoriesCK04-11Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader Tecan
Albumin Human ELISA kitAbcamab108788
Triton X-100Bio-Rad#1610407
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin)Santa Cruz Biotechnologysc-53850; sc-271605
DAPILife TechnologiesD3571
Alexa Fluor 555 labeled PhalloidinLife TechnologiesA34055
TrizolLife Technologies15596-026
ChloroformVWR22706.326
IsopropanolFisher Scientific67-63-0
DPEC waterThermofisher ScientificAM9916
Nanodrop 2000c SpectrophotometerThermofisher ScientificND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories1708840
SYBR select Master Mix for CFXLife Technology4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal CyclerBio Rad LaboratoriesSOFT-CFX-31-PATCH 

Referenties

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Polyethyleenglycol-steunstructuurmethode van partikeluitloginghepatocytenfunctiefabricage van steunstructurencoating van de extracellulaire matrixscanning-elektronenmicroscopieHuh-7.5-cellentetrahydrofuran-uitloging
Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.